Protokoll för RNAi-tester på vuxna myggor (A. gambiae)

Summary

Omvänd genetiska metoder har visat sig extremt användbart för att avgöra vilka gener som underliggande motstånd mot vektor patogener i myggor. Denna video protokoll illustrerar en metod som Dimopoulos labbet att injicera dsRNA i Anopheles gambiae myggor som hyser malariaparasiten. Tekniken manipulera injektionen setup och injicera dsRNA i bröstkorgen illustreras.

Abstract

Omvänd genetiska metoder har visat sig extremt användbart för att avgöra vilka gener som underliggande motstånd mot vektor patogener i myggor. Denna video protokoll illustrerar en metod som Dimopoulos labbet att injicera dsRNA i Anopheles gambiae myggor som hyser malariaparasiten. Tekniken manipulera injektionen setup och injicera dsRNA i bröstkorgen illustreras.

Protocol

RNAi-medierad geners uttryck i myggor kräver förberedelser och rening av specifika dsRNAs som riktar genen av intresse. För dsRNA syntes, rekommenderar vi att satsen Ambion Megascript som använder sig av en T7 RNA-polymeras-medierad in vitro transkription reaktion. För dsRNA rening rekommenderar vi Qiagen RNeasy kit. Prover på dsRNA bör kvantifieras och justeras till 3 mikrogram / mikroliter i vatten. Andra material du behöver är: spetsig pincett, glasskiva, glas microcapillary nålar, microinjector (vi använder Drummond är Nanoject II), ett ljusmikroskop monteras ovanför ett kallt block, ett täckt glas petriskål, pappershanddukar och en hink med is . Du behöver också ett sätt att samla in mygg och lämplig behållare för dem tillsammans med en näringskälla som bomullstuss indränkt i 10% sackaros.

1. Samla dina myggor. Med en batteridriven aspirator, samla myggorna du vill injicera. Anslut munstycket med hushållspapper eller bomull så inga myggor kan fly och ta bort behållaren. Eftersom kyla söva myggor, begrava reservoaren i en hink med is och vänta 50-10 minuter för myggorna att sluta röra sig. Anesthetization kan också uppnås genom att placera behållaren i ett kallt rum eller kylskåp eller med hjälp av CO _2. Under dessa 5-10 minuter, fortsätt till nästa steg.
   
   
2. Förbered din arbetsplats. Ställ en plan yta kallt block till 2 ° C och placera en glasskiva på det. Det är där myggorna kommer resten som du injicerar dem. Sätt ett glas nålen på microinjector och använda din tång för att bryta nålspetsen till önskad bredd. Det är viktigt att bredden är stor nog att tillåta tillräckligt med utrymme för vätska att passera genom i rimlig takt, men är smal nog för att orsaka ett minimalt sår under injektion. En bra nålspetsen är smal nog att böja något men inte sönder. Ställ in din injektion utrustning till önskad produktionsvolym (för RNAi, vi använder 69 NL). Sänk toppen av din nål i ditt prov och dra dina vätska provet i nålen enligt tillverkarens anvisningar. Vätskan prov kan vara en dsRNA lösning, bakteriesuspension, eller andra, injektion processen är densamma för alla. Bädda in ett glas petriskål i ishinken så att botten av skålen är helt kontakt med isen. Det är här du kommer att sätta myggor förrän du är redo att injicera dem.
   
   
3. Förbered din myggor. Överför 50-100 myggor från reservoaren till glaset petriskål. Använd din pincett för att tunna dem till ett enda lager, och se de flesta har kontakt med den kalla botten på skålen för att hålla dem nedsövda. Täcka dessa myggor med skålen locket när den inte används. Återgå behållaren till ishink för att hålla resten av myggor sövd.
   
   
4. Mount myggor på kalla block. Använd din spetsig pincett för att överföra myggor en i taget från skålen till glasskiva monterad på den kalla blocket under ljusmikroskop. Hantera myggor försiktigt, helst med benen. Rada upp så många som 30 myggor sida vid sida i bilden, vilket gör att du kan få till var och en med microinjector och se var och en tar kontakt med den kalla bilden. Se till att dina myggor är uppradade ordnad så att när du går längs du vet som har och som inte har injicerats. Låt andra myggor som behandlas i kylda petriskål.
   
   
5. Injicera din första gruppen av myggor. Håll spetsig spets tång i ena handen och håll microinjector i den andra handen som en penna. Använd pincett för att flytta mygga som du behöver (hantera dem i benen för att undvika skada) och att hålla mygg stadig när du injicerar. Detta fungerar bäst om du använder pincett för att stödja den ena sidan av myggor som du injicerar från andra sidan. Sätt försiktigt bara nålspetsen i myggans bröstkorgen. Det är bäst att injicera i en spänd men tunn del av nagelband för att minimera skadan. Undvik också att injicera för djupt, du vill bara toppen att vara inne i bröstkorgen, djupare injektioner orsaka större sår som kommer att kompromissa överlevnad. När nålspetsen är i position, tryck och släpp pedalen för microinjector apparat som levererar din förinställda volym dsRNA. Vänta en sekund eller två och ta bort nålen från mygga. Om en droppe vätska visas utanför såret, vänta några sekunder för den att absorberas in i såret. Om det inte absorberar inom några sekunder, kasta den mygga och försök igen. Fortsätt injektionen process för alla myggor på glasplatta.
   
   
6. Lagra dina myggor. När du är klar, placera injiceras mygg inne i märkta behållare (vi föredrar en pint vax-fodrade kartong koppar som omfattas avmaskor och fäst med gummiband och en kartong lock).
   
   
7. Fortsätt injektioner till färdigt. Fortsätta att placera myggor på bilden, injicera och överföring till koppar tills du har urvalets storlek du önskar. Redogöra för några dödsfall-nybörjare kommer att ha många mygg dör av trauma som injektion. Detta kommer att förbättra med träning fram till nästan 100% av din myggor överleva injektion.
   
   
8. När du är klar, placera en vikt, vått papper handduk över koppen tillsammans med en näringskälla och täcka kuporna med något att behålla fukt som plast wrap eller en plast Petri lock. Injiceras myggor är benägna att torka ut så att fukten från den blöta handduken och bevaras av plast förhindrar detta.
   
   
9. Placera din myggor på ett miljömässigt kontrollerad kammare för inkubation.

OBS: Effektivitet i geners uttryck är mycket varierande och beror på ett antal faktorer, inklusive utskrift och protein omsättning priser, och dsRNA upptag effektivitet genom celler och organ. Vi har funnit att tysta börjar så tidigt som 1 dag efter injektionen, och kan pågå upp till 6 dagar efter injektionen. Använd utskrift och protein detektionsmetoder såsom kvantitativa PCR och Western blotting för att validera tysta.

OBS: Det finns flera varianter på flera steg av mygga injektion och RNAi-medierad geners uttryck teknik. Vissa variationer beskrivs av: Boisson, et al (2006) och Blandin, et al (2002)...

Discussion

Effektivitet av geners uttryck är mycket varierande och beror på ett antal faktorer, inklusive utskrift och protein omsättning priser, och dsRNA upptag effektivitet genom celler och organ. Vi har funnit att tysta börjar så tidigt som en injektion dagen efter och kan pågå upp till 6 dagar efter injektionen. Använd utskrift och protein detektionsmetoder såsom kvantitativa PCR och Western blotting för att validera tysta.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond Scientific	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos