Summary
의 마우스 모델
Abstract
utero의 줄기 세포와 바이러스의 이식은 인간의 태아에서 선천성 질환 치료를위한 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포의 utero 이식 (IUT)에 성공적으로 여러 가지 다른 조건에서 심한 결합 면역 결핍. 1,2 환자 치료에 사용되고 있습니다, 그러나, IUT는 성공하지 않고 시도했습니다. 3이 혼합 결과를 감안할 때, 가용성 간세포 이식 및 유전자 치료의 생물 학적 sequelae을 공부하는 효율이 아닌 인간의 모델이 분야의 발전을 위해 중요합니다. 우리와 다른 야생 형 생쥐 4-7과 유전 질환있는 사람 모두 utero에 이식 조혈 줄기 세포의 성공적인 engraftment에 영향을 미치는 요인 연구를 IUT의 마우스 모델을 사용하고 있습니다. 8,9 태아의 환경은 또한에 대한 상당한 이점을 제공 utero의 유전자 치료에 성공. 예를 들어, adenoviral 10 전달, 태아에 12,13 adeno - 관련 11 retroviral, 10 바이러스 및 lentiviral 벡터는 장기적인 유전자 발현과 주입의 사이트에서 멀리 떨어진 여러 장기의 도입 결과입니다. utero에 유전자 치료는 따라서 이러한 근육 영양 장애 또는 낭성 섬유증과 같은 단일 유전자 질환에 대한 가능한 치료 전략으로 간주됩니다. IUT의 또 다른 잠재적인 장점은 특정 항원에 면역 내성을 유발하는 능력입니다. 으로 혈우병,이 단백질에 내성의 초기 개발 결과에 팩터 IX의 도입과 생쥐에서 본. 14
잠재적인 인간의 치료법을 조사에서의 사용뿐만 아니라, IUT의 마우스 모델은 발달과 줄기 세포 생물학의 기본적인 질문을 연구하는 강력한 도구가 될 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 유도 또는 억제 특정 유전자 발현을 정의 임신 성 단계에서 발달 경로를 조작하는 여러 작은 분자를 제공할 수 있습니다. 이러한 변경의 영향은 초기 이식 후 다양한 timepoints에서 평가하실 수 있습니다. 또한, 하나는 비 조사 및 교란되지 않은 호스트 환경에서 줄기 세포 분화 연구를 태아 환경에 pluripotent 또는 혈통 특정 전구 세포를 이식 수 있습니다.
IUT의 마우스 모델은 이미 면역학 분야, 그리고 발달과 줄기 세포 생물학 내에 많은 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 동영상 기반의 프로토콜에서는, 우리는 마우스 fetuses의 IUT를 수행하기위한 단계별 접근 방식을 설명하고 중요한 단계이 기술의 잠재적인 함정을 설명합니다.
Protocol
1. 사출 Pipettes의 준비
- 유리 피펫의 분리가 15 초 (교정에 대한 제조 업체의 지침을 참조) 내에서 발생하는 등 피펫 끌어당기는을 보정합니다. 피펫은 구분 테이퍼를해야합니다.
- 테이퍼의 처음부터 피펫의 끝에 거리는 1.05cm에 1.04cm입니다 같은 피펫의 끝을 잘라. 피펫의 길이는 피펫 오리피스의 구경에 반비례합니다. 이상 피펫을 만드 는게 아니라 주사 중에 파손 더 쉽습니다 약한 팁 결과는 점에 유의하십시오.
- 피펫을 만드는 다음 단계는 다이아몬드가는 바퀴에 팁을 선명하여 부드러운 베벨을 만드는 것입니다. 적절한 크기로 피펫을 절단 당시, 피펫은 종종 바퀴에 피펫을 게재할 때 사용해야 그 끝에 자연 베벨과 함께 나옵니다. 이 과정에서, 그것은 부드럽게 선명하게 바퀴에 피펫을 휴식과 정기적으로 피펫 아직도 바퀴를 감동이다 (베벨이 부드럽게되면서, 그것은 선명하게 바퀴와 접촉을 잃게됩니다) 확인을 다시 평가하는 것이 중요합니다.
- 베벨은 부드러운되면, 피펫 팁은 (그림 1) 날카롭게해야합니다. 그것이 더 이상 선명하게 바퀴를 만지지 않습니다 그러한 피펫을 향상, 그것이 10-50도로 시계 방향으로 회전하고, ~ 10 초 동안 회전 선명하게 바퀴에 피펫을 돌려 놓으십시오. 선명하게 바퀴에서 피펫을 철회하고 지금은 가장자리를 검사합니다. 이 단계는 일반적으로 날카로운 모서리를 만드는 몇 가지 작은 조정 반복해야합니다. 피펫 너무 오랫동안의 가장자리에 배치하는 경우, 그것은 고르지 표면 (그림 1)을 개발 가능성이 더 높습니다. 한쪽을 완료 후, 위의 단계를 반복하여 반대 가장자리를 선명하게 진행할 수 있습니다.
- 모든 4mm 피펫의 테이퍼의 시작부터 원주 라인을 그릴 수있는 영구 마커를 사용합니다. 이러한 demarcations은 볼륨 5uL 일치합니다.
2. Utero 이식에
- 주사용 재료 (예 : 세포, 바이러스 등)을 준비하면 당신은 주사를 설정할 수 있습니다. 우리는 다음과 같은 설정으로 압축 공기에 연결된 microinjector를 사용합니다 (압력 설정 : 입력 60-80 PSI 0 PSI를 개최, 8-12 PSI, 균형 공 PSI를 주사 40 PSI를 작성, 사출 시간 100 밀리초).
- 사출 피펫을 소독하기 위해 멸균 1X PBS로 두 번 다음에 70 % EtOH로 두 번 닦아주십시오. 피펫의 끝은 매우 불안정으로, 우리는 사출 pipettes를 autoclaving하지 않는 것이 좋습니다.
- 주사는 어느 2.5X - 3.5X 배율 loupes 또는 해부 현미경을 사용하여 수행할 수 있습니다. 온난 화 담요, 조명, 필요한 수술 도구와 절차 영역을 준비합니다.
- 임신 마우스를 (우리는 지속적인 흐름의 마취 장치를 통해 전달 isoflurane과 산소를 활용) 마취. 장소에 마우스를 확보하기 위해 테이프 각 사지 부정사 위치와 부착에 가열 패드에서 마우스를 놓으십시오.
- 모피를 클립. 그럼, 준비 10 % povidone - 요오드 알코올에 의해 다음과 buprenorphine 같은 진통제 같은 주사와 살균 수술 장갑을 복부 입고.
- 낮은 복부 (절개의 가장 열악한 부분이 introitus 약 1cm 우수해야합니다)에 1cm 절개를합니다. 피부와 근막을 절개. 근막의 얇은 층 아래에 바로있는 복부 장기 (창자와 방광) 해치다하지 않도록주의하십시오.
- 면화 면봉을 사용하여 부드럽게 근막을 스트레칭하고 절개를 통해 자궁 gravid을 제공합니다. 먼저이 전체 자궁을 시각화 있는지 확인하기 위해 오른쪽과 왼쪽 난소을 식별하여 fetuses의 총 수를 계산합니다. 당신이 주사를 준비하는 동안 fetuses 따뜻하고 남아 있도록 진행하기 전에 복강에 다시 자궁를 놓습니다.
- 당신이 주입하려는 fetuses의 번호에 대한 재료의 적절한 볼륨을 그립니다. 샘플로 바늘을 작성하는 동안, 그것은 microinjector 튜빙에 샘플을 aspirating 피하기 위해 물 속에 잠긴 피펫 팁을 유지하는 것이 중요합니다. 또는 직접 피펫 팁을 위반하지 않고 바늘을 채울 수 있도록 Parafilm의 조각에 튜브를 : 세포가 작은 볼륨에 일반적으로 있기 때문에, 우리는 보통 (0.5mL 예) 작은 microfuge 그들을 놓으십시오.
- 부드럽게 각각의 태아를 개최하고 삽입하려는 태아 (예 : 간, 복막 캐비티, 다리 등)의 부분을 식별합니다. 당신이 주사를 수행하는 동안 그것이 회전하지 않도록 엄지와 집게손가락으로, 당신은 amniotic 캐비티 내의 태아를 안정해야합니다. 부드럽게 충분히 손상을 방지하기 위해 아직 안정화 굳게 충분히 태아를 보유하는 것이 중요합니다.
- 조심스럽게 자궁, 양막과 태아 피부를 통해 피펫을 삽입하고, 대상 기관으로. 피펫이 날카로운 경우, 이러한 조직을 통해 쉽게 전달한다. 피펫 팁이 무딘 경우, WI 자궁과 amniotic의 점막의 통지 tenting는거야. 각 태아에 원하는 볼륨을 주사. 당신 움직임이 삽입, 사출 및 피펫의 철회의 시간 동안 지속하는 것이 필수적입니다.
- 원하는 볼륨이 분사되면 조심스럽게 피펫을 철회. 정상적으로 완료하면, 재료는 amniotic 캐비티이나 자궁에서 밖으로 누설해서는 안됩니다. 큰 구멍이 하나가 양수의 누출에 의해 인식할 수 양막에서 만들어지는 경우, 생존하려하지 않는다. 출산 후 주입 및 uninjected fetuses을 분별하는 방법이 없기 때문에 마지막으로, 출생 후의 수확 참여 연구, 모든 fetuses 기술적으로 완벽하게 주사를 받아야한다.
- 당신이 태아 간으로 주사를 수행하는 경우가 철회 -이 후, 당신은 때때로 피펫 팁의 혈액을 볼 수 있습니다 당신은 올바른 위치에 확인과 생존에 영향을 미치지 않습니다. 내부 복막 주사를 수행하는 경우, 약간 태아 간 다음 목표로하고 있습니다. 근육내 주사의 경우 엉덩이와 대퇴부를 파악하고 gluteus 근육 주사로 태아의 위치를 수 있습니다. 마지막으로, 심실 주사를 위해, 그것은 적절한 대상에 피펫을 직접하는 코로나 봉합을 쉽게 알 수 있습니다. 이 주사의 경우, 약간 큰 구경 pipettes은 피펫을 위반하지 않고 두개골을 뚫을 필요합니다.
- 다음, 복강으로 다시 자궁을 신중하게 배치하십시오. 그것이 자체 또는 그 혈관 공급 주변 트위스트 있지 않은지 확인하십시오. 절차를 수행하는 동안 손실되었습니다 어떤 액체를 대체하는 어머니의 복막에 고인 살균 1X PBS의 1mL를 제공합니다. 5-0 흡수성 봉합사 꼰 (Vicryl 예) 2 레이어의 절개를 닫습니다. 먼저 기본 창자 또는 방광 손상없이 근막을 닫은 다음 피부를 닫습니다.
- 이때, 사후 절차 약품은 진통제에 대한 관리하실 수 있습니다. 자체 개별 케이지 각 주입 여성 반환하고 온난 화 담요에 새장을 놓으십시오. 그것이 똑바로 때까지 마우스를 모니터합니다. 새장에 이불을 넣고 그것이 배달 후 몇 일 전에 (더 케이지 청소 즉 없음) 방해하지 않아야 마우스 시설의 조용한 지역에 마우스를 놓으십시오. 동물에 대한 추가적인 스트레스를 최소화하는 것은 preterm 노동의 기회를 감소합니다.
- 당신이 주사를 완료한 후, 멸균 1X PBS로 두 번 피펫을 청소하고 한 때 70 % EtOH.
- 주입 여성은 어려움없이 그들이 절차에서 회복 아르 보험 매일 관찰해야합니다. 절개는 감염의 부종, 염증, 상처 분리 및 기타 신호를 모니터링해야합니다. 필요에 따라 게시 수술 진통제가 시행됩니다.
3. 대표 결과 :
용어 배달에 주입 fetuses의 생존이 기술이 성공을 달성하기위한 주요 제한 요소입니다. 재료 주입 및 마우스가 사용되는 변형에 따라 생존 요금이 다를 수 있습니다. 일반적으로, E14에서 야생 형 생쥐에 조혈 세포의 주사는 최소 50 % 생활에서 태어난 새끼의 결과 것입니다. 생존의 높은 가격은 주사의 기술적 측면뿐만 아니라 주입되는 생쥐의 특성에 따라 모두 가능합니다.
자궁과 amniotic 세포막에 외상을 최소화하는 것이이 프로토콜의 가장 중요한 기술적인 측면이다. 샤프, 작은 구경의 pipettes은 주사하는 동안 최소한의 자궁 외상 발생합니다. 우리는 미리 가공 바늘의 구경이 같은 표준 주사 바늘을 사용하는 것이 좋습니다 너무 커서 자궁에 큰 구멍을 초래 하리라는하지 않습니다. 핸드 만들어진 유리 사출 pipettes은 utero 주사에 활용 될 수있는 유일한 작은 구경의 바늘입니다. 자궁 및 짧은 마취의 부드러운 핸들링을 포함하여 신중하고 세심한 수술 기술은 또한 최적의 결과를 위해 중요합니다.
이러한 유전자 배경, 임신 성 연령, 쓰레기 크기로받는 생쥐의 특정 특성도 생존에 영향을 줄 수 있습니다. 생쥐의 일부 변종들은 유전 배경에 따라 preterm 노동과 임신 손실에 더 민감한. 근육질 또는 neurodegenerative 결함과 함께 15 트렌스 제닉 동물 vaginally 정중선 개복술을받은 후 fetuses를 제공하는 장애인 능력을 가질 수 있습니다. 8이 임신한 암컷으로 배달을 요구할 수 있습니다 cesarean 섹션. 우리는 또한 주사시 임신 성 연령은 생존에 영향을 줄 수있는 것으로 확인되었습니다. 배아 일 12 세 미만 아르 Fetuses 나이가 fetuses보다 생존의 낮은 속도를했습니다. 마지막으로, 우리는 대형 쓰레기의 크기 (> 10 fetuses) 주사 후 태아 사망의 높은 속도를 가지고 경향 것으로 나타났습니다. 이 기법의 기술적 측면과 주입 fetuses의 생존을 극대화할 수 주입되는 생쥐의 특정 특성 모두에주의.
ve_content ">이 방법은 제대로 수행되는 경우, 하나는 모든 fetuses가 주입 물질에 노출되는 기대할 수 있습니다. 출생 후의 설정과 유사하지만, utero의 세포 또는 바이러스의 성공적인 전달은 항상 기증자 세포 engraftment 또는 유전자의 결과하지 않습니다 표현이, 각각. 줄기 세포의 engraftment 예를 들어, 같은 복용량과 이식 세포의 소스로 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 마찬가지로, 바이러스 전달의 성공은 부분적으로 사용되는 바이러스 벡터의 종류에 의해 결정됩니다. 하나는 충격 강아지 생존, 세포 engraftment 및 바이러스 전달이 프로토콜과 함께 성공을 달성하기 위해 그 수많은 요소를 이해해야합니다.
그림 1. 다이어그램은 사출 pipettes (1.4 단계)의 선명 적절한 장면을 묘사한
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Discussion
50 년 전, 빌링햄, 브렌트, 그리고 Medawar 외국 단백질에 면역 내성을 유발 생쥐에 utero 이식에 사용됩니다. 16은 그 이후,이 기술의 몇 가지 유사 콘텐츠는 면역학 및 줄기 세포 생물학 질문을 해결하기 위해 사용되었습니다.
여기에 자세한 프로토콜은 IUT에 가장 접근 방법 중 하나입니다. 태아 간은 쉽게 시각 목표를 제공하며 포털과 간장 정맥을 통해 순환 체계에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 몇 가지 수정이 원하는 사출의 타이밍과 위치를 최적화하기 위해 설명되었습니다. 자궁이 투명하지 않기 때문에 예를 들어, E13.5 미만 fetuses에 주사 더 어려울 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 개발에 앞서 이벤트를 공부하기 위해 필요한 경우, 초음파 유도 주사는 특정 조직을 대상으로 사용할 수 있습니다. 17 초음파지도는 또한 심장이나 폐 등 특정 기관,에 주사를 직접하는 데 유용합니다. vitelline 베인 18,19으로 정맥 주사는 혈액 순환에 직접 세포를 전달하는 장점을 제공하고 세포의 큰 볼륨의 전달을 위해 허용할 수 있습니다. 5 우리는 의도적으로 독자를 가지고 있으므로 생쥐의 IUT를 수행하는 일반적인 접근 방법을 설명했습니다 필요한 기초이 주사와 함께 성공을 달성하고 필요한 특정 애플 리케이션에 맞게이 방법을하실 수 있습니다.로
50 년 전 이상의 면역 내성을 연구하기 위해 최초의 사용에도 불구하고, IUT가 될지는 수있는 여전히 중요한 의문은 아직 남아 있습니다. 태아 환경에 자신의 소개에 의해 특정 외국 항원에 내성을 유발하는 기능은 생쥐에서 증명되었습니다. 4,6,7는 마우스 태아 면역 시스템이 나중에 더 큰 동물보다 개발하여이 찾는, 정확한 메커니즘에 영향을 미칠 수 있지만 쥐가 더 연구해야에 태아의 오차가 발생하는. 이러한 실험은 인간의 관용 유도를 개선하는 방법을 명료하게하다 수 있습니다. 심지어는 생쥐에서 이러한 조혈 틈새의 가용성 및 호스트 세포의 경쟁 우위와 같은 요소가 줄기 세포 engraftment의 성공을 제한하는 진행합니다. 자세한 조사를 3 현재 전략이, 호스트 면역 반응의 특정 메커니즘을 조작하고 경로를 최적화 포함 줄기 세포 전달의 타이밍, 그리고 복용량. 초기 형성 마우스로 IUT는 줄기 세포 engraftment과 차별을 공부하는 이상적인 모델을 제공합니다.
IUT는 줄기 세포 및 발달 생물학 분야에서 근본적인 문제를 이해하는 강력한 도구입니다. utero에서 소개 항원에 태아의 내성으로 이어지는 메커니즘을 정의하는 것은 줄기 세포 이식 분야에 대한 주요 영향을 것입니다. 또한, 바이러스 벡터의 성공적인 전달은 단일 유전자 장애에 대한 치료를 제공할 수 있습니다. 수많은 유전자 변형과 돌연변이 마우스 종자의 가용성은 특정 유전자가 예상 표현형을 변경하는 놀이의 역할에 조사를 위해 수 있습니다. IUT의 마우스 모델은 의심할 여지없이이 필드를 사전과 가까이 선천성 이상이 환자 치료를 위해 모든 임상 잠재력을 실현하기 위해 우리를 가져올 것이다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
재생 의학 임상 연구원 교육 그랜트를 위해 캘리포니아 공과 대학 (), 국립 과학 재단 (MW), 이레네 Perstein 수상 (TCM), 외과의 미국 대학 (TCM), 미국 소아 외과 협회 (: 우리는 자금 출처를 인정하고 싶습니다 TCM), 그리고 천 (TCM)의 월.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipettes | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-30 | |
| Microinjector | Narishige International | IM-300 | |
| Pipette sharpener | Sutter Instrument Co. | Model BV-10 |
References
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