Summary
反向遗传方法已被证明非常有用，确定哪些基因底层电阻载体病原体在蚊子。该视频协议说明Dimopoulos实验室使用的冈比亚按蚊的蚊子，其中海港的疟疾寄生虫注入dsRNA的一个方法。操纵注射的设置和注入胸廓的dsRNA的技术说明。
Abstract
反向遗传方法已被证明非常有用，确定哪些基因底层电阻载体病原体在蚊子。该视频协议说明Dimopoulos实验室使用的冈比亚按蚊的蚊子，其中海港的疟疾寄生虫注入dsRNA的一个方法。操纵注射的设置和注入胸廓的dsRNA的技术说明。
Protocol
RNAi介导的基因沉默在蚊子需要事前准备和提纯感兴趣的基因的具体dsRNAs目标。双链RNA的合成，我们建议Ambion公司Megascript套件，这使得使用一个T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应。对于纯化的双链RNA，我们建议Qiagen公司的RNeasy试剂盒。双链RNA的样品应量化，并调整为3微克/μL在水中。其他材料，您需要包括：细尖镊子，载玻片，玻璃microcapillary针，微量（我们使用Drummond的Nanoject第二），一个光显微镜安装以上冷块，一个涵盖玻璃的Petri菜，纸巾和一桶冰。您还需要一种方法来收集蚊子和适合自己的容器，随着食物来源，如浸泡在10％蔗糖的棉花球。
- 收集您的蚊子 。使用电池供电的抽吸，收集你想注入的蚊子。将喷嘴用纸巾或棉花，所以没有蚊子能逃脱和消除水库。由于寒冷的气温麻醉蚊子，埋在冰桶水库和等待5-10分钟停止移动的蚊子。放置在冷室或冰箱水库或使用的CO 2，麻醉也可以实现。在5-10分钟，继续下一步。
- 准备好您的工作区设置一个平面冷块至2 ° C和地方上的载玻片。这是蚊子的地方休息，你注入。连接到微量的玻璃针和使用您的镊子打破针尖到所需的宽度。重要的是，宽度是大到足以让足够的空间用于液体流在一个合理的速度通过，但很窄，足以造成注射过程中的一个最小的伤口。一个良好的针头将足够窄，稍微弯曲，但不会被打破。设置您的注射设备所需的输出量（用于RNAi，我们使用69 NL）。淹没尖端进入你的样品针吸引到您的液体样品使用制造商的指示针。液体样品可以dsRNA的解决方案，细菌悬浮液，或其他注射过程是所有相同。在冰桶中嵌入的玻璃培养皿中，使盘底部完全接触冰。这是在那里你会放，直到您准备注入的蚊子。
- 准备好您的蚊子 。转让50-100蚊子从玻璃培养皿水库。使用钳薄的单层，确保大部分的菜冷底部接触，以保持他们的麻醉。菜盖盖时，在不使用这些蚊子。返回水库冰桶，保持休息的蚊子麻醉。
- 冷块山蚊子 。使用细尖钳一次传输的蚊子从盘安装在光学显微镜下的冷块的载玻片。把手轻轻的蚊子，最好的腿。多达30个蚊子在幻灯片上侧端线，确保你可以得到每一个与微量，并确保每一个与寒冷的幻灯片接触。确保您的蚊子都排队有序，让你走，你知道有和没有被注入。保留在冷冻的培养皿中涉及的其他蚊子。
- 注入蚊子的第一组。一方面保持细尖的尖钳，像铅笔另一方面举行的微量。使用镊子移动蚊子，因为你需要的（处理他们，以避免受伤的腿），并保持稳定，为你注入蚊子。这最好的作品，如果你使用的镊子支持蚊子的一面，当你从另一个侧面注入。只是针尖小心地放入蚊子的胸部。最好是一个绷紧的角质层，以尽量减少伤害而薄的一部分注入。同时，避免注射过深，你想只是冰山胸廓内，更深的注射造成更大的创伤会妥协的生存。一旦针尖位置，按下并释放微量设备将提供您预先设定的dsRNA量的脚踏板。等待一两秒钟，消除蚊子的针。如果液滴出现伤口外，等待几秒钟，它是在伤口吸收。如果它不吸收，在几秒钟内，丢弃，蚊子，然后再试一次。继续为您的载玻片上所有蚊子的注射过程。
- 商店的蚊子 。当你完成后，将有标签的容器内注入蚊子（我们宁愿1品脱蜡内衬纸板覆盖杯网状扣除，并用橡皮筋和纸板盖担保）。
- 继续注射，直至完成 。继续把蚊子在幻灯片上，注入和转移到杯子，直到你有你的愿望的样本大小。对于一些初学者死亡的帐户将有许多蚊子死于注射的创伤。这将改善与实践，直到几乎100％的蚊子在生存注射。
- 当完成后，将一起食物来源比杯折叠，湿纸巾和保留水分，如保鲜膜或塑料的Petri盖盖的杯子。注射蚊子很容易干燥，所以提供的湿毛巾和塑料保留的水分会有助于防止这种。
- 放置在孵化室环境控制蚊子。
注 ：基因沉默的效率是高度可变的，取决于许多因素，包括成绩单和蛋白质的转，超过利率，并通过细胞和器官的双链RNA吸收效率。我们发现，沉默开始早1天注射后，可以持续长达6天注射后。使用成绩单和蛋白质的检测方法，如定量PCR和Western印迹，以验证沉默。
注 ：有几个变化对蚊子的注射和RNAi介导的基因沉默技术的几个步骤。所描述的一些变化：布瓦松，等人（2006年）和Blandin，等（2002） 。
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Discussion
基因沉默的效率是高度可变的，取决于多项因素，包括成绩单和蛋白质的转，超过利率，并通过细胞和器官的双链RNA吸收效率。我们发现，沉默开始早在1天注射后，可长达6天注射后。使用成绩单和蛋白质的检测方法，如定量PCR和Western印迹，以验证沉默。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Megascript | kit | Ambion | for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction | |
| RNeasy | Qiagen | For dsRNA purification | ||
| dsRNA | should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water | |||
| fine-tipped forceps | ||||
| glass slide | ||||
| glass microcapillary needles | ||||
| microinjector | Drummond Scientific | Nanoject II | ||
| light microscope | mounted above a cold block | |||
| Petri dish | covered, glass | |||
| paper towels | ||||
| 10% sucrose | food | |||
| A. gambiae | Animal | mosquitos |
References
- Boisson,, et al. , (2006).
- Blandin,, et al. , (2002).
