Summary
माउस के मॉडल
Protocol
1. इंजेक्शन pipettes तैयार
- जैसे कि कांच विंदुक की जुदाई 15 सेकंड (निर्माता अंशांकन के बारे में निर्देश देखने के) के भीतर होता है विंदुक खींचने जांचना. विंदुक एक घटना जहां यह अलग होगा.
- ऐसी है कि घटना की शुरुआत से विंदुक के अंत दूरी 1.05cm के लिए 1.04cm है विंदुक के अंत कट. विंदुक की लंबाई inversely विंदुक छिद्र के कैलिबर के लिए आनुपातिक है. पता है कि अब विंदुक बनाने भी एक कमजोर टिप है कि इंजेक्शन के दौरान टूटना करने के लिए अतिसंवेदनशील है में परिणाम.
- विंदुक बनाने में अगले कदम के लिए एक हीरे sharpening पहिया पर टिप sharpening एक चिकनी बेवल बनाने के लिए है. उचित आकार के विंदुक काटने के समय, पिपेट अक्सर अपने नोक पर एक प्राकृतिक बेवल है जो जब पहिया पर विंदुक रखने इस्तेमाल किया जाना चाहिए के साथ टूट जाता है. इस प्रक्रिया के दौरान, यह महत्वपूर्ण है धीरे sharpening पहिया पर विंदुक आराम और समय - समय पर यकीन है कि विंदुक अभी भी पहिया छू रहा है (के रूप में बेवल चिकनी हो जाता है, यह sharpening पहिया के साथ संपर्क खो देंगे) बनाने का पुनर्मूल्यांकन.
- एक बार बेवल चिकनी है, पिपेट टिप (चित्रा 1) तेज किया जाना चाहिए. जैसे कि यह अब sharpening पहिया छू रहा है विंदुक तरक्की घुमाने के लिए, यह 10-50 डिग्री से दक्षिणावर्त, और घूर्णन ~ 10 सेकंड के लिए sharpening पहिया पर वापस विंदुक जगह. Sharpening पहिया से विंदुक वापस लेने और अब बढ़त की जांच. यह कदम आम तौर पर कई छोटे समायोजन के साथ दोहराया जाना चाहिए एक तेज बढ़त बनाने. यदि विंदुक भी लंबे समय के लिए किनारे पर रखा गया है, तो इसे और अधिक एक असमान सतह (चित्रा 1) विकसित होने की संभावना है. एक पक्ष को पूरा करने के बाद, आप करने के लिए ऊपर के चरणों को दोहरा द्वारा विपरीत बढ़त पैनापन आगे बढ़ सकते हैं.
- एक स्थायी मार्कर का उपयोग करने के लिए 4mm हर शुरू जहां पिपेट की घटना शुरू होता है एक परिधीय रेखा खींचना. ये demarcations मात्रा के 5uL के अनुरूप.
2. Utero ट्रांसप्लांटेशन में
- इंजेक्शन सामग्री (उदाहरण के लिए, कोशिकाओं, वायरस, आदि) की तैयारी करने के बाद आप इंजेक्शन के लिए सेट कर सकते हैं. हम निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ संपीड़ित हवा से जुड़ा microinjector का उपयोग करें: (दबाव सेटिंग्स: इनपुट 60-80 साई, 40 साई भरने, 8-12 साई, संतुलन साई 0 इंजेक्षन, साई 0 पकड़, इंजेक्शन समय 100 मिसे).
- इंजेक्शन पिपेट बाँझ, इसे दो बार साफ 70% द्वारा बाँझ 1X पीबीएस के साथ दो बार पीछा EtOH के साथ. विंदुक के टिप के रूप में बहुत ही नाजुक है, हम इंजेक्शन pipettes autoclaving सिफारिश नहीं है.
- इंजेक्शन या तो 2.5X 3.5X बढ़ाई loupes या एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है. एक वार्मिंग कंबल, प्रकाश व्यवस्था, और आवश्यक सर्जिकल उपकरणों के साथ अपने प्रक्रिया क्षेत्र तैयार.
- गर्भवती माउस (हम isoflurane और ऑक्सीजन एक सतत प्रवाह संज्ञाहरण इकाई के माध्यम से दिया उपयोग) anesthetize. ढालुआं स्थिति और प्रत्यय में एक हीटिंग टेप के साथ प्रत्येक अंग के लिए जगह में माउस सुरक्षित पैड पर माउस रखें.
- फर क्लिप. फिर, बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहने हुए, प्रस्तुत करने के साथ 10% povidone आयोडीन शराब द्वारा पीछा किया, और buprenorphine के रूप में एक एनाल्जेसिक ऐसे इंजेक्षन पेट.
- पेट के निचले हिस्से (चीरा के सबसे अवर पहलू introitus से बेहतर 1cm लगभग होना चाहिए) में 1cm चीरा बनाओ. त्वचा और प्रावरणी पाछना. पेट अंगों (आँतों और मूत्राशय) जो प्रावरणी की पतली परत के तहत तुरंत घायल नहीं सावधान रहो.
- कपास swabs का प्रयोग, धीरे प्रावरणी खिंचाव और चीरा के माध्यम से gravid गर्भाशय देने. पहली बार सही और बाएँ अंडाशय की पहचान सुनिश्चित करें कि आप पूरे गर्भाशय को कल्पना करने से भ्रूण की कुल संख्या की गणना. गर्भाशय वापस उदर गुहा में इससे पहले कि तुम इतना आगे बढ़ना है कि भ्रूण गर्म रहते हुए भी आप इंजेक्शन के लिए तैयार प्लेस.
- भ्रूण आप इंजेक्षन योजना की संख्या के लिए सामग्री की उचित मात्रा ड्रा. जबकि अपने नमूने के साथ सुई भरने, यह विंदुक टिप microinjector टयूबिंग में अपने नमूना aspirating से बचने के लिए पानी में डुबोया हुआ रखने के लिए महत्वपूर्ण है. के बाद से कोशिकाओं को एक छोटी मात्रा में आम तौर पर कर रहे हैं, हम आम तौर पर उन्हें एक छोटी सी microfuge में जगह (पूर्व: 0.5ml) या Parafilm विंदुक टिप को तोड़ने के बिना सुई भरने में सक्षम होना का एक टुकड़ा पर सीधे ट्यूब.
- धीरे पकड़ प्रत्येक भ्रूण और भ्रूण आप इंजेक्षन योजना (जैसे जिगर, peritoneal गुहा, पैर, आदि) का हिस्सा की पहचान. अपने अंगूठे और तर्जनी के साथ, आप amniotic गुहा के भीतर भ्रूण स्थिर इतना है कि यह जब तुम इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं बारी बारी से नहीं करता है चाहिए. यह मजबूती के लिए यह अभी तक धीरे यह हानिकारक से बचने के काफी स्थिर करने के लिए पर्याप्त भ्रूण पकड़ करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- ध्यान से गर्भाशय, amnion, और भ्रूण त्वचा के माध्यम से विंदुक सम्मिलित करते हैं, और लक्ष्य अंग में. यदि विंदुक तेज है, यह आसानी से इन ऊतकों के माध्यम से पारित करना चाहिए. यदि विंदुक टिप सुस्त है, तो आप वाई गर्भाशय और amniotic झिल्ली के नोटिस tenting करूँगा. प्रत्येक भ्रूण में वांछित मात्रा इंजेक्षन. यह जरूरी है कि अपने आंदोलनों सम्मिलन, इंजेक्शन, और विंदुक की वापसी के समय के दौरान स्थिर हो.
- एक बार इच्छित मात्रा इंजेक्शन है, पिपेट ध्यान से वापस लेने. अगर ठीक से किया है, सामग्री एमनियोटिक गुहा या गर्भाशय से बाहर लीक नहीं होना चाहिए. यदि एक बड़ा छेद amnion, जो एक amniotic द्रव का रिसाव के द्वारा पहचान सकते हैं बनाया है, तो अस्तित्व खतरे में पड़ जाता है. अंत में, अध्ययन है कि प्रसव के बाद कटाई शामिल के लिए, सभी भ्रूण तकनीकी रूप से सही इंजेक्शन प्राप्त के बाद से वहाँ कोई रास्ता है जन्म के बाद इंजेक्शन और uninjected भ्रूण विचार.
- यदि आप भ्रूण जिगर में इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं, तुम कभी कभी विंदुक टिप में खून देख सकते हैं के बाद इसे वापस ले लिया इस पुष्टि है कि तुम सही स्थिति में हैं और अस्तित्व को प्रभावित नहीं होना चाहिए. यदि अंतर peritoneal इंजेक्शन प्रदर्शन, भ्रूण जिगर से थोड़ा नीचे उद्देश्य. Intramuscular इंजेक्शन के लिए, आप भ्रूण की स्थिति कूल्हे और जांध की हड्डी की पहचान और gluteus मांसपेशियों इंजेक्षन कर सकते हैं. अंत में, intraventricular इंजेक्शन के लिए, यह आसान है राज्याभिषेक sutures के देखने के लिए उपयुक्त लक्ष्य विंदुक प्रत्यक्ष. इन इंजेक्शनों के लिए, थोड़ा बड़ा कैलिबर pipettes विंदुक को तोड़ने के बिना खोपड़ी घुसना करने के लिए आवश्यक हैं.
- अगला, ध्यान से गर्भाशय के उदर गुहा में वापस जगह है. यकीन है कि वह खुद को या अपने संवहनी आपूर्ति के आसपास नहीं मुड़ जाता है बनाओ. माँ peritoneal गुहा में बाँझ 1X पीबीएस के 1ml उद्धार करने के लिए किसी भी तरल पदार्थ है कि प्रक्रिया के दौरान खो गया था की जगह. 5-0 लट absorbable सिवनी (: Vicryl पूर्व) के साथ 2 परतों में चीरा को बंद करें. पहले प्रावरणी अंतर्निहित आंत्र या मूत्राशय घायल बिना बंद है, और तब त्वचा बंद.
- इस समय, के बाद प्रक्रिया दवाओं analgesia के लिए प्रशासित किया जा सकता है. अपने स्वयं के व्यक्तिगत पिंजरे प्रत्येक इंजेक्शन महिला वापसी और एक वार्मिंग कंबल पर पिंजरे जगह है. माउस मॉनिटर जब तक यह ईमानदार है. पिंजरे में बिस्तर रखो माउस और माउस सुविधा जहां यह (कोई पिंजरे सफाई यानी) प्रसव के बाद कई दिनों तक परेशान नहीं किया जाना चाहिए के एक शांत क्षेत्र में जगह. पशुओं के लिए कोई अतिरिक्त तनाव कम से कम अपरिपक्व प्रसव के अवसरों को कम करेगा.
- एक बार जब आप इंजेक्शन पूरा कर लिया है, अपने विंदुक बाँझ 1X पीबीएस के साथ दो बार और एक बार के साथ 70% EtOH साफ.
- इंजेक्ट महिलाओं दैनिक मनाया जाना चाहिए करने के लिए कठिनाई के बिना बीमा के लिए वे प्रक्रिया से उबर रहे हैं. चीरा सूजन संक्रमण, सूजन, घाव, जुदाई, और अन्य संकेत के लिए निगरानी की जानी चाहिए. पोस्ट ऑपरेटिव दर्दनाशक दवाओं के रूप में की जरूरत प्रशासित किया जा सकता है.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
अवधि के प्रसव के लिए इंजेक्शन fetuses के जीवन रक्षा मुख्य सीमित इस तकनीक के साथ सफलता प्राप्त करने के कारक है. सामग्री इंजेक्शन और माउस का इस्तेमाल किया जा रहा है तनाव पर निर्भर करता है, जीवित रहने की दरों में भिन्न हो सकते हैं हैं. सामान्य में, E14 में जंगली प्रकार चूहों में hematopoietic कोशिकाओं के इंजेक्शन कम से कम 50% रहने जन्मे पिल्ले में परिणाम चाहिए. जीवित रहने की उच्च दर दोनों इंजेक्शन के तकनीकी पहलुओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चूहों अंतःक्षिप्त किया जा रहा की विशेषताओं के आधार पर संभव हो रहे हैं.
गर्भाशय और amniotic झिल्ली के लिए आघात के कम से कम इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण तकनीकी पहलू है. तीव्र, छोटे कैलिबर pipettes इंजेक्शन के दौरान कम से कम गर्भाशय आघात में परिणाम देगा. हम पूर्व गढ़े सुइयों के कैलिबर के रूप में मानक इंजेक्शन सुई का उपयोग कर की सिफारिश नहीं बहुत बड़ी है और गर्भाशय में एक बड़ा छेद में नतीजा होगा. हाथ तैयार की जाती गिलास इंजेक्शन pipettes केवल छोटे कैलिबर सुइयों कि utero इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जा सकता हैं. सावधान और सतर्क गर्भाशय और एक छोटी चतनाशून्य करनेवाली औषधि के कोमल से निपटने सहित शल्य चिकित्सा तकनीक, यह भी इष्टतम परिणामों के लिए महत्वपूर्ण है.
आनुवंशिक पृष्ठभूमि, gestational उम्र, और कूड़े के आकार जैसे प्राप्तकर्ता चूहों के विशिष्ट विशेषताओं को भी अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं. चूहों के कुछ उपभेदों अधिक preterm परिश्रम और गर्भावस्था हानि अपने आनुवंशिक पृष्ठभूमि के आधार पर करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं मांसपेशियों या neurodegenerative दोष के साथ 15 ट्रांसजेनिक जानवरों एक भ्रष्ट vaginally midline laparotomy के दौर से गुजर के बाद भ्रूण को देने की क्षमता हो सकता है. ये आठ गर्भवती महिलाओं द्वारा प्रसव की आवश्यकता हो सकती है सीजेरियन सेक्शन. हम यह भी पाया गया है कि इंजेक्शन के समय पर gestational उम्र व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है. Fetuses कि भ्रूण दिन 12 की तुलना में छोटी हैं पुराने भ्रूण से कम जीवित रहने की दर है. अंत में, हमने पाया है कि बड़े कूड़े के आकार (> 10 भ्रूण) के इंजेक्शन के बाद भ्रूण निधन की उच्च दर है करते हैं. इस तकनीक के दोनों तकनीकी पहलुओं और इंजेक्शन भ्रूण के अस्तित्व को अधिकतम कर सकते हैं चूहों अंतःक्षिप्त की विशिष्ट विशेषताओं को ध्यान है.
"ve_content> जब इन तरीकों को सही ढंग से प्रदर्शन कर रहे हैं, एक कि सभी भ्रूण इंजेक्शन सामग्री को उजागर कर रहे हैं उम्मीद प्रसवोत्तर सेटिंग की तरह कर सकते हैं., तथापि, या utero में कोशिकाओं और वायरस के सफल प्रसव हमेशा दाता सेल engraftment या जीन में परिणाम नहीं करता है अभिव्यक्ति, क्रमशः स्टेम कोशिकाओं के engraftment, उदाहरण के लिए, खुराक और प्रतिरोपित कोशिकाओं के स्रोत के रूप में कई कारकों पर निर्भर करता है इसी प्रकार, वायरल पारगमन की सफलता के हिस्से में है, वायरल सदिश का इस्तेमाल किया प्रकार के द्वारा निर्धारित है. एक कई कारकों है कि प्रभाव पिल्ला अस्तित्व, सेलुलर engraftment, और वायरल पारगमन इस प्रोटोकॉल के साथ सफलता हासिल करने के लिए समझना चाहिए.
1 चित्रा आरेख. इंजेक्शन pipettes (1.4 चरण) sharpening उचित चित्रण
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Discussion
से अधिक 50 साल पहले, billingham, ब्रेंट, और Medawar चूहों में utero प्रत्यारोपण में इस्तेमाल के लिए विदेशी प्रोटीन के लिए प्रतिरक्षा सहिष्णुता प्रेरित उस समय के बाद से. 16, इस तकनीक के कई रूपों इम्यूनोलॉजी और स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में सवालों के पते के लिए इस्तेमाल किया गया है.
यहाँ विस्तृत प्रोटोकॉल IUT के लिए सबसे सुलभ तरीके है. भ्रूण जिगर आसानी से कल्पना लक्ष्य प्रदान करता है और पोर्टल और यकृत नसों के माध्यम से प्रणालीगत संचलन के लिए पहुँच प्रदान करता है है. हालांकि, कई संशोधनों के क्रम में करने के लिए और इच्छित इंजेक्शन के समय और स्थान का अनुकूलन वर्णित किया गया है. उदाहरण के लिए, E13.5 की तुलना में छोटी भ्रूण में इंजेक्शन और अधिक मुश्किल हो सकता है क्योंकि गर्भाशय पारदर्शी नहीं है. यदि इस दृष्टिकोण के विकास में पहले की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है, अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन के लिए विशेष ऊतकों लक्ष्य इस्तेमाल किया जा सकता है 17 अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन भी उपयोगी है हृदय या फेफड़ों के रूप में विशेष अंगों में इंजेक्शन प्रत्यक्ष. Vitelline 18,19 नस में अंतःशिरा इंजेक्शन कोशिकाओं संचलन में सीधे पहुंचाने का लाभ प्रदान करते हैं और कक्षों की बड़ी मात्रा के वितरण के लिए अनुमति दे सकता है 5. हम जानबूझकर चूहों में IUT प्रदर्शन के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण वर्णित है कि पाठक है आवश्यक नींव इन इंजेक्शनों के साथ सफलता हासिल करने के लिए और कर सकते हैं विशिष्ट आवश्यक आवेदन करने के लिए इन तरीकों दर्जी.
50 साल पहले प्रतिरक्षा सहिष्णुता का अध्ययन अपनी प्रारंभिक उपयोग के बावजूद, वहाँ अभी भी महत्वपूर्ण अनुत्तरित सवाल है जिसके लिए IUT शिक्षाप्रद हो जाएगा रहे हैं. भ्रूण वातावरण में विशिष्ट विदेशी एंटीजन को सहिष्णुता उनके परिचय द्वारा प्रेरित करने की क्षमता चूहों में किया गया प्रदर्शन किया है 4,6,7 जबकि माउस भ्रूण प्रतिरक्षा प्रणाली कि बड़े जानवरों की तुलना में बाद में विकसित और द्वारा इस खोज, सटीक तंत्र प्रभाव हो सकता है जो भ्रूण सहिष्णुता होता है में चूहों के लिए आगे अध्ययन करने की आवश्यकता है. इस तरह के प्रयोगों मानव में सहिष्णुता प्रेरण में सुधार के तरीकों को स्पष्ट कर सकता है. यहां तक कि चूहों में, hematopoietic niches के उपलब्धता और मेजबान कोशिकाओं के प्रतियोगी लाभ के रूप में इस तरह के कारकों स्टेम सेल engraftment की सफलता को सीमित करने के लिए जारी 3 वर्तमान रणनीतियों को आगे की जांच इस मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विशिष्ट तंत्र से छेड़छाड़ और मार्ग अनुकूलन शामिल, समय, और स्टेम सेल डिलीवरी की खुराक. जल्दी हमल चूहों में IUT एक आदर्श मॉडल है जिसमें स्टेम सेल engraftment और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है.
IUT स्टेम सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में मौलिक मुद्दों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. तंत्र है जो utero में शुरू एंटीजन को भ्रूण सहिष्णुता के लिए नेतृत्व को परिभाषित करने से स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के क्षेत्र के लिए प्रमुख प्रभाव पड़ेगा. इसके अलावा, वायरल vectors के सफल प्रसव के एकल जीन विकारों के लिए उपचार प्रदान कर सकते हैं. कई ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती माउस उपभेदों की उपलब्धता की भूमिका में जांच के विशिष्ट जीन की उम्मीद phenotype बदल खेलने के लिए अनुमति देता है. IUT के माउस मॉडल निस्संदेह इन क्षेत्रों अग्रिम और हमें उनके जन्मजात विसंगतियों के साथ रोगियों के उपचार के लिए पूर्ण नैदानिक क्षमता को साकार करने के लिए करीब लाने.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम हमारे वित्तपोषण स्रोतों को स्वीकार करना चाहते हैं: कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट ऑफ पुनर्योजी चिकित्सा क्लीनिकल फैलो प्रशिक्षण अनुदान के लिए (एक), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (मेगावाट), Irene Perstein पुरस्कार (TCM), सर्जन के अमेरिकी कॉलेज (TCM), अमेरिकी बाल चिकित्सा सर्जिकल एसोसिएशन ( टीसीएम), और ऑफ डाइम्स (टीसीएम) के मार्च.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipettes | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-30 | |
| Microinjector | Narishige International | IM-300 | |
| Pipette sharpener | Sutter Instrument Co. | Model BV-10 |
References
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