Summary
Il Colon Ascendens stent Peritonite (CASP) è un modello altamente standardizzato per polimicrobiche sepsi addominale nei roditori. Questo articolo descrive la procedura chirurgica di CASP. Il modello CASP e le sue varianti permettono l'indagine sistematica dei vari problemi che riguardano l'interessato di sepsi.
Abstract
La sepsi è tuttora un problema persistente sulle unità di terapia intensiva in tutto il mondo. Comprendere i complessi meccanismi della sepsi è la precondizione per la creazione di nuovi approcci terapeutici in questo campo. Pertanto, i modelli animali sono tenuti in grado di imitare da vicino la malattia umana e anche sufficientemente trattare le questioni scientifiche. Il Colon Ascendens stent Peritonite (CASP) è un modello altamente standardizzato per polimicrobiche sepsi addominale nei roditori. In questo modello, uno stent piccolo è inserito chirurgicamente nel colon ascendente di topi o ratti portando ad una perdita continua di batteri intestinali nella cavità peritoneale. I risultati della procedura di peritonite, batteriemia sistemica, infezione d'organo dai batteri intestinali, e il rilascio sistemico, ma anche locali di diverse citochine pro-e anti-infiammatori. La letalità della CASP può essere controllato dal diametro dello stent inseriti. Una variante di questo modello, la cosiddetta CASP con un intervento (Caspi), aumenta la possibilità di rimuovere il focus settico da un secondo intervento in base alle procedure comuni nella pratica clinica. CASP è un modello facilmente apprendibile e altamente riproducibile che imita da vicino il decorso clinico della sepsi addominale. Conduce modo per studiare su questioni scientifiche in diversi campi ad esempio immunologia, infettivologia, o interventi chirurgici.
Protocol
1. Preparazione del mouse
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale del fluido narcotici (vedi tabella dei reagenti) e posto in posizione supina.
- I piedi del mouse devono essere fissati con del nastro adesivo sul piatto per garantire una posizione stabile dell'animale durante l'operazione.
2. Operazione
- Prendete una cannula IV, che è comunemente usato per le iniezioni iv negli esseri umani, e ritagliarsi il suo tubo di plastica circolare 2 millimetri dalla sua punta. Noi usiamo tre diverse misure di cannule per controllare i tassi di mortalità (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 ml / min); 16GA (1,7 x45mm, 180 ml / min) 14ga (2,0 x45mm, 270 ml / min)).
- Dopo la disinfezione accurata della cute addominale, si incidere lungo la sua linea mediana circa 15mm. Aprire la caverna peritoneale mediante recisione dei muscoli addominali e del peritoneo lungo la linea alba.
- Identificare il polo del cieco ed estrarre con attenzione cieco, terminale dell'ileo e del colon ascendente fuori dell'addome con l'uso di tamponi di cotone.
- 15 millimetri distale dalla valvola ileocecale, si deve forare la parete del colon ascendente con un 7 / 0 sutura. In tal modo, le lesioni dei vasi intestino devono essere evitati. La sutura è fissato sulla parete del colon da due nodi chirurgici.
- Ora forare il colon ascendente con il preparato cannula 1-2 mm prossimale dalla sutura 7 / 0. Inserire delicatamente la cannula nel colon fino al solco nel tubo di plastica è a livello con la sierosa.
- Mettere le estremità libere del sutura 7 / 0 intorno alla cannula e posto un duplice nodo esattamente nel solco preparato del tubo di plastica.
- Ora, prendete l'ago della 7 / 0 punto di sutura e attraverso la parete antimesenterico del colon. Consecutivamente, due nodi chirurgici devono essere eseguiti per fissare ulteriormente il tubo di plastica nella parete del colon. Tagliate le estremità sutura.
- Recuperare la parte in ferro della cannula un po 'e tagliare il tubo di plastica fuori vicino (1mm), che fissa 7 / 0 sutura.
- Ora si deve latte attentamente sgabello dal cieco verso lo stent colon tramite l'uso di tamponi di cotone fino a quando un piccolo suggerimento di feci appare sulla parte superiore dello stent.
- Mettere l'intestino nuovamente dentro la caverna peritoneale e reintegrazione dei liquidi esibiranno per somministrazione intraperitoneale di 0,5 mL di soluzione salina.
- Chiudere il peritoneo con sutura continua (4 / 0).
- Chiudere la pelle con punti di sutura singolare (4 / 0).
3. Cura post-operatoria
- Mettere la parte posteriore animale nella sua gabbia, che dovrebbe contenere abbastanza cibo e acqua. Per l'analgesia, somministrazione intraperitoneale di una sostanza potente analgesico (usiamo buprenorfina) devono essere regolarmente eseguite.
- Entro i primi due giorni dopo l'operazione, si ha per controllare gli animali ogni 6 ore.
4. Sham CASP
- Eseguire i passaggi da 1,1-2,4.
- Non forare il colon. Basta eseguire i passaggi da 2,6-2,8.
- Eseguire i passaggi 2,10-3,2.
5. Caspi
- Eseguire CASP utilizzando una cannula 14G seguenti passaggi 1,1-3,1
- 5h dopo CASP, si deve operare l'animale di nuovo. Preparare e anestetizzare il mouse sempre secondo passi 1,1-1,2
- Aprire le suture della parete addominale.
- Estrarre il colon ascendente con lo stent inseriti.
- Tagliare con attenzione i punti di sutura di fissaggio dello stent e rimuovere lo stent.
- Chiudere il difetto nel colon con singole suture invertente (7 / 0).
- Mettete di nuovo l'intestino nella cavità addominale e lavare questi ultimi due volte con 10 mL di soluzione salina.
- Chiudere il peritoneo con sutura continua (4 / 0).
- Chiudere la pelle con punti di sutura singolare (4 / 0).
- Seguire i passi 3,1-3,2
6. Rappresentante Risultati
Nel giro di poche ore dopo l'operazione, gli animali mostrano segni clinici di una sepsi inizio. I sintomi tipici della malattia sono mobilità ridotta, cappotto horrent, sudorazione, diminuzione dell'assunzione di cibo, perdita di peso e di comportamento fuga anche ridotto. Gli animali lo sviluppo di una peritonite grave con consecutivi infezioni sistemiche normalmente muoiono entro 48h. A seconda delle dimensioni inserito stent, i tassi di mortalità distinti possono essere generati. Un risultato 14G stent in 100% di mortalità, 16G dà il 70% la mortalità e la mortalità del 50% può essere raggiunto utilizzando un stent 18G (Figura 1a). I risultati dell'operazione Sham in un tasso di sopravvivenza del 100%. Di solito, tutti gli animali muoiono inbetween le prime 48 ore dopo la CASP. Così, tutti gli animali che sono vivi, a questo punto il tempo può essere considerato come sopravvissuti. Tuttavia, si consiglia un ulteriore periodo di osservazione di almeno 72 ore per rilevare rari "morti in ritardo" dopo CASP.
Il risultato di Caspi dipende dal periodo di tempo dopo CASP quando lo stent viene rimosso. Un intervento 3h dopo i risultati CASP in un tasso di sopravvivenza del 45%. Se lo stent viene rimosso dopo 5h CASP, solo il 10%gli animali sopravvivere alla procedura. Una rimozione dello stent dopo i risultati 9h a una mortalità del 100% (Figura 1b). Sham Caspi porta alla sopravvivenza del 100%. Per le impostazioni Caspi, si consiglia un periodo di osservazione di 10 giorni perché ci sono di solito gli animali, che muoiono entro 48 ore dalla CASP.
Controllo macroscopico del addominale situs 24 ore dopo la CASP mostra i tipici segni di peritonite: edema, vasodilatazione, parete intestinale erythematic, demarcazione netta di placche di Peyer, paralisi intestinale, liquido libero, e la secrezione settico (Figura 2).
L'infezione sistemica può essere dimostrato con l'analisi batteriologica. 12 ore dopo la CASP, massicce quantità di batteri possono essere rilevati nel lavaggio peritoneale, sangue, fegato, polmoni, milza e reni. Analisi qualitativa dei batteri rivela infezioni sistemiche da batteri intestinali tipici come E. coli, specie Bacteroides, specie Enterococcus, ecc (Figura 3).
CASP indotta la sepsi si manifesta in rilascio locale e sistemica di citochine pro-e anti-infiammatorie e chemochine. 12 ore successive alla CASP, notevoli quantità di TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 e altri possono essere misurati con metodo ELISA nel sangue ma anche in surnatanti di sospensioni d'organo, ad esempio il fegato, polmoni, milza, rene (Fig. 4).
Nello stabilire CASP in laboratorio, i tassi di sopravvivenza, batteriologia e rilascio di citochine dovrebbero essere presi come parametri di controllo per la corretta esecuzione del CASP. In seguito, questi parametri possono essere presi come standard di sistema per leggere tutte le impostazioni sperimentali.
Figura 1a: sopravvivenza dopo CASP. I tassi di sopravvivenza dopo l'intervento chirurgico CASP dipende dal diametro dello stent inseriti. 14G risultati CASP in un tasso di mortalità del 100%, i risultati CASP 16G nel 70% la mortalità, e CASP 18G porta al 50% la mortalità. Sham CASP è associata con una sopravvivenza del 100%. . n = 20/group B: I tassi di sopravvivenza dopo l'intervento Caspi dipende dal momento della rimozione dello stent. Rimozione dello stent a 3h dopo 14G CASP porta ad un tasso di mortalità del 55%. Rimozione dello stent dopo 5h a 14G risultati CASP in un tasso di mortalità del 90%, mentre la rimozione stent a 9h dopo i risultati CASP 14G a 100% di mortalità. Sham Caspi (5 ore) si traduce in una sopravvivenza del 100%. n = 10/group (Sham Caspi; Caspi 9h), n = 20/group (3h Caspi; 5h Caspi).
Figura 2: addominali 24h situs dopo CASP. La parete addominale è stato rimosso 24 ore dopo 16G CASP o sham CASP, rispettivamente. Il situs del mouse simulato operato appare fisiologico. Al contrario, i risultati CASP in edema, iperemia, viscere dilatated e delimitazione delle placche di Peyer dimostrando una grave peritonite.
Figura 3: Batteriologia. CASP porta a gravi infezioni di più compartimenti ed organi dai batteri intestinali entro 12 ore dopo l'operazione. Numeri batteriche sono dato come unità formanti colonia (ufc) per mL, rispettivamente. Le colture batteriche tratte da topi sham gestite sono completamente sterile (non mostrato). 16G CASP, n = 5/group.
Figura 4: Le citochine. CASP innesca una risposta immunitaria sistemica come diverse citochine e chemochine sono rilevabili nel plasma e anche in surnatanti organo. La figura mostra in maniera esemplare le citochine pro-infiammatorie fattore di necrosi tumorale (TNF) e dell'interleuchina-6 (IL-6) e la maggioranza anti-infiammatoria IL-10. 12 ore dopo CASP, i livelli di notevole può essere rilevato nel plasma, fegato, polmone e milza. Tuttavia, IL-10 non possono essere rilevati nei polmoni e nella milza dopo CASP. Sham operazione non porta ad alcuna secrezione di citochine (non mostrato). 16G CASP, n = 5/group.
Discussion
CASP è un modello di sepsi polimicrobica addominale che soddisfa più i criteri postulato per un modello di sepsi prezioso: CASP può essere effettuata in animali di piccola taglia, è altamente riproducibile, facilmente monitorare tramite parametri standard, offre una buona possibilità di leggere, e mima strettamente cliniche di sepsi addominale. In uno studio comparativo abbiamo potuto dimostrare che CASP porta alla peritonite diffusa con infezione precoce e in costante aumento e l'infiammazione sistemica (sindrome da risposta infiammatoria sistemica), mentre la legatura del cieco e la puntura (CLP) rivela un modello di intra-addominale con formazione di ascessi sostenuti e minori segni di infiammazione sistemica (1). La tecnica di Caspi presenta una possibilità di simulare il decorso clinico di peritonite con attenzione chirurgica consecutivi servizi igienico-sanitari, che è il principio più importante terapeutico nell'uomo. CASP può essere applicato per tutte le questioni intorno sepsi o peritonite ed è quindi utile per tutte le discipline si occupano di ricerca sepsi, ad esempio, l'immunologia, la farmacologia, la chirurgia, terapia intensiva, ecc Una selezione di pubblicazioni riguardanti diversi soggetti della sepsi utilizzando il modello CASP è riportata qui sotto (1-14).
Quando si inizia con CASP, si dovrebbe essere consapevoli che una certa pratica è necessaria per effettuare l'operazione esattamente e rapidamente. Esperienza chirurgica può essere utile ma non è obbligatorio. Si consiglia di rilevamento di letality come parametro per la corretta esecuzione del CASP. Si dovrebbe iniziare con CASP 14G come uno stent di grandi dimensioni è più facile da gestire di una più sottile. Un chirurgo CASP addestrato è in grado di operare un mouse in 10 minuti. Prima di iniziare qualsiasi sperimentazione, è necessario assicurarsi che si sta vicino a quel periodo. Quando si acquisito una certa esperienza con la procedura chirurgica, si dovrebbe condurre una cinetica di sopravvivenza per verificare le vostre abilità. 14G CASP dovrebbe comportare una mortalità del 100%. I principianti nel nostro laboratorio devono dimostrare che sono in grado di generare una letalità del 100% con CASP 14G prima di iniziare con gli esperimenti. Inoltre, batteriologia e le misurazioni delle citochine deve essere effettuata per verificare sepsi. Se hai problemi all'inizio con i passi di microchirurgia della CASP, l'uso di lenti d'ingrandimento o un microscopio chirurgico può essere utile. Ma in linea di principio, CASP può essere ben eseguita senza queste utilità. Per la riproduzione dei nostri tassi di sopravvivenza, è assolutamente necessario che gli stessi materiali, in particolare la stent (BD Venflon, vedi sotto), sono utilizzati. In caso contrario, variazioni sostanziali dei risultati sono possibili. Inoltre, ti suggeriamo che ci possono essere variazioni dei risultati a seconda, ad esempio, l'individualità del chirurgo. Tuttavia, l'influenza di fattori quali che dovrebbero essere di piccole dimensioni.
In sintesi, CASP è un possibile modello di sepsi semplice, riproducibile e di valore che imita da vicino la situazione clinica di sepsi addominale. E 'quindi adatto per tutti i campi di ricerca sepsi.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Nico Zantl, Klaus Pfeffer, e Bernhard Holzmann. Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, Germania (GRK-840; Vo 450/10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narcotic fluid | Mix 0.5 mL Rompun with 4.0 mL Ketanest, and add 5.5 mL of saline solution (0.9%).For complete anesthesia, inject intraperitoneally 10 μL/g body weight | ||
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Bayer AG | ||
| Ketanest (25mg/ml Esketamine) | Pfizer Pharma GmbH | 647028001E | |
| BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min) | BD Biosciences | 391457 | |
| BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min) | BD Biosciences | 391455 | |
| BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min) | BD Biosciences | 391456 | |
| Catgut Polyester 4/0 white, non absorbable | Catgut GmbH | 17218113 | |
| Mariderm black 7/0, non absorbable | Catgut GmbH | 18104900 |
References
- Maier, S., Traeger, T., Entleutner, M., Westerholt, A., Kleist, B., Huser, N., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Heidecke, C. D. Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock. 21, 505-511 (2004).
- Bougaki, M., Searles, R. J., Kida, K., Yu, J. D. e, Buys, E. S., Ichinose, F. NOS3 protects against systemic inflammation and myocardial dysfunction in murine polymicrobial sepsis. Shock. , (2009).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
- Busse, M., Traeger, T., Potschke, C., Billing, A., Dummer, A., Friebe, E., Kiank, C., Grunwald, U., Jack, R. S., Schutt, C., Heidecke, C. D., Maier, S., Broker, B. M. Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination. Gut. 57, 188-195 (2008).
- Daubeuf, B., Mathison, J., Spiller, S., Hugues, S., Herren, S., Ferlin, W., Kosco-Vilbois, M., Wagner, H., Kirschning, C. J., Ulevitch, R., Elson, G. TLR4/MD-2 monoclonal antibody therapy affords protection in experimental models of septic shock. J Immunol. 179, 6107-6114 (2007).
- Entleutner, M., Traeger, T., Westerholt, A., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Maier, S., Heidecke, C. D. Impact of interleukin-12, oxidative burst, and iNOS on the survival of murine fecal peritonitis. Int J Colorectal Dis. 21, 64-70 (2006).
- Kerschen, E. J., Fernandez, J. A., Cooley, B. C., Yang, X. V., Sood, R., Mosnier, L. O., Castellino, F. J., Mackman, N., Griffin, J. H., Weiler, H. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J Exp Med. 204, 2439-2448 (2007).
- Kiank, C., Koerner, P., Kessler, W., Traeger, T., Maier, S., Heidecke, C. D., Schuett, C. Seasonal variations in inflammatory responses to sepsis and stress in mice. Crit Care Med. 35, 2352-2358 (2007).
- Lustig, M. K., Bac, V. H., Pavlovic, D., Maier, S., Grundling, M., Grisk, O., Wendt, M., Heidecke, C. D., Lehmann, C. Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes. Shock. 28, 59-64 (2007).
- Traeger, T., Kessler, W., Assfalg, V., Cziupka, K., Koerner, P., Dassow, C., Breitbach, K., Mikulcak, M., Steinmetz, I., Pfeffer, K., Heidecke, C. D., Maier, S. Detrimental role of CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis. Infect Immun. 76, 5285-5293 (2008).
- Traeger, T., Kessler, W., Hilpert, A., Mikulcak, M., Entleutner, M., Koerner, P., Westerholt, A., Cziupka, K., Rooijen, N. van, Heidecke, C. D., Maier, S. Selective depletion of alveolar macrophages in polymicrobial sepsis increases lung injury, bacterial load and mortality but does not affect cytokine release. Respiration. 77, 203-213 (2009).
- Traeger, T., Mikulcak, M., Eipel, C., Abshagen, K., Diedrich, S., Heidecke, C. D., Maier, S., Vollmar, B. Kupffer cell depletion reduces hepatic inflammation and apoptosis but decreases survival in abdominal sepsis. Eur J Gastroenterol Hepatol. , (2010).
- Weighardt, H., Kaiser-Moore, S., Schlautkotter, S., Rossmann-Bloeck, T., Schleicher, U., Bogdan, C., Holzmann, B. Type I IFN modulates host defense and late hyperinflammation in septic peritonitis. J Immunol. 177, 5623-5630 (2006).
- Zantl, N., Uebe, A., Neumann, B., Wagner, H., Siewert, J. R., Holzmann, B., Heidecke, C. D., Pfeffer, K. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun. 66, 2300-2309 (1998).
