Summary
Colon ascendens Stent peritonit (Casp) är en mycket standardiserad modell för Polymikobiella buken sepsis hos gnagare. Den här artikeln beskriver kirurgiska ingreppet för Casp. Den Casp modellen och dess varianter tillåter systematisk undersökning av olika problem som rör ämnet sepsis.
Abstract
Sepsis är ett ihållande problem på intensivvårdsavdelningar i hela världen. Att förstå de komplexa mekanismerna av sepsis är en förutsättning för att etablera nya behandlingsmetoder på detta område. Därför djurmodeller krävs som kan nära efterlikna den mänskliga sjukdomen och också tillräckligt itu med vetenskapliga frågor. Colon ascendens Stent peritonit (Casp) är en mycket standardiserad modell för Polymikobiella buken sepsis hos gnagare. I denna modell är en liten stent inopererad i colon ascendens hos möss eller råttor som leder till en kontinuerlig läckage av tarmbakterier in i bukhålan. Förfarandet medför bukhinneinflammation, systemisk bakteriemi, orgel infektion av tarmbakterier och systemisk men också lokala utsläpp av flera pro-och anti-inflammatoriska cytokiner. Den dödlighet av Casp kan kontrolleras genom att diametern på de infogade stent. En variant av denna modell, den så kallade Casp med intervention (CASPI), höjer möjlighet att ta bort septisk fokus genom en andra operation enligt gemensamma förfaranden i klinisk praxis. Casp är en lätt Lärbar och mycket reproducerbar modell som nära efterliknar det kliniska förloppet av buken sepsis. Det leder sätt att studera frågor inom flera vetenskapliga områden, t.ex. immunologi, infectiology, eller operation.
Protocol
1. Beredning av Mouse
- Bedöva musen efter intraperitoneal injektion av narkotiska vätskan (se tabell över reagenser) och placera den i liggande ställning.
- Fötterna på musen behöver rättas till med tejp på tallriken för att säkerställa en stabil position av djuret under operationen.
2. Drift
- Ta en iv kanyl, som ofta används för intravenösa injektioner hos människor, och tälja sina plaströr cirkulärt 2mm från dess spets. Vi använder tre olika storlekar kanyler för att kontrollera dödlighet (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 ml / min), 16GA (1,7 x45mm, 180 ml / min) 14GA (2,0 x45mm, 270 ml / min)).
- Efter noggrann desinfektion av bukhuden incisionsfilm det längs dess mittlinje ca 15mm. Öppna peritoneal grottan genom öppning av magmusklerna och bukhinna längs linea alba.
- Identifiera cecal stolpen och dra ut försiktigt blindtarmen, terminala ileum och colon ascendens ut i buken med hjälp av bomullspinnar.
- 15mm distala från ileocecal ventilen, måste man hål i väggen i colon ascendens med en 7 / 0 sutur. Därmed skador i tarmen fartygen måste undvikas. Den sutur fastställs på kolon väggen av två kirurgiska knop.
- Nu punktera colon ascendens med det färdiga kanylen 1-2 mm proximalt från 7 / 0 sutur. Försiktigt in kanylen i tjocktarmen tills fåra i plaströret är i nivå med slemhinnorna.
- Sätt fria ändarna av 7 / 0 sutur runt kanylen och lägg en dubbel knut precis i den förberedda fåran av plastslang.
- Nu tar nålen på 7 / 0 suturen och sy den genom antimesenteric väggen i tjocktarmen. I följd, två kirurgiska knutar måste utföras för att ytterligare fixera plaströr i kolon väggen. Kapa sutur slutar.
- Hämta järnet delen av kanylen lite och kapa plaströr off nära (1 mm) fastställande 7 / 0 sutur.
- Nu måste man noggrant mjölk avföring från blindtarmen till tjocktarmen stent med hjälp av bomullspinnar tills en liten spets avföring visas på toppen av stent.
- Sätt tarmen tillbaka i peritoneal grottan och performe vätsketillförsel efter intraperitoneal administrering av 0,5 mL koksaltlösning.
- Stäng bukhinnan med kontinuerlig sutur (4 / 0).
- Stäng huden med singularis suturer (4 / 0).
3. Postoperativ vård
- Sätt djuret tillbaka i sin bur, som bör innehålla tillräckligt med mat och vatten. För analgesi bör intraperitoneal administrering av en kraftfull smärtstillande ämne (vi använder buprenorfin) regelbundet utföras.
- Inom de första två dagarna efter operationen, måste man styra djuren var 6 timmar.
4. Sham Casp
- Utför steg 1,1-2,4.
- Gör inte hål i tjocktarmen. Bara utföra steg 2,6-2,8.
- Utför steg från 2,10 till 3,2.
5. CASPI
- Utför Casp med en 14G steg kanyl efter 1,1-3,1
- 5h efter Casp, måste man använda djuret igen. Förbered och söva musen igen enligt steg 1,1-1,2
- Öppna suturer i bukväggen.
- Dra ut colon ascendens med in stent.
- Skär försiktigt av suturer fastställande av stent och ta bort stent.
- Stäng fel i tjocktarmen med enkel vända suturer (7 / 0).
- Sätt tarmen tillbaka in i bukhålan och spola den senare två gånger med 10 ml koksaltlösning.
- Stäng bukhinnan med kontinuerlig sutur (4 / 0).
- Stäng huden med singularis suturer (4 / 0).
- Följ steg 3,1-3,2
6. Representativa resultat
Inom några timmar efter operationen, djur visar kliniska tecken på en början sepsis. Typiska symtom på sjukdomen är nedsatt rörlighet, horrent päls, svettningar, minskat födointag, viktminskning och även minskat tillflyktsort beteende. Djur utveckla en allvarlig bukhinneinflammation med varandra systemisk infektion dör normalt inom 48h. Beroende på in stent storlek, kan distinkta dödligheten skapas. En 14G stent ger 100% dödlighet, ger 16G 70% dödlighet och dödlighet på 50% kan nås genom att använda ett 18G stent (Figur 1a). Den Sham verksamheten ger en överlevnad på 100%. Vanligtvis dör alla djur emellan de första 48 timmarna efter Casp. Således kan alla djur som lever vid denna tidpunkt betraktas som överlevande. Vi rekommenderar dock en ytterligare observation under minst 72 timmar för att upptäcka ovanliga "sen döda" efter Casp.
Resultatet av CASPI beror på hur lång tid efter Casp när stent tas bort. En intervention 3h efter Casp resulterar i en överlevnad på 45%. Om stent tas bort 5h efter Casp, endast 10% avdjuren överlever förfarandet. En stent avlägsnas efter 9h resulterar i en dödlighet på 100% (Figur 1b). Sham CASPI leder till 100% överlevnad. För CASPI inställningar rekommenderar vi en observationsperiod på 10 dagar eftersom det oftast är djur, som dör senare än 48 timmar efter Casp.
Makroskopiska inspektion av buken situs 24 timmar efter Casp visar typiska tecken på peritonit: ödem, vasodilatation, erythematic tarmväggen, skarp avgränsning av Peyers plack, gut förlamning, fri vätska, och septisk sekretion (Figur 2).
Det systemisk infektion kan visas genom bakteriologisk analys. 12 timmar efter Casp, kan stora mängder bakterier påvisas i magsköljning, blod, lever, lungor, mjälte och njurar. Kvalitativ analys av bakterier avslöjar systemisk infektion av typiska tarmbakterier som E. coli, Bacteroides arter, Enterococcus arter etc. (figur 3).
Casp-inducerad sepsis manifesteras i lokala och systemiska frisättning av pro-och anti-inflammatoriska cytokiner och kemokiner. 12 timmar efter Casp, betydande mängder av TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 och andra kan mätas med ELISA i blodet utan också i supernatanterna av organ suspensioner, t.ex. lever, lungor, mjälte, njure (Fig. 4).
Vid fastställandet Casp i ditt laboratorium, överlevnad, bakteriologi och cytokinfrisättning bör ses som styrparametrar för korrekt utförande av Casp. Senare kan dessa parametrar tas som standard läsa upp för alla experimentella inställningar.
Figur 1a: Överlevnad efter Casp. Överlevnaden efter Casp operation beror på diametern på in stent. 14G Casp resulterar i en dödlighet på 100%, 16G Casp resulterar i 70% dödlighet, och 18G Casp leder till 50% dödlighet. Sham Casp är förenat med en överlevnad på 100%. . n = 20/group B: Överlevnaden efter CASPI operation beror på vilken tid av stent borttagning. Stent avskaffas vid 3 timmar efter 14G Casp leder till en dödlighet på 55%. Stent avskaffas vid 5h efter 14G Casp resulterar i en dödlighet på 90% medan stent avskaffas vid 9h efter 14G Casp resulterar i 100% dödlighet. Sham CASPI (5h) ger en överlevnad på 100%. n = 10/group (Sham CASPI, CASPI 9h), n = 20/group (3h CASPI, 5h CASPI).
Figur 2: Abdominell situs 24h efter Casp. Bukväggen togs bort 24h efter 16G Casp eller simulerade Casp, respektive. Den situs av falska drivs musen ser fysiologiska. Däremot Casp resulterar i ödem, hyperemi, dilatated tarm, och avgränsning av Peyers plack visar svår bukhinneinflammation.
Figur 3: bakteriologi. Casp leder till allvarliga infektioner i flera fack och organ av tarmbakterier inom 12h efter operation. Bakterie-nummer anges som kolonibildande enheter (CFU) per ml, respektive. Bakteriekulturer hämtade från bluff drivs möss är helt steril (visas inte). 16G Casp, n = 5/group.
Figur 4: cytokiner. Casp utlöser ett systemiskt immunsvar som flera cytokiner och kemokiner är påvisbara i plasma och även i orgel supernatanterna. Figuren visar föredömligt pro-inflammatoriska cytokiner tumörnekrosfaktor (TNF) och interleukin-6 (IL-6) samt övervägande antiinflammatoriska IL-10. 12h efter Casp kan anmärkningsvärda halter detekteras i plasma, lever, lunga och mjälte. Däremot kan IL-10 inte påvisas i lung-och mjälte efter Casp. Sham handhavandet inte leder till någon cytokin sekretion (ej på bild). 16G Casp, n = 5/group.
Discussion
Casp är en Polymikobiella modell av buken sepsis som uppfyller de flesta kriterier antagits för en värdefull sepsis modell: Casp kan utföras i små djur, är mycket reproducerbar, lätt att övervaka av standard parametrar, ger goda läsa upp möjligheter och nära härmar kliniska inställningar buken sepsis. I en jämförande studie kunde vi visa att Casp leder till diffus peritonit med tidig och stadigt ökande systemisk infektion och inflammation (systemisk inflammatorisk respons syndrom), medan cecal ligation och punktering (CLP) visar en modell av intraabdominell abscess bildning med bibehållen och mindre tecken på systemisk inflammation (1). Tekniken att CASPI presenterar en möjlighet att simulera det kliniska förloppet vid peritonit med varandra kirurgiska fokus sanitet, vilket är den viktigaste terapeutiska principen i människan. Casp kan användas för alla frågor runt sepsis eller peritonit och är därför användbart för alla discipliner arbetar med sepsis forskning, exempelvis immunologi, farmakologi, kirurgi, intensivvård medicin, etc. Ett urval av publikationer om olika ämnen av sepsis med Casp modell ges nedan (1-14).
Vid start med Casp bör man vara medveten om att vissa metoder är nödvändigt för att utföra operationen exakt och snabbt. Kirurgisk erfarenhet kan vara till hjälp men är inget krav. Vi rekommenderar upptäckt av letality som en parameter för korrekt utförande av Casp. Man bör börja med 14G Casp som en stor stent är lättare att hantera än en tunnare. En utbildad Casp kirurgen kunna driva en mus inom 10 minuter. Innan något experiment, bör du se till att du är nära den perioden. När du fått lite erfarenhet med det kirurgiska ingrepp, bör du göra en överlevnad kinetisk att kolla dina kunskaper. 14G Casp bör resultera i en 100% dödlighet. Nybörjare i vårt laboratorium måste bevisa att de kan generera en 100% dödlighet med 14G Casp innan de börjar med experiment. Dessutom, bakteriologi och mätningar cytokin bör utföras för att verifiera sepsis. Om du har problem i början med mikrokirurgisk steg Casp, kan användning av förstoringsglas eller en kirurgisk mikroskop vara till hjälp. Men i princip kan Casp väl utföras utan de här verktygen. För återgivning av vår överlevnad är det absolut nödvändigt att samma material, särskilt stentar (BD Venflon, se nedan), används. Annars betydande variationer i resultaten är möjliga. Dessutom föreslår vi att det kan finnas variationer i resultaten beroende på till exempel individualitet kirurgen. Bör dock påverkan av faktorer som att vara liten.
Sammanfattningsvis är Casp ett praktiskt, enkelt reproducerbar och värdefulla sepsis modell som härmar nära den kliniska situationen i buken sepsis. Det är därför lämpligt för alla områden av sepsis forskning.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar Nico Zantl, Klaus Pfeffer, och Bernhard Holzmann. Denna studie fick stöd av Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, Tyskland (GRK-840, Vo 450/10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narcotic fluid | Mix 0.5 mL Rompun with 4.0 mL Ketanest, and add 5.5 mL of saline solution (0.9%).For complete anesthesia, inject intraperitoneally 10 μL/g body weight | ||
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Bayer AG | ||
| Ketanest (25mg/ml Esketamine) | Pfizer Pharma GmbH | 647028001E | |
| BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min) | BD Biosciences | 391457 | |
| BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min) | BD Biosciences | 391455 | |
| BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min) | BD Biosciences | 391456 | |
| Catgut Polyester 4/0 white, non absorbable | Catgut GmbH | 17218113 | |
| Mariderm black 7/0, non absorbable | Catgut GmbH | 18104900 |
References
- Maier, S., Traeger, T., Entleutner, M., Westerholt, A., Kleist, B., Huser, N., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Heidecke, C. D. Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock. 21, 505-511 (2004).
- Bougaki, M., Searles, R. J., Kida, K., Yu, J. D. e, Buys, E. S., Ichinose, F. NOS3 protects against systemic inflammation and myocardial dysfunction in murine polymicrobial sepsis. Shock. , (2009).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
- Busse, M., Traeger, T., Potschke, C., Billing, A., Dummer, A., Friebe, E., Kiank, C., Grunwald, U., Jack, R. S., Schutt, C., Heidecke, C. D., Maier, S., Broker, B. M. Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination. Gut. 57, 188-195 (2008).
- Daubeuf, B., Mathison, J., Spiller, S., Hugues, S., Herren, S., Ferlin, W., Kosco-Vilbois, M., Wagner, H., Kirschning, C. J., Ulevitch, R., Elson, G. TLR4/MD-2 monoclonal antibody therapy affords protection in experimental models of septic shock. J Immunol. 179, 6107-6114 (2007).
- Entleutner, M., Traeger, T., Westerholt, A., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Maier, S., Heidecke, C. D. Impact of interleukin-12, oxidative burst, and iNOS on the survival of murine fecal peritonitis. Int J Colorectal Dis. 21, 64-70 (2006).
- Kerschen, E. J., Fernandez, J. A., Cooley, B. C., Yang, X. V., Sood, R., Mosnier, L. O., Castellino, F. J., Mackman, N., Griffin, J. H., Weiler, H. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J Exp Med. 204, 2439-2448 (2007).
- Kiank, C., Koerner, P., Kessler, W., Traeger, T., Maier, S., Heidecke, C. D., Schuett, C. Seasonal variations in inflammatory responses to sepsis and stress in mice. Crit Care Med. 35, 2352-2358 (2007).
- Lustig, M. K., Bac, V. H., Pavlovic, D., Maier, S., Grundling, M., Grisk, O., Wendt, M., Heidecke, C. D., Lehmann, C. Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes. Shock. 28, 59-64 (2007).
- Traeger, T., Kessler, W., Assfalg, V., Cziupka, K., Koerner, P., Dassow, C., Breitbach, K., Mikulcak, M., Steinmetz, I., Pfeffer, K., Heidecke, C. D., Maier, S. Detrimental role of CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis. Infect Immun. 76, 5285-5293 (2008).
- Traeger, T., Kessler, W., Hilpert, A., Mikulcak, M., Entleutner, M., Koerner, P., Westerholt, A., Cziupka, K., Rooijen, N. van, Heidecke, C. D., Maier, S. Selective depletion of alveolar macrophages in polymicrobial sepsis increases lung injury, bacterial load and mortality but does not affect cytokine release. Respiration. 77, 203-213 (2009).
- Traeger, T., Mikulcak, M., Eipel, C., Abshagen, K., Diedrich, S., Heidecke, C. D., Maier, S., Vollmar, B. Kupffer cell depletion reduces hepatic inflammation and apoptosis but decreases survival in abdominal sepsis. Eur J Gastroenterol Hepatol. , (2010).
- Weighardt, H., Kaiser-Moore, S., Schlautkotter, S., Rossmann-Bloeck, T., Schleicher, U., Bogdan, C., Holzmann, B. Type I IFN modulates host defense and late hyperinflammation in septic peritonitis. J Immunol. 177, 5623-5630 (2006).
- Zantl, N., Uebe, A., Neumann, B., Wagner, H., Siewert, J. R., Holzmann, B., Heidecke, C. D., Pfeffer, K. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun. 66, 2300-2309 (1998).
