Summary
Fare modeli
Abstract
In utero kök hücreler ve virüsler nakli, insan fetus konjenital bozuklukları tedavi etmek için muazzam bir potansiyel vardır . Örneğin, utero hematopoietik kök hücre transplantasyonu (IUT) birçok diğer koşulları ağır kombine immün yetmezlik 1,2 olan hastalarda başarıyla tedavi etmek için kullanılır olmuştur, ancak, IUT başarı olmadan teşebbüs olmuştur. 3 bu karışık sonuçlar göz önüne alındığında , kullanılabilirlik kök hücre nakli ve gen tedavisi biyolojik sekel çalışma için verimli olmayan bir insan modeli bu alanda ilerlemek için kritik öneme sahiptir. Biz ve diğerleri IUT wild-tip farelerden 4-7 ve genetik hastalıklara sahip olanlar başarılı engraftman utero nakledilen hematopoietik kök hücreleri etkileyen faktörleri incelemek için fare modeli kullanmışlardır. 8,9 fetal çevre için önemli avantajlar sunuyor . utero gen tedavisinin başarı. Örneğin, 10 adenoviral teslim 12,13 adeno-ilişkili ceninin içine 11 retroviral, 10, viral ve lentiviral vektörler, uzun vadeli gen ekspresyonu ile enjeksiyon yerinde birden fazla uzak organlara transdüksiyon yol açmıştır. utero Bu nedenle, gen tedavisi, müsküler distrofi veya kistik fibroz gibi tek gen hastalıkları için olası bir tedavi stratejisi olarak kabul edilebilir. IUT potansiyel bir diğer avantajı, belirli bir antijene karşı bağışıklık indüklenmesidir yeteneği. Hemofili, bu protein toleransı erken gelişme sonuçları Faktör IX giriş ile farelerde görülen 14
IUT fare modeli, potansiyel insan tedaviler araştıran kullanımına ek olarak, gelişimsel ve kök hücre biyolojisi temel sorular çalışma için güçlü bir araç olabilir. Örneğin, bir belirlenmiş gebelik aşamasında belirli bir gen ekspresyonunu indükleyen veya inhibe ve gelişimsel yollar işlemek için çeşitli küçük moleküller sunabilirsiniz. Bu değişikliklerin etkisi ilk transplantasyonu sonrası çeşitli timepoints değerlendirilebilir. Ayrıca, fetal ortama ışınlanmamış olmayan ve soğukkanlı bir ana bilgisayar ortamında kök hücre farklılaşması çalışma pluripotent ve soyu özel progenitör hücrelerin nakli.
IUT fare modeli zaten immünoloji alanlarında, gelişim ve kök hücre biyolojisi içinde sayısız anlayışlar sağladı. Bu video tabanlı protokol, fare fetuslarda IUT yapmak için bir adım-adım yaklaşım tanımlayan ve kritik adımlar ve bu tekniğin potansiyel tuzaklar anahat.
Protocol
1. Enjeksiyon Pipetler hazırlanması
- Cam pipet ayırma (kalibrasyon ilgili üreticinin talimatlarına bakın) 15 saniye içinde gerçekleşir böyle pipet çektirmenin kalibre edin. Pipet ayıran bir konik olacaktır.
- Pipetin konik başından sonuna kadar mesafe 1.05cm ile 1.04cm böyle pipet sonunda kesin. Pipet uzunluğu pipet orifis kalibre ile ters orantılıdır. Uzun bir pipet verme enjeksiyon sırasında kırılmaya karşı daha duyarlı daha zayıf bir ucu da sonuçları farkında olun.
- Pipet yapımında sonraki adım, bir elmas bileme simidi üzerindeki uç bileme düzgün bir köşe oluşturmak için. Uygun büyüklükte pipet kesme zamanda, pipet, çoğu zaman tekerlek üzerinde pipet verirken kullanılması gerekir, ucunda bir doğal konik kırar. Bu süreçte, hafifçe keskinleştirme tekerlek pipet dinlenme ve pipet hala tekerlek dokunmadan (eğim daha düzgün hale geldikçe, bileme çarkı ile temasa kaybedecek) emin olmak için periyodik olarak yeniden değerlendirmek önemlidir.
- Konik düz sonra, pipet ucu (Şekil 1) bilenmiş olmalıdır. Artık netlik tekerlek dokunmadan olduğu gibi pipet Elevate, 10-50 derece saat yönünde döndürmek ve ~ 10 saniye boyunca dönen bir tekerlek bileme pipet geri koyun. Keskinleştirme tekerlek pipet çekiniz ve şimdi kenarı inceleyeceğiz. Bu adım, genellikle keskin bir kenarı oluşturmak için bazı küçük ayarlamalar ile tekrar edilmesi gerekir. Pipet, çok uzun süre kenarına yerleştirilen ise, pürüzlü bir yüzey (Şekil 1) gelişme olasılığı daha fazladır. Bir tarafında tamamladıktan sonra, yukarıdaki adımları tekrarlayarak karşı kenar netleştirmek için devam edebilirsiniz.
- Her 4mm pipetin konik nerede başlar başlayarak dairesel bir çizgi çizmek için kalıcı bir kalem kullanın. Bu sınır çizgileri hacim 5uL karşılık.
2. Utero Nakli
- Enjektabl malzeme (örneğin hücreler, virüs, vb.) Hazırladıktan sonra enjeksiyon için ayarlayabilirsiniz. Biz aşağıdaki ayarları ile basınçlı hava bağlı bir mikroenjektör kullanın: (Basınç ayarları: giriş 60-80 psi, 0 psi tutun, 8-12 psi, denge 0 psi enjekte, 40 psi doldurmak; Enjeksiyon süresi 100 milisaniye).
- Enjeksiyon pipet sterilize için, steril 1X PBS ile iki kez izledi% 70 EtOH ile iki kez temizleyin. Pipet ucu çok kırılgan olduğu için, biz enjeksiyon pipetler otoklav önermiyoruz.
- Enjeksiyonlar ya 2.5X 3.5x büyütme loupes veya diseksiyon mikroskobu kullanılarak yapılabilir. Bir ısınma battaniye, aydınlatma ve gerekli cerrahi aletler ile işlem alanı hazırlayın.
- Hamile fare (sürekli bir akış anestezi ünitesi ile teslim izofluran ve oksijen kullanan) anestezisi. Fare fare yere sabitlemek için bant ile her uzuv yatar pozisyona yapıştırınız bir ısıtma yastığı yerleştirin.
- Klip kürk. Daha sonra,% 10 povidon-iyot alkol ile takip ve buprenorfin gibi bir analjezik enjekte hazırlık karın steril cerrahi eldiven giymiş.
- Alt karın (kesi en aşağı yönü introitus yaklaşık 1cm üstün olmalı) 1cm kesi olun. Cilt ve fasya İnsizyon. Hemen altında ince bir tabaka fascia (bağırsak ve mesane) karın içi organların zarar vermemek için dikkatli olun.
- Pamuklu çubuk kullanarak, yavaşça fasya esneme ve kesiden gravid rahim sunmak. Fetusların toplam sayısı ilk kez tüm rahim görselleştirmek emin olmak için sağ ve sol yumurtalıklar belirleyerek güvenin. Enjeksiyonlar için hazırlık yaparken fetusların sıcak kalmasını devam etmeden önce karın boşluğuna programlamayı rahim geri yerleştirin.
- Enjekte etmek için planladığınız fetusların sayısı için uygun malzeme hacmi çizin. Iğne örneği ile doldururken, mikroenjektör tüp içine örnek aspire önlemek için pipet Suya daldırılmış tutmak için önemlidir. Parafilm, pipet bozmadan iğne doldurmak için muktedir bir parça ya da doğrudan tüp hücreleri genellikle küçük hacimli olduğu için, biz genellikle küçük bir mikrofuge'ye (0.5mL eski) koyun.
- Her fetusun tutun ve yavaşça enjekte etmek için planladığınız fetus (örneğin karaciğer, peritoneal kavite, bacak, vb) bir parçası belirlemek. Başparmak ve işaret parmağı ile enjeksiyon yapıyorsanız dönmez böylece, amniyotik kavite içinde fetüs stabilize gerekir. Nazikçe yeterince zarar görmesini önlemek için henüz istikrara sıkıca yeterli fetus tutmak için önemlidir.
- Rahim, amniyon ve fetal cilt ile dikkatlice pipet eklemek ve hedef organ. Pipet keskin ise, bu dokular vasıtasıyla kolayca geçmelidir. Pipet mat ise, wi rahim ve amniyotik membranlar haber çadır ll. Istenen birimde her fetüs içine enjekte edilir. Bu hareketleri ekleme, enjeksiyon, pipet çekilmesi ve zamanında kararlı olması zorunludur.
- İstenen hacme enjekte edildikten sonra, pipet dikkatlice geri çekin. Eğer doğru yapılırsa, malzeme amniyotik kavite veya rahim sızıntısı olmamalıdır. Büyük bir delik amniyon, amniyotik sıvı sızıntısı tanıyabilir oluşturulursa, daha sonra hayatta kalma tehlikeye girer. Son olarak, doğum sonrası hasat içeren çalışmalar için, doğumdan sonra enjekte uninjected fetusların ayırt yolu yoktur beri tüm fetusların teknik olarak mükemmel enjeksiyonları almalıdır.
- Fetal karaciğer içine enjeksiyon yapıyorsanız çekilmiş bu sonra, zaman zaman pipet kan görebilirsiniz doğru konumda olduğunu doğruladı ve hayatta kalma etkilememelidir. Intra-peritoneal enjeksiyonlar yerine ise, fetal karaciğer biraz altında hedefliyoruz. Intramüsküler enjeksiyon için, kalça ve femur belirlemek ve gluteus kas enjekte fetus pozisyonu. Son olarak, intraventriküler enjeksiyonları için uygun hedef için pipet doğrudan koronal sütür görmek kolaydır. Bu enjeksiyonlar için, biraz daha büyük kalibreli pipetler, pipet bozmadan kafatası nüfuz gereklidir.
- Sonra, rahim karın boşluğuna geri dikkatlice yerleştirin. Kendisi ya da vasküler kaynağı etrafında bükülmüş değil emin olun. , Işlem sırasında kayboldu herhangi bir sıvı yerine annenin periton boşluğuna steril 1X PBS 1mL sunun. 5-0 örgülü emilebilir sütür (vicryl eski) ile 2 kat kesi kapatın. Öncelikle altta yatan bağırsak veya mesane zarar vermeden fasya kapatmak ve ardından cilde yakın.
- Bu zamanda, post-işlem ilaçlar analjezi için uygulanabilir. Her enjekte kadın kendi bireysel kafesine geri dönün ve bir ısınma battaniye kafes yerleştirin. Dik kadar fare izleyin. Kafes yataklar koyun ve sakin bir bölgede, doğumdan sonra birkaç gün kadar (yani herhangi bir kafes temizlik) rahatsız olmamalıdır fare tesisin fare. Hayvan için herhangi bir ek yük en aza indirmek, erken doğum şansı azalacaktır.
- Enjeksiyonları tamamladıktan sonra, steril 1X PBS ile iki kez pipet temiz ve% 70 kez ile EtOH.
- Enjekte kadın zorlanmadan prosedürü kurtarma sigortalamak için günlük dikkat edilmelidir. Kesi, şişme, enfeksiyon, inflamasyon, yara ayrılması, ve diğer işaretleri takip edilmelidir. Post-operatif analjezikler, gerektiği şekilde uygulanmalıdır.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Survival term doğum enjekte fetusların Bu tekniği ile başarıya ulaşmak için ana sınırlayıcı faktör. Materyal enjekte edilir ve kullanılan fare zorlanma bağlı olarak, sağ kalım oranları değişebilir. Genel olarak, en az% 50 canlı doğan yavrular E14 yabani tip farelere hematopoetik hücre enjeksiyonları sonucu gerekir. Enjeksiyon teknik yönlerinin yanı sıra enjekte olan farelerin özellikleri de bağlı olarak hayatta kalma oranlarının daha yüksek mümkündür.
Rahim ve amniyon zarlarına travma en aza indirmek, bu protokolün en önemli teknik yönüdür. Keskin, küçük kalibreli pipetler enjeksiyon sırasında rahim minimal travmaya neden olacaktır. Biz prefabriklerin iğneler kalibreli olarak standart enjeksiyon iğneleri kullanarak çok büyük ve rahim içinde büyük bir delik neden yok. El yapımı cam enjeksiyon pipetler utero enjeksiyonları için kullanılabilir sadece küçük kalibreli iğne. Rahim ve kısa bir anestezi nazik bir kullanım da dahil olmak üzere, dikkatli ve titiz cerrahi teknik, aynı zamanda en iyi sonuçlar için çok önemlidir.
Özel alıcı farelerin genetik arka plan, gestasyonel yaş ve çöp boyutu gibi özellikleri de hayatta kalma etkileyebilir. Farelerde bazı suşlarının genetik arka plan bağlı olarak erken doğum ve gebelik kaybı daha duyarlı vajinal orta hat laparotomi geçtikten sonra fetusların teslim yetilerinde olabilir, kas veya nörodejeneratif kusurları ile 15 Transgenik hayvan 8. Bu hamile kadın tarafından teslim gerekebilir Sezaryen. Ayrıca enjeksiyon zamanda gebelik yaşı canlılığı etkisi olduğunu buldular. Embriyonik gün 12 yaşından küçük olan fetuslar eski fetuslara göre daha düşük hayatta kalma oranlarına sahip. Son olarak, büyük çöp boyutları (> 10 fetusların) yüksek enjeksiyon sonrası fetal ölüm oranlarına sahip olma eğiliminde olduğunu buldular. Teknik özellikleri ve bu tekniğin enjekte fetusların yaşam maksimize enjekte edilen farelerin spesifik özellikleri de dikkat etmek.
ve_content "> bu yöntemleri doğru bir şekilde yapıldığında, bir bütün fetusların enjekte edilen malzemenin maruz kaldığı bekleyebilirsiniz. postnatal ayarı Benzer, ancak, in utero hücreleri ya da virüsler her zaman başarılı bir şekilde teslim donör hücre engraftman ya da gen sonucu değildir ifadesi, kök hücre engraftman, örneğin, doz ve nakledilen hücrelerin kaynağı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Benzer şekilde, viral transdüksiyon başarısı, kısmen, kullanılan viral vektör tipine göre belirlenir. Bir darbe yavrusunun hayatta kalması, hücresel engraftman, ve viral transdüksiyon bu protokol ile başarıya ulaşmak için çok sayıda faktöre anlamak gerekir.
Şekil 1. Diyagramı enjeksiyon pipetler (Adım 1.4) keskinleştirme uygun resmeden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
50 yıl önce, Billingham, Brent ve Medawar yabancı proteinlere karşı bağışıklık indüklenmesidir farelerde utero nakli kullanılır. 16 O zamandan bu yana, bu tekniğin çeşitli varyasyonlar, immünoloji ve kök hücre biyolojisi soruları yanıtlamak için kullanılmaktadır .
Burada ayrıntılı protokol IUT için en kolay yöntemlerden biridir. Fetal karaciğer kolayca görüntülenebilmekte bir hedef sunar ve portal ve hepatik ven yoluyla sistemik dolaşıma erişim sağlar. Ancak, istenen enjeksiyon zamanlaması ve yeri optimize etmek için bazı değişiklikler tarif edilmiştir. Örneğin rahim şeffaf değildir, çünkü, E13.5 daha küçük fetuslarda enjeksiyonları daha zor olabilir. Bu yaklaşım geliştirme önceki olayları incelemek için gerekli ise, ultrason rehberliğinde enjeksiyonları özellikle dokuları hedef olabilir. 17 Ultrason rehberlik de özellikle kalp veya akciğer gibi organlar, içine enjeksiyon doğrudan yararlıdır. Vitellin 18,19 damar içine İntravenöz enjeksiyonu hücreler dolaşıma doğrudan teslim avantajı sunmak ve hücrelerin daha büyük hacimli teslimat için izin verebilir. 5 kasıtlı okuyucu olduğunu farelerde IUT yapan bir genel yaklaşım tanımlanmıştır gerekli temeli bu enjeksiyonları ile başarıya ulaşmak ve belirli bir uygulama gerekli terzi bu yöntemlerin.
Immün toleransı üzerinde 50 yıl önce çalışmak için ilk kullanımına rağmen, IUT öğretici olacağı hala cevaplanmamış sorular var. Fetal çevre girmesinden özel yabancı antijenlere karşı indüklenmesidir yeteneği farelerde gösterilmiştir 4,6,7 fare fetal bağışıklık sistemi daha büyük hayvanlar daha sonra gelişir ve bu bulgu, kesin mekanizmalar etkileyebilir fareler daha fazla araştırılması gerekmektedir fetal tolerans oluşur. Bu tür deneyler, insanlarda tolerans artırmanın yollarını aydınlatmak olabilir. Farelerde bile kök hücre engraftman başarı sınırlamak için, hematopoetik nişler ve rekabet avantajı ev sahibi hücrelerin varlığı gibi faktörler devam eder. Daha fazla araştırmak için 3 Şu stratejileri bu konağın immün yanıtı özel mekanizmaların güçlendirilmesi ve rota optimizasyonu kök hücre teslim zamanlama ve doz. IUT erken gebelik farelere kök hücre engraftman ve farklılaşma okumak için ideal bir model sunar.
IUT kök hücre ve gelişimsel biyoloji alanlarında temel konuları anlamak için güçlü bir araçtır. , In utero sunulan antijenleri fetal tolerans yol açan mekanizmaların tanımlanması, kök hücre nakli alanında için önemli etkileri olacaktır. Buna ek olarak, viral vektörlerin başarılı teslimat, tek gen hastalıkları için bir tedavi sağlayabilir. Birçok transgenik ve mutant fare suşlarının durumu beklenen fenotip değiştirmek için belirli genlerin oynadıkları rol hakkında soruşturma için izin verir. IUT fare modeli hiç kuşkusuz, bu alanlarda ilerleme ve konjenital anomaliler ile hastaları tedavi için tam klinik potansiyelin daha yakın bize getirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
California Rejeneratif Tıp Klinik Fellow Eğitim Hibe Enstitüsü (AN), Ulusal Bilim Vakfı (MW), Irene Perstein Ödülü (TCM), Amerikan Cerrahlar Koleji (TCM), Amerikan Pediatrik Cerrahi Derneği (finansman kaynakları kabul etmek istiyorum TCM) ve Dimes (TCM) Mart.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipettes | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-30 | |
| Microinjector | Narishige International | IM-300 | |
| Pipette sharpener | Sutter Instrument Co. | Model BV-10 |
References
- Flake, A. W. Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow. N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).
- Wengler, G. S. In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI). Lancet. 348, 1484-1487 (1996).
- Flake, A. W., Zanjani, E. D. in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers. Blood. 94, 2179-2191 (1999).
- Merianos, D. J. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).
- Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation. Blood. 109, 1331-1333 (2007).
- Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice. J Surg Res. 77, 1-5 (1998).
- Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras. Blood. 112, 5245-5253 (2008).
- Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice. J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).
- Hayashi, S. Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy. Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).
- Bouchard, S. Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice. J Gene Med. 5, 941-950 (2003).
- Meza, N. W. Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme. Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).
- MacKenzie, T. C. Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes. Mol Ther. 6, 349-358 (2002).
- MacKenzie, T. C. Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors. J Gene Med. 7, 50-58 (2005).
- Sabatino, D. E. Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice. Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).
- Mellor, A. L., Munn, D. H. Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression. Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, 603-606 (1953).
- Endo, M. Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector. Mol Ther. 15, 579-587 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer. Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).
