Summary
Мышиной модели
Abstract
Трансплантация стволовых клеток и вирусов внутриутробно имеет огромный потенциал для лечения врожденных пороков в человеческом плода. Например, в внутриутробно трансплантации (МСА) гемопоэтических стволовых клеток был использован для успешного лечения пациентов с тяжелым комбинированным иммунодефицитом. 1,2 В ряде других условиях, однако, МСА было безуспешно. 3 Учитывая эти неоднозначные результаты, доступность эффективной не-модель человека для изучения биологических последствий применения трансплантации стволовых клеток и генной терапии имеет решающее значение для продвижения этой области. Мы и другие использовали мышиной модели ИТУ для изучения факторов, влияющих на успешное приживление пересаженных внутриутробно гемопоэтических стволовых клеток в обеих мышей дикого типа 4-7, и те с генетическими заболеваниями. 8,9 плода окружающей среды также дает значительные преимущества для Успех в генной терапии внутриутробно. Например, доставка аденовирусных 10, адено-ассоциированные вирусные 10, ретровирусные 11, а векторы лентивирусов 12,13 в плода привело к трансдукции многих органов далеких от места инъекции с долгосрочной экспрессии генов. Внутриутробно генная терапия может поэтому рассматриваться как возможная стратегия для лечения одного расстройства, такие как ген мышечной дистрофии или кистозный фиброз. Другое потенциальное преимущество ИТУ является способность индуцировать иммунный толерантности к специфическим антигеном. Как видно у мышей, больных гемофилией, введение фактора IX на ранних стадиях развития приводит к толерантности к этому белку 14.
В дополнение к использованию в расследовании потенциальной человеческой терапии, мышиной модели ИТУ может быть мощным инструментом для обучения по основным вопросам в области развития и биологии стволовой клетки. Например, можно осуществлять различные небольшие молекулы, чтобы побудить или ингибировать специфическое выражение генов в определенные этапы беременности и манипулировать ими пути развития. Влияние этих изменений могут быть оценены на различных timepoints после первоначального трансплантации. Более того, можно пересадки плюрипотентных или происхождение конкретных клеток-предшественников в эмбриональной среды для изучения стволовых клеток дифференциации в необлученных и невозмущенной среды узла.
Мышиной модели IUT уже предоставил многочисленные идеи в области иммунологии, а также развития и биологии стволовой клетки. В этом видео-протоколу, мы опишем шаг за шагом, подход к выполнению МСА в мышиных зародышей и набросков критических стадий и потенциальные проблемы этого метода.
Protocol
1. Подготовка инъекций Пипетки
- Калибровка пипетки съемник, что разделение стеклянную пипетку происходит в течение 15 секунд (см. инструкцию производителя в отношении калибровки). Пипетки будет иметь конусность, когда оно разделяет.
- Отрежьте конец пипетки так, что расстояние от начала сужаются к концу пипетки 1.04cm к 1.05cm. Длина пипетки обратно пропорциональна калибр отверстия пипетки. Имейте в виду, что внесение больше пипетки также приводит к слабым совет, который является более восприимчивой к поломки во время инъекции.
- Следующим шагом в создании пипетки является создание гладкой конической путем обострения наконечник на алмаз заточки колеса. Во время резки пипетки до соответствующего размера, пипетки часто ломается с природными скос на его конце, которая должна использоваться при размещении пипетки на колесе. Во время этого процесса, важно, чтобы мягко остальные пипеткой на резкость колесо и периодически переоценивать, чтобы убедиться, пипетки еще касается колес (как конические становится более гладкой, он потеряет контакт с обострением колесо).
- Как только скос гладкий, кончиком пипетки должны быть заточены (рис. 1). Поднимите пипетку так, что она больше не прикасаться к обострению колесо, повернуть его по часовой стрелке на 10-50 градусов, и поместите обратно пипетки на вращающемся колесе для заточки ~ 10 секунд. Вывод из пипетки заточки колесо и теперь на краю. Этот шаг обычно необходимо повторить несколько небольших корректировок, чтобы создать острые края. Если пипетка находится на его краю слишком долго, это более вероятно развитие неровной поверхности (рис. 1). После завершения одной стороны, вы можете продолжить оттачивать противоположного края, повторяя шаги, описанные выше.
- Используйте маркер, чтобы нарисовать линию окружности каждые 4 мм, начиная где конусность пипетки начинается. Эти разграничения соответствуют 5uL объема.
2. В утробе матери в трансплантации
- После приготовления инъекционного материала (например, клетки, вирус и т.п.) можно настроить для инъекций. Мы используем microinjector подключен к сжатым воздухом со следующими настройками: (давления: ввод 60-80 фунтов на квадратный дюйм, заполнить 40 фунтов на квадратный дюйм, вводят 8-12 фунтов на квадратный дюйм, баланс 0 фунтов на квадратный дюйм, удерживайте нажатой клавишу 0 фунтов на квадратный дюйм; Время впрыска 100 миллисекунд).
- Для стерилизации инъекции пипетки, очистите его два раза с 70% этанола затем дважды стерильными 1X PBS. Как кончика пипетки очень хрупок, мы не рекомендуем автоклавирования инъекции пипеток.
- Инъекции может быть сделано с помощью 2.5X-3.5X увеличение лупы или рассекает микроскопом. Подготовьте процедуру области с потеплением одеяла, освещение, и необходимые хирургические инструменты.
- Обезболить беременной мыши (мы используем изофлуран и кислород доставляются через непрерывный блок анестезии потока). Место мыши на грелку в положении лежа и прикрепите каждой конечности с помощью ленты для безопасного мыши на место.
- Клип меха. Затем, надев стерильные хирургические перчатки, приготовительные живота с 10% повидон-йод затем алкоголь, и ввести обезболивающее, такие как бупренорфин.
- Сделать 1 см разрез в нижней части живота (самый низший аспект разреза должна быть примерно 1 см выше отверстие). Надрезать кожу и фасции. Будьте осторожны, чтобы не травмировать органов брюшной полости (кишечника и мочевого пузыря), которые сразу под тонким слоем фасции.
- Использование ватные тампоны, слегка растягивать фасции и доставить беременной матки через разрез. Подсчитать общее число плодов на первом определении правого и левого яичников, чтобы убедиться, визуализировать весь матки. Место матку обратно в брюшную полость, прежде чем продолжить, чтобы плоды остаются теплыми в то время как вы готовились к инъекции.
- Разработать соответствующий объем материала для числа плодов вы планируете внедрить. При заполнении иглы с образцом, важно сохранить пипетки погружается, чтобы избежать аспирации вашего образца в трубку microinjector. Так как клетки, как правило, в небольшом объеме, мы обычно размещают их в небольшом микроцентрифужную (например: 0,5 мл) трубки или непосредственно на листе парафильмом, чтобы иметь возможность заполнить иглу, не нарушая пипетки.
- Аккуратно прижмите каждого плода и определить часть плода вы планируете вводить (например, печени, брюшной полости, ноги и т.д.). С большим и указательным пальцем, вы должны стабилизировать плода в амниотической полости так, чтобы она не вращается, в то время как вы выполняете инъекции. Важно провести плод достаточно прочно, чтобы стабилизировать его еще мягко достаточно, чтобы избежать его повреждения.
- Аккуратно вставьте пипетку через матку, амнион, а кожу плода, а в органе-мишени. Если пипетка острый, она должна легко проходить через эти ткани. Если кончик пипетки скучно, вы ш заметите, места для палаток матки и околоплодные оболочки. Вводите желаемый объем в каждый плод. Крайне важно, чтобы ваши движения быть устойчивой во время вставки, инъекции, а также изъятия пипетки.
- Как только желаемый объем вводят, снять пипеткой тщательно. Если все сделано правильно, материал не должен просачиваться из амниотической полости или полости матки. Если большое отверстие создается в амнион, который можно узнать в результате утечки околоплодных вод, то выживание находится под угрозой. Наконец, для исследований, включающих послеродовой сбора урожая, все плоды должны получать технически совершенные инъекции, так как нет способа различить вводили и uninjected плода после рождения.
- Если вы выполняете инъекции в печени плода, вы можете иногда видеть кровь на кончике пипетки после того, как снята, это подтверждает, вы находитесь в правильном положении и не должны влиять на выживание. При выполнении внутригосударственных перитонеального инъекции, цель немного ниже фетальной печени. Для внутримышечных инъекций, возможно, положение плода для выявления бедра и бедренной кости и вводят ягодичные мышцы. Наконец, для внутрижелудочковой инъекции, то легко увидеть корональных швов на прямых пипеткой в соответствующие цели. Для этих инъекций, чуть больше пипетки калибра должны проникать черепа, не нарушая пипетки.
- Затем, осторожно поместите обратно в матку брюшной полости. Убедитесь, что он не перекручен на себе или вокруг его кровоснабжения. Доставка 1 мл стерильного 1X PBS в брюшной полости матери, чтобы заменить какой-либо жидкости, которая была утеряна во время процедуры. Закрыть разрез в 2 слоя с 5-0 плетеные рассасывающиеся нити (например: Викрил). Сначала закройте фасции, не повредив основной кишечника или мочевого пузыря, а затем закройте кожи.
- В это время, после процедуры препараты могут быть введены для обезболивания. Вернуться каждой женщины вводили в свои индивидуальные клетки и поместить клетку на потепление одеяло. Монитор мыши, пока она не в вертикальном положении. Положите постельные принадлежности в клетку и место мыши в тихом районе мыши учреждение, где она не должна быть нарушена (т.е. без клетки очистки) в течение нескольких дней после родов. Минимизация любого дополнительный стресс для животного будет уменьшить вероятность преждевременных родов.
- После завершения инъекции, очистки пипетки два раза стерильной 1X PBS и один раз 70% этанолом.
- Введенный женщины должны соблюдать ежедневно, чтобы обеспечить их восстановления после процедуры без труда. Разрез необходимо контролировать для набухания, воспаления, раны разделения, и другие признаки инфекции. Послеоперационные анальгетики могут вводиться по мере необходимости.
3. Представитель Результаты:
Выживание вводят плода до срока доставки является основным ограничивающим фактором для достижения успеха в этой технике. В зависимости от материала и вводили мыши используется, выживаемость может меняться. В общем, инъекции кроветворных клеток в мышей дикого типа на E14 должно привести, по крайней мере 50% живых новорожденных щенков. Более высокие показатели выживаемости возможны в зависимости как от технических аспектов инъекции, а также характеристики мышей время инъекции.
Сведение к минимуму травмы матки и околоплодных мембран является наиболее важным техническим аспектом данного протокола. Sharp, маленькие пипетки калибра приведет к минимальным матки травмы во время инъекции. Мы не рекомендуем использовать стандартные иглы инъекции в качестве калибра быстровозводимых иглы слишком велик и может привести к большим отверстием в матку. Ручной пипетки инъекции стекла лишь небольшие иглы калибра, которые могут быть использованы для внутриутробно инъекций. Тщательная и кропотливая хирургической техники, в том числе бережное обращение матки и короткие анестезии также имеет решающее значение для достижения оптимального результата.
Конкретные характеристики получателя мышей, таких как генетический фон, гестационный возраст, и приплода также может влиять на выживание. Некоторые штаммы мышей более восприимчивы к преждевременным родам и беременности потери в зависимости от их генетического фона. 15 трансгенных животных с мышечной или нейродегенеративных дефекты могут иметь нарушения способности обеспечить плодов вагинально после прохождения срединной лапаротомии. 8 Эти беременных самок может потребовать доставки кесарево сечение. Мы также обнаружили, что гестационный возраст на момент инъекции могут повлиять на жизнеспособность. Плоды, которые моложе, чем эмбриональные 12 день имеют более низкие показатели выживаемости, чем старше плодов. Наконец, мы обнаружили, что большие размеры помета (> 10 плодов), как правило, имеют более высокий уровень гибели плода после инъекции. Внимание как технические аспекты этого метода и специфики мышей внедряемому может максимизировать выживание вводят плодов.
ve_content "> Когда эти методы выполнены правильно, то можно ожидать, что все плоды подвергаются вводят материала. Как и в послеродовой установка, однако, успешной доставки клеток или вирусов внутриутробно не всегда приводит к донорам приживления клеток или генов выражении, соответственно. приживления стволовых клеток, например, зависит от нескольких факторов, таких как доза и источник пересаженных клеток. Кроме того, успех вирусной трансдукции, в частности, определяется типом вирусного вектора используется. Нужно понять, многочисленные факторы, которые влияют щенка выживания, сотовые приживления и вирусных трансдукции, чтобы добиться успеха с этим протоколом.
Рисунок 1. Диаграмма изображением надлежащего обострение инъекции пипетки (шаг 1.4)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Более 50 лет назад, Биллингем, Брент, и Medawar использовать внутриутробно трансплантации у мышей, чтобы побудить иммунную толерантность к чужеродных белков. 16 С того времени, несколько разновидностей этого метода были использованы для решения вопросов в области иммунологии и биологии стволовой клетки.
Протокол подробно описаны здесь является одним из наиболее доступных методов МСА. Фетальной печени предлагает легко визуализировать цель и обеспечивает доступ к большой круг кровообращения через портал и печеночных вен. Тем не менее, некоторые изменения были описаны для того, чтобы оптимизировать сроки и место проведения желаемого инъекций. Например, инъекции у плода в возрасте до E13.5 может быть труднее, потому что матка не является прозрачной. Если этот подход необходимо изучить более ранние события в развитии, УЗИ наведением инъекции могут быть использованы для целевой частности тканей. 17 Ультразвуковое руководство также полезно прямой инъекции в частности органов, таких как сердце или легкие. Внутривенные инъекции в вену желточного 18,19 предлагаем преимущество доставки клеток непосредственно в обращении и может позволить на поставку больших объемов клеток 5. Мы намеренно описан общий подход к выполнению МСА у мышей таким образом, чтобы читатель необходимой основой для достижения успеха с этими инъекциями и могут адаптировать эти методы для конкретного применения требуется.
Несмотря на свое первоначальное использование для изучения иммунной толерантности более 50 лет назад, Есть еще важные вопросы без ответов, для которых ИТУ будет поучительно. Способностью индуцировать толерантность к конкретным чужеродных антигенов на их внедрение в эмбриональной среды была продемонстрирована на мышах. 4,6,7 В то время как мыши плода иммунная система развивается позже, чем у более крупных животных и могут повлиять на этот вывод, точные механизмы, с помощью который плода толерантности происходит у мышей, необходимо изучить в дальнейшем. Такие эксперименты могут выяснить пути улучшения толерантности индукции в организме человека. Даже у мышей, такие факторы, как наличие гемопоэтических ниши и конкурентное преимущество клеток-хозяев по-прежнему ограничивают успех приживления стволовых клеток. 3 в настоящее время стратегии для дальнейшего изучения этой манипуляции включают конкретные механизмы иммунного ответа и оптимизации маршрута, сроки и дозы стволовых доставки клеток. ИТУ и в начале беременности мышей обеспечивает идеальную модель, в которой для изучения стволовых приживление и дифференцировку клеток.
МСА является мощным инструментом для понимания основных вопросов в области стволовых клеток и биологии развития. Определение механизмов, которые приводят к плода толерантности к антигенам введен в внутриутробно будет иметь серьезные последствия для области трансплантации стволовых клеток. Кроме того, успешная сдача вирусных векторов может обеспечить лечение для одного нарушения гена. Наличие многочисленных трансгенных и мутантных штаммов мыши позволяет расследование роль определенных генов играют изменить ожидается фенотипа. Мышиной модели ИТУ, несомненно, будет продвигать эти поля и приблизит нас к реализации их полный клинический потенциал для лечения больных с врожденными аномалиями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность нашим источникам финансирования: Калифорнийский Институт регенеративной медицины Клиническая член Обучение Грант (), Национальный научный фонд (МВт), Ирен Perstein премии (ТКМ), Американской коллегии хирургов (ТКМ), американский детской хирургической ассоциации ( ТКМ) и марте Dimes (TCM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipettes | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-30 | |
| Microinjector | Narishige International | IM-300 | |
| Pipette sharpener | Sutter Instrument Co. | Model BV-10 |
References
- Flake, A. W. Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow. N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).
- Wengler, G. S. In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI). Lancet. 348, 1484-1487 (1996).
- Flake, A. W., Zanjani, E. D. in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers. Blood. 94, 2179-2191 (1999).
- Merianos, D. J. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).
- Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation. Blood. 109, 1331-1333 (2007).
- Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice. J Surg Res. 77, 1-5 (1998).
- Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras. Blood. 112, 5245-5253 (2008).
- Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice. J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).
- Hayashi, S. Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy. Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).
- Bouchard, S. Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice. J Gene Med. 5, 941-950 (2003).
- Meza, N. W. Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme. Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).
- MacKenzie, T. C. Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes. Mol Ther. 6, 349-358 (2002).
- MacKenzie, T. C. Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors. J Gene Med. 7, 50-58 (2005).
- Sabatino, D. E. Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice. Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).
- Mellor, A. L., Munn, D. H. Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression. Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, 603-606 (1953).
- Endo, M. Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector. Mol Ther. 15, 579-587 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer. Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).
