Summary
وقد أثبتت عكس النهج الوراثية مفيدة للغاية لتحديد الجينات التي تشكل أساس المقاومة لمسببات الأمراض في ناقلات البعوض. هذا البروتوكول الفيديو يوضح الطريقة التي يستخدمها المختبر Dimopoulos لحقن الرنا المزدوج الجديلة في الأنوفيلة غامبياي ، التي ترعى طفيل الملاريا. ويتجلى أسلوب التلاعب الإعداد الحقن وحقن الرنا المزدوج الجديلة في القفص الصدري.
Abstract
وقد أثبتت عكس النهج الوراثية مفيدة للغاية لتحديد الجينات التي تشكل أساس المقاومة لمسببات الأمراض في ناقلات البعوض. هذا البروتوكول الفيديو يوضح الطريقة التي يستخدمها المختبر Dimopoulos لحقن الرنا المزدوج الجديلة في الأنوفيلة غامبياي ، التي ترعى طفيل الملاريا. ويتجلى أسلوب التلاعب الإعداد الحقن وحقن الرنا المزدوج الجديلة في القفص الصدري.
Protocol
[رني بوساطة إسكات الجينات في البعوض ويتطلب التحضير المسبق وتنقية dsRNAs المحددة التي تستهدف هذا الجين من الفائدة. لتخليق الرنا المزدوج الجديلة ، نوصي عدة Megascript Ambion الذي يجعل من استخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 بوساطة كرد فعل النسخ المختبر. لتنقية الرنا المزدوج الجديلة ، نوصي عدة RNeasy Qiagen. وينبغي قياس عينات من الرنا المزدوج الجديلة وتعديلها إلى 3 ميكروغرام / ميكرولتر في الماء. مواد أخرى سوف تحتاج ما يلي : الغرامة ذات الرؤوس الملقط ، شريحة زجاجية ، والإبر والزجاج microcapillary ، microinjector (نستخدم دراموند Nanoject II) ، المجهر ضوء تصاعد أعلاه كتلة الباردة ، وهي تتناول طبق بيتري الزجاج ، والمناشف الورقية ودلو من الجليد . سوف تحتاج أيضا وسيلة لجمع البعوض وعاء مناسب لهم جنبا إلى جنب مع مصدر المواد الغذائية مثل كرة من القطن المنقوعة في السكروز 10 ٪.
- جمع البعوض الخاص. باستخدام الشافطة تعمل بالبطارية ، وجمع البعوض كنت ترغب في ضخ. سد فوهة مع منشفة ورقية أو القطن بحيث لا يستطيع البعوض الهرب وإزالة الخزان. درجات الحرارة الباردة منذ تخدير البعوض ، ودفن خزان في دلو من الجليد والانتظار لمدة 5-10 دقائق على البعوض لوقف التحرك. ويمكن أيضا أن يتحقق التخدير عن طريق وضع الخزان في غرفة باردة أو الثلاجة أو باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2. خلال هذه الدقائق 50-10 ، انتقل إلى الخطوة التالية.
- إعداد مجال عملك. تعيين كتلة سطح مستو الباردة إلى 2 درجة مئوية ، ووضع شريحة زجاجية على ذلك. هذا هو المكان الذي ستقع البعوض كما كنت ضخها. إبرة تعلق على الزجاج وmicroinjector واستخدام الملقط الخاص لكسر غيض من الإبرة إلى العرض المطلوب. من المهم أن العرض هو كبير بما يكفي للسماح مساحة كافية لتدفق السائل من خلال بسعر معقول ولكن ضيق بما يكفي لالحاق جرح الحد الأدنى خلال الحقن. وهناك نصيحة جيدة الإبرة يكون ضيقا بما يكفي لكسر ينحني قليلا ولكن لا. مجموعة معدات حقن الخاص لحجم الانتاج المطلوب (لرني ، ونحن نستخدم 69 NL). يغرق غيض من الإبرة الخاص في عينتك واستخلاص عينة السائل الخاص إلى الإبرة باستخدام إرشادات الشركة المصنعة. يمكن للعينة السائل يكون حلا الرنا المزدوج الجديلة ، تعليق البكتيرية ، أو غيرها ، وعملية الحقن هي نفسها للجميع. تضمين طبق بيتري الزجاج في دلو الثلج بحيث أسفل الطبق هو الاتصال تماما الجليد. هذا هو المكان الذي سوف يضع البعوض حتى تكون على استعداد لضخها.
- اعداد البعوض الخاص. 50-100 نقل البعوض من الخزان إلى طبق بيتري الزجاج. استخدام الملقط الخاص لرقيقة لهم طبقة واحدة ، والتأكد من أكثر من الاتصال مع الجزء السفلي من الطبق البارد للاحتفاظ بها تخدير. تغطي هذه البعوض مع تغطية صحن عندما لا تكون قيد الاستعمال. إعادة الخزان إلى دلو الثلج للحفاظ على ما تبقى من البعوض تخدير.
- جبل البعوض على كتلة الباردة. استخدامك غرامة يميل ملقط لنقل البعوض واحد في وقت من الطبق إلى الشريحة الزجاجية التي شنت على الكتلة الباردة تحت المجهر الخفيفة. التعامل بلطف على البعوض ، ويفضل من الساقين. خط يصل ما يصل الى 30 البعوض جنبا إلى جنب على الشريحة ، والتأكد من يمكنك الحصول على كل واحد مع microinjector والتأكد من كل واحد يجعل الاتصال مع الشريحة الباردة. تأكد من اصطف البعوض الخاص بك منظم بحيث كما تذهب على طول تعلمون التي والتي لم تحقن تم. ترك البعوض الأخرى المشمولة في طبق بتري مبردة.
- حقن المجموعة الأولى من البعوض. عقد الخاص غرامة ذات الرؤوس ملقط يميل في يد واحدة وعقد microinjector في اليد الأخرى مثل قلم رصاص. استخدام ملقط لنقل البعوض كما تحتاج (التعامل معها من قبل لتجنب إصابة الساقين) ، والحفاظ على البعوض مستمرة حيث يحقن. هذا يعمل بشكل أفضل في حالة استخدام الملقط لدعم جانب واحد من البعوض كما كنت تضخ من الجانب الآخر. إدراج بعناية مجرد غيض إبرة في الصدر البعوض. فمن الأفضل ليحقن في جزء مشدود بعد رقيقة من إهاب للتقليل من الاصابة. أيضا ، وتجنب الحقن العميق جدا ، أردت مجرد غيض أن تكون داخل القفص الصدري ؛ أعمق الحقن يسبب المزيد من الجروح التي سوف توفيقي البقاء. مرة واحدة في تلميح إبرة في الموقف ، والصحافة والافراج عن دواسة القدم لجهاز microinjector الذي سيلقي بك قبل تعيين حجم الرنا المزدوج الجديلة. انتظر لثانية أو اثنتين ، وإزالة الإبرة من البعوض. اذا قطرة من السائل تظهر خارج موقع الجرح ، وانتظر بضع ثوان حتى يتم امتصاصه في الجرح. اذا لم تستوعب في غضون ثوان قليلة ، وتجاهل أن البعوض وحاول مرة أخرى. الاستمرار في عملية حقن للجميع البعوض على الشريحة الزجاجية الخاصة بك.
- المتجر الخاص البعوض. عند الانتهاء ، ومكان البعوض الخاص حقنه داخل حاويات المسمى (نفضل 1 كوب الكرتون باينت الشمع مبطنة تغطيهاشبكة المعاوضة والمضمون مع عصابات المطاط وغطاء من الورق المقوى).
- يستمر الحقن حتى الانتهاء. الاستمرار في مكان البعوض على الشريحة ، وضخ ونقل إلى الكؤوس حتى يكون لديك حجم العينة التي تريدها. سوف تمثل بالنسبة لبعض المبتدئين ، والبعوض وفاة العديد من يموت من صدمة الحقن. هذا سوف يتحسن مع الممارسة حتى ما يقرب من 100 ٪ من البعوض الخاص البقاء الحقن.
- عند الانتهاء ، وضع مطوية ، منشفة ورقية مبللة على الكأس مع مصدر الغذاء والغطاء والكؤوس مع شيء على الاحتفاظ بالرطوبة مثل غلاف بلاستيكي أو غطاء بلاستيكي بيتري. حقن البعوض المعرضة للجفاف وبالتالي فإن الرطوبة التي قدمتها منشفة مبللة والتي احتفظت بها من البلاستيك سيساعد على منع ذلك.
- مكان البعوض الخاص في غرفة التحكم بيئيا للحضانة.
ملاحظة : الكفاءة لإسكات الجين هو متغير جدا ويعتمد على عدد من العوامل بما في ذلك نص والبروتين بدوره على أسعار والرنا المزدوج الجديلة كفاءة امتصاص الخلايا والأعضاء. لقد وجدنا أن إسكات يبدأ في وقت مبكر يوم 1 حقن آخر ، ويمكن أن تصل إلى 6 أيام بعد الحقن. استخدام وسائل الكشف عن نص والبروتين مثل PCR الكمي والغربية للتحقق من صحة إسكات النشاف.
ملاحظة : هناك عدة تنويعات على عدة خطوات لحقن البعوض ورني بوساطة تقنية إسكات الجينات. بعض الاختلافات التي وصفها : بواسون ، وآخرون (2006) وبلاندن ، وآخرون (2002)...
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كفاءة إسكات الجين هو متغير جدا ويعتمد على عدد من العوامل بما في ذلك نص والبروتين بدوره على أسعار والرنا المزدوج الجديلة كفاءة امتصاص الخلايا والأعضاء. لقد وجدنا أن إسكات يبدأ في وقت مبكر ك 1 حقن آخر النهار ويمكن أن تصل إلى 6 أيام بعد الحقن. استخدام وسائل الكشف عن نص والبروتين مثل PCR الكمي والغربية للتحقق من صحة إسكات النشاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Megascript | kit | Ambion | for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction | |
| RNeasy | Qiagen | For dsRNA purification | ||
| dsRNA | should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water | |||
| fine-tipped forceps | ||||
| glass slide | ||||
| glass microcapillary needles | ||||
| microinjector | Drummond Scientific | Nanoject II | ||
| light microscope | mounted above a cold block | |||
| Petri dish | covered, glass | |||
| paper towels | ||||
| 10% sucrose | food | |||
| A. gambiae | Animal | mosquitos |
References
- Boisson,, et al. , (2006).
- Blandin,, et al. , (2002).
