En introduktion till Worm Lab: från Odling Worms till Mutagenesis

Summary

Screening för mutanter med fenotypisk defekter är en enkel metod för att identifiera gener som fungerar i en viss biologisk process. I denna artikel beskriver vi hur kultur fritt levande maskar (t ex

Abstract

Detta protokoll beskriver förfaranden för att upprätthålla nematoder i laboratoriet och hur man mutagenize dem med två alternativa metoder: etyl metan sulfonat (EMS) och 4, 5 ', 8-trimethylpsoralen kombination med ultraviolett ljus (TMP / UV). Nematoder är kraftfulla biologiska system för genetik studier på grund av deras enkla kropp plan och parning, som består av självbefruktande hermafroditer och hannar som kan generera hundratals avkommor per djur. Nematoder hålls i agarplattor innehållande en gräsmatta av bakterier och kan lätt överföras från en tallrik till en annan med en pick. EMS är ett alkylerande medel används ofta för att framkalla punktmutationer och mindre deletioner, medan TMP / UV främst inducerar strykningar. Beroende på arter av nematoder som används, kommer halterna av EMS och TMP måste optimeras. Att isolera recessiva mutationer i nematoden Pristionchus pacificus var djur av F2-generationen visuellt screenas för fenotyper. För att illustrera dessa metoder, mutagenized vi maskar och letade efter Icke samordnade (UNC), Dumpy (Dpy) och Transformator (TRA) mutanter.

Protocol

Del 1: Förbereda rundmasken tillväxt media (NGM) Petri plattor

Experimentell nematoder såsom C. elegans och P. pacificus är oftast odlas i laboratorium på 6 cm Petri plattor innehåller Medium Nematode Tillväxt (NGM) ^1. Maskar hålls vid 20 ° C, men kan inkuberas vid olika temperaturer (mellan 4 ° C - 25 ° C), beroende på nematoden arter och experimentell design. För att förbereda tallrikar med NGM, standard sterila tekniker måste användas för att förhindra svamp-och bakterieangrepp. Här följer protokollet att förbereda NGM plattor:

1. Väg 15 g agar, 2,4 g NaCl, 2 g Trypton och 2,72 g KH ₂ PO ₄ i 2 L-kolv, göra volym upp till 1 liter med vatten, autoklav och låt det svalna till 60 ° C i ett vattenbad.
2. Tillsätt 0,8 ml vardera av 1 M CaCl _2, kolesterol (5 mg / ml i etanol) och 1 M MgSO _4. För att förhindra svamp-och bakterieangrepp, 1 ml streptomycin (100 mg / ml) och 1 ml nystatin (10 mg / ml) kan läggas till varje liter medium.
3. Med hjälp av en Unispense maskin och bibehålla sterila förhållanden, häll media till önskat plattorna. Plattorna ska fyllas till ca 2 / ^{3: e} full. En standard 60 mm plåt kräver ca 10 ml av media. Flytta inte plattorna tills agarn är helt gelified, annars blir det en ojämn yta av agar, vilket gör det svårt att fokusera maskar på stereomikroskop.
4. När torkat kan plattorna seedas omedelbart eller lagras vid 4 ° C tills seeding med bakterier.

Del 2: Förbereda OP50 bakterier och sådd NGM Petri plattor

P. pacificus är odlas i laboratoriet genom att mata på E.coli OP50 stammen. OP50 har en begränsad tillväxt på NGM tallrikar, så att de bildar en tunn gräsmatta som underlättar visualisering av maskar ^1. För att växa en kultur av OP50, använd LB-buljong:

1. Tillsätt 5 g bactotryptone, 2,5 g jästextrakt och 2,5 g NaCl till en 500 ml skruvlock flaska, fyll på vatten till 500 ml med destillerat vatten och autoklav.
2. Inokulera buljongen med en enda koloni av OP50 från kulturen plattan under sterila förhållanden och låta det växa över natten vid 37 ° C.
3. LB-OP50 är redo att användas och kan lagras vid 4 ° C under flera månader om sterilitet bibehålls. När plattorna måste vara seedade, häll en liten mängd av buljongen i en liten steril bägare och detta kommer att bidra till att förhindra förorening av beståndet kulturen.
4. Till utsäde tallrikar, avstå 100-120 ìl av OP50 på 60 mm diameter NGM Petri tallriken och snurra för att sprida den.
5. Inkubera dessa seedade plattorna vid rumstemperatur för gräsmattan att växa. Dessa seedade plattor kan nu lagras vid 4 ° C i upp till 3 veckor. Lagra dem i ett inverterat läge hjälper till att förhindra en snabb torkning.

Del 3: Att göra en hacka

I detta avsnitt beskriver vi hur man gör ett val för maskar. Pick används för överföring av maskar från en plats till en annan. Den plockar är tillverkad av 30 gauge 90% platina 10% iridium tråd, även om vissa forskare kanske föredrar något annorlunda metall kompositioner:

1. Skär ca 3-4 cm av tråd, plats 0,5 cm av den inuti spetsen på en pasteurpipett (vars spets bröts till en mindre längd) och sedan försegla den i glaset över en bunsenbrännare. Längden på kabeln sticker ut från glaset är ca 3-3,5 cm, men kan variera beroende på individuella preferenser.
2. Platta slutet av tråd som sticker ut med hjälp av en hammare eller tång. Sedan böjer tillplattade delen uppåt för att bilda ett scoop.
3. Utjämna de skarpa kanterna på plocka med ett sandpapper för att förhindra att skada masken eller agar.

Del 4: Plocka maskar

1. Att plocka maskar, sterilisera platinatråd på en låga och dra den tillplattade toppen av plocka längs bakteriella gräsmattan att bestryka spetsen med tjocka klibbiga bakterier, se till att inte punktera eller skada agarytan.
2. Med hjälp av stereomikroskop, mycket lätt borsta klibbig spets mot masken / maskar som ska plockas fram till masken pinnar vidare till bakterier på pick.
3. När masken är på toppen av pick, överföra det direkt till den nya plattan genom att röra eller glider spetsen på pick mot bakteriella gräsmattan av den nya plattan, och masken ska krypa av. Man måste vara försiktig att inte skada ytan av agar på tallriken annars maskarna krypa in i hålen gör det svårt att hämta dem. Om masken kvar på pick för länge, kan det uttorka.

Del 5: EMS mutagenes

Ethyl metan sulfonat (EMS) inducerar ett brett spektrum av mutationer i i arvsmassan 2. Mutanter kan identifieras med defekter som äggläggningen, muskel-defektS, könsbestämning, Dauer bildning, beteende och gonad bildas. Protokollet för EMS mutagenes liknar den som beskrivits för C. elegans ^1.

1. Förbered 500 ml (eller mer) av 1N NaOH.
2. Ta 4-5, 6 cm i diameter Petri tallrikar fulla av maskar, som innehåller ett par hundra maskar vid den tredje larver unga (J3) stadium och tvätta maskar av med 2-3 ml sterilt M9 per platta.
3. Samla alla maskar i en steril engångs 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 1500 xgi 5-7 minuter eller tills maskar bilda en pellet.
4. Aspirera vätskan och använd 2 ml M9 att åter skjuta upp maskar. Tillsätt 20 l EMS till ett rör som innehåller 2 ml M9 och skaka för att lösa det. Tillsätt sedan detta EMS lösning på 2 ml masken fjädring och snurra försiktigt. Den slutliga koncentrationen av EMS kommer att bli 47 mm. Varning: EMS är en mycket stark mutagen och bör hanteras i dragskåp. Allt material (handskar, pipetter, tips) som kommer i kontakt med denna mutagena bör behandlas med 1N NaOH till inaktiva EMS. Använd dubbla handskar under hela EMS mutagenes förfarande. Kassera avfall enligt din institutionens riktlinjer.
5. Placera centrifugrör och täck locket med parafilm, placera den horisontellt i dragskåp och låt maskarna inkubera i 3,5 timmar. Röret kan också placeras på en låg hastighet rocker.
6. Vänd röret och täcker locket med parafilm, plats i vertikalt läge och inkubera tills maskarna diskhon.
7. Aspirera supernatanten och kassera den i en bägare / flaska som innehåller 1N NaOH. Detta kommer att inaktivera EMS.
8. Tillsätt 5 ml M9 till maskar, vänd röret 25-30 gånger för att tvätta maskar, centrifugera vid 1500 xg under 5-7 minuter eller tills maskar bilda en pellet. Aspirera supernatanten och släng in i 1N NaOH bägaren.
9. Upprepa tvätt minst 3 gånger.
10. Efter den sista tvätten, återsuspendera masken pelleten i minimal (~ 500 l) av M9 och pipett dem ut på NGM plattor innehåller en gräsmatta i OP50 bakterier. I detta läge behöver du inte längre arbeta inom den kemiska huva.
11. Låt vätskan torka i några minuter och sedan välja och överföra friska letar J4 larver till frisk seedade tallrikar. Kassera den ursprungliga plattan enligt din institutionens farligt avfall riktlinjer.
12. Låt mutagenized maskarna själv gödsla. Med hjälp av en stereomikroskop, skärm F2-generationen fenotyper för recessiva mutanter av intresse.

Del 6: Psoralen mutagenes

I detta avsnitt beskriver vi proceduren för mutagenes använda TMP i samband med lång våglängd ultraviolett (UV). TMP / UV-metoden för mutagenes är allmänt används för att framkalla deletionsmutationer inom genomet ^3.

1. Samla maskar från 4-5, 6 Petri cm i diameter plattorna i en 15 ml centrifugrör som beskrivs i föregående procedur.
2. Tillsätt 10 ml M9, vända 20 gånger för att tvätta maskar och centrifugera vid 1500 xg under 5 minuter. Kasta bort vätskefasen och tvätta för totalt 3 gånger. Aspirera vätskan och återsuspendera maskarna i ungefär 10 gånger sin volym av M9 som innehåller 30 mikrogram / ml av TMP. Pipettera 20 ìl TMP (3 mg / ml) i 2 ml M9. Liksom EMS är TMP en potent cancerframkallande och måste hanteras med vederbörlig säkerhetsåtgärder. För att förhindra från potentiella risken för UV-ljus riktigt öga bär bör användas. Den förbrukningsartiklar måste kasseras i korrekt biologiskt väskor.
3. Inkubera röret i mörker i 15 minuter vid rumstemperatur på en låg hastighet rocker (40 UPM). Ställ den täckta röret vertikalt i 10 minuter för att låta alla maskar diskhon.
4. Ta bort maskar från botten av röret med en pasteurpipett och överföra dem till en unseeded NGM tallrik. Kasta bort vätskefasen efter din institutions farliga kemiska riktlinjer.
5. Håll plattan i mörker tills överflödigt TMP absorberas i plattan.
6. Med hjälp av en UV-intensitet meter, ange avståndet mellan långvågig UV-källa och plattan så att intensiteten på plattan är 500 μW / cm ^{2 4.} Ta bort aluminium locket och locket och locket och avslöja plattan innehåller TMP behandlade maskar till långvågig UV-strålning i 50 sekunder.
7. Täck över och låt maskarna i mörker i 5 timmar i rumstemperatur.
8. Plocka och överföra friska letar J4 larver till frisk seedade tallrikar. Kassera den ursprungliga plattan efter din institutions farliga kemiska riktlinjer.
9. Med hjälp av en stereomikroskop, skärm F2-generationen fenotyper för mutationen av intresse.

Del 7: representativa resultat

Några av P. pacificus mutant fenotyper härrör från mutagenes (antingen genom EMS eller TMP / UV) visas i Figur 1. Varje mutant har en karakteristisk fenotyp som är lätt att skilja från den vilda typen djur. Från maskarsom behandlades med mutagena, 30 J3/J4 larver från föräldra generationen (P0) placerades i separata plattor och tillåtas att lägga ägg, som är F1-generationen. Från plattorna som visade friska F1-avkomma, totalt 1000 F1-plan överförs till enskilda tallrikar och F2-avkomman visades för fenotyper. Djur med Dumpy ^5,6, okoordinerat ⁶ och Transformer ⁷ fenotyper hittades.

Figur 1. Pristionchus pacificus vildtyp och muterade djur. A. wt hermafrodit B. WT manliga C. dpy mutant D. UNC mutant E. tra mutant. Topp två paneler som visar vild typ hermafrodit (vänster) och hane (höger) djur att jämföra med de olika mutanter i de återstående panelerna.

Discussion

Mutagenes är en allmänt används teknik för genetiska studier i olika experimentella modeller organismer. Mutagenes experiment används ofta för att identifiera funktionen av en gen ^2. Den mutagenes förfaranden som beskrivs här kan användas inte bara för P. pacificus, men också för C. elegans och andra närbesläktade arter nematoder. Här beskriver vi två metoder, EMS och TMP / UV-mutagenes.

EMS är en kemikalie som inducerar punktmutationer eller små deletioner i hela genomet ^3,8. Psoralen mutagenes (TMP / UV) inducerar främst deletionsmutationer i DNA på grund av eventuella brott som framkallas av UV-ljuset. Strykningen fragment är vanligtvis i intervallet 0,10 till 15 KB i längd ^3.

Vi screenas för fenotyper som är relativt vanligt att hitta. På en skärm med hjälp av EMS, för varje 400 plåtar med F2 djur, ungefär en tallrik hade ett Dpy, UNC eller Tra. Dpy känns igen på sitt lite kortare storlek ^7, UNC för onormala rörelser ⁶ och Tra för att ha en manlig fenotyp och en XX karyotyp ^7. TMP / UV-mutagenes har en lägre frekvens av generera mutanter jämfört med ^EMS-3, men den genererar större strykningar.

För nematoder, är den sena fjärde etappen larv eller unga vuxna den mest effektiva utvecklingsstadiet för att utföra mutagenes eftersom de har det maximala antalet könsceller kärnor. Det är därför lämpligt att börja experimentera med en synkroniserad föräldrar befolkning med många fjärde larvstadiet. Ett enkelt sätt att göra synkroniserade kulturer genom att göra nya kulturer med ägg istället för vuxna maskar. I följande generation, kommer de flesta maskar vara ungefär samma ålder. Recessiva mutationer kan upptäckas genom att inspektera avkomma F1 individer, som kommer att producera cirka tjugo fem procent av homozygota.

Kraften av genetiska skärmar i nematoder kan utnyttjas ytterligare genom att ändra utformningen av skärmen ^9. Kombinationen av hermafroditer livsstil och snabba generationstid gör nematoder idealisk för genetik studier.