Einem Mausmodell der In Utero Transplantation

Summary

Das Mausmodell der

Abstract

Die Transplantation von Stammzellen und Viren in utero hat ein enormes Potenzial für die Behandlung von angeborenen Störungen im menschlichen Fötus. Zum Beispiel, in utero Transplantation (IUT) von hämatopoetischen Stammzellen verwendet wurde, um erfolgreich zu behandeln Patienten mit schwerer kombinierter Immundefizienz. ^1,2 In mehreren anderen Bedingungen, jedoch hat IUT ohne Erfolg versucht worden. ³ Da diese gemischte Ergebnisse, die Verfügbarkeit eines effizienten nicht-menschlichen Modell, um die biologischen Folgen der Stammzelltransplantation und Gentherapie-Studie ist von entscheidender Bedeutung, um diesem Bereich voranzubringen. Wir und andere haben das Mausmodell der IUT zu Faktoren, die erfolgreiche Transplantation von in utero transplantierten hämatopoetischen Stammzellen in beiden Wildtyp-Mäusen ^4-7 und die mit genetischen Erkrankungen Studie verwendet. ^8,9 Die fetalen Umfeld bietet auch erhebliche Vorteile für die Erfolg in utero Gentherapie. Zum Beispiel hat die Lieferung von adenoviralen ^10, Adeno-assoziierte virale ^10, retrovirale ¹¹ und lentiviralen Vektoren ^12,13 in den Fötus in der Transduktion von mehreren Organen entfernt von der Injektionsstelle mit langfristigen Genexpression führte. In utero Gentherapie kann daher als eine mögliche Behandlungsstrategie für einzelnes Gen Erkrankungen wie Muskeldystrophie oder zystische Fibrose in Betracht gezogen werden. Ein weiterer potenzieller Vorteil von IUT ist die Fähigkeit, die Immuntoleranz zu einem bestimmten Antigen zu induzieren. Wie in Mäusen mit Hämophilie, die Einführung des Faktor IX früh in der Entwicklung führt zu Toleranz gegenüber diesem Protein zu sehen. ¹⁴

Zusätzlich zu seiner Verwendung bei der Untersuchung von potentiellen menschlichen Therapien kann das Mausmodell der IUT ein mächtiges Werkzeug, um grundlegende Fragen in Entwicklungs-und Stammzell-Biologie zu studieren. Zum Beispiel kann man liefern verschiedene kleine Moleküle zu induzieren oder hemmen Genexpression in definierten Stufen Gestationsalter und manipulieren Entwicklungspfaden. Die Auswirkungen dieser Änderungen können zu verschiedenen Zeitpunkten nach der ersten Transplantation beurteilt werden. Darüber hinaus kann man pluripotent oder Abstammung bestimmte Vorläuferzellen in das fötale Umfeld zu Stammzell-Differenzierung in eine nicht-bestrahlten und unbeirrt Host-Umgebung Studie zu verpflanzen.

Das Mausmodell der IUT hat bereits zahlreiche Erkenntnisse in den Bereichen Immunologie und Entwicklungs-und Stammzell-Biologie zur Verfügung gestellt. In diesem Video-basiertes Protokoll, beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Ansatz zur Durchführung IUT in Maus-Föten und einen Überblick über die wichtigsten Schritte und mögliche Fallstricke dieser Technik.

Protocol

1. Vorbereitung der Injektion Pipetten

1. Kalibrieren Sie die Pipette puller wie die Trennung der Glaspipette innerhalb von 15 Sekunden (siehe Anweisungen des Herstellers bezüglich der Kalibrierung) auftritt. Die Pipette wird eine Verjüngung, wo sie trennt.
2. Schneiden Sie das Ende der Pipette, so dass der Abstand vom Beginn der Verjüngung bis zum Ende der Pipette 1.04cm bis 1.05cm ist. Die Länge der Pipette ist umgekehrt proportional zu dem Kaliber der Pipette Öffnung. Seien Sie sich bewusst, dass zuvor eine längere Pipette führt auch zu einer schwächeren Spitze, anfälliger für Brüche während der Injektion ist.
3. Der nächste Schritt, um die Pipette, um einen reibungslosen Fase durch Schärfen der Spitze auf einem Diamant-Schleifstein zu schaffen. Zum Zeitpunkt des Schneidens der Pipette auf die entsprechende Größe, die Pipette bricht oft mit einem natürlichen Fase an der Spitze, die beim Platzieren Sie die Pipette auf dem Rad werden müssen. Während dieses Prozesses ist es wichtig, vorsichtig Rest der Pipette auf dem Schleifstein und in regelmäßigen Abständen neu zu bewerten, um sicherzustellen, dass die Pipette noch berühren das Rad (wie die Schräge wird glatter, nimmt sie Kontakt mit dem Schleifstein zu verlieren).
4. Sobald die Schräge ist glatt, muss die Pipettenspitze geschärft (Abbildung 1). Elevate der Pipette, so dass es nicht mehr berühren Schärfscheibe, drehen Sie ihn um 10-50 Grad im Uhrzeigersinn, und setzen Sie die Pipette wieder auf den rotierenden Schleifstein für ~ 10 Sekunden. Ziehen Sie die Pipette aus der Schleifstein und nun die Kante. Dieser Schritt muss in der Regel mit mehreren kleinen Anpassungen wiederholt werden, um eine scharfe Kante zu schaffen. Wenn die Pipette an ihrem Rand zu lange steht, ist es eher eine unebene Oberfläche (Abbildung 1) zu entwickeln. Nach Abschluss einer Seite, können Sie fortfahren, um die gegenüberliegende Kante, indem Sie die obigen Schritte zu schärfen.
5. Verwenden Sie eine dauerhafte Markierung, um eine umlaufende Linie jeder 4mm ab, wo die Verjüngung der Pipette beginnt zu zeichnen. Diese Abgrenzungen zu 5UL Volumen entsprechen.

2. In Utero Transplantation

1. Nach der Vorbereitung des injizierbaren Material (z. B. Zellen, Viren, etc.) können Sie sich für die Injektion. Wir verwenden eine Mikroinjektor an Druckluft mit den folgenden Einstellungen: (Pressure-Einstellungen: Eingang 60-80 psi, füllen 40 psi, spritzen 8-12 psi, Balance 0 psi, halten Sie 0 psi; Injection Zeit von 100 Millisekunden).
2. Um sterilisieren Injektionspipette, reinigen Sie sie zweimal mit 70% EtOH gefolgt von zweimal mit sterilem 1X PBS. Als die Spitze der Pipette ist sehr zerbrechlich, empfehlen wir nicht Autoklavieren der Injektion Pipetten.
3. Die Injektionen können entweder erfolgt mit 2.5X-3.5X Vergrößerung Lupenbrille oder einem Binokular werden. Bereiten Sie Ihr Verfahren mit einer wärmenden Decke, Beleuchtung und notwendige chirurgische Instrumente.
4. Anesthetize die schwangere Maus (wir nutzen Isofluran und Sauerstoff über einen kontinuierlichen Fluss Anästhesie Einheit geliefert). Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen in der Rückenlage und bringen jedes Glied mit Klebeband, um die Maus zu fixieren.
5. Clip das Fell. Dann tragen sterile Handschuhe, den Bauch prep mit 10% PVP-Jod durch Alkohol, gefolgt, und injizieren ein Schmerzmittel wie Buprenorphin.
6. Machen Sie einen 1cm Schnitt im Unterbauch (der minderwertigen Aspekt der Schnittführung sollte ca. 1cm über dem Introitus werden). Inzision der Haut und der Faszie. Achten Sie darauf, nicht auf die Bauchorgane (Darm und Blase), die unmittelbar unter der dünnen Schicht der Faszie zu verletzen.
7. Mit Wattestäbchen vorsichtig strecken die Faszie und den graviden Uterus durch den Schnitt. Zählen Sie die Anzahl der Föten, indem Sie zunächst die Identifizierung der rechten und linken Eierstock, damit Sie visualisieren die gesamte Gebärmutter. Legen Sie die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle, bevor Sie fortfahren, so dass die Föten warm bleiben, während Sie für die Injektionen vorzubereiten.
8. Ziehen Sie die entsprechende Menge an Material für die Anzahl der Föten Sie planen, zu injizieren. Beim Ausfüllen der Nadel mit der Probe ist es wichtig, die Pipettenspitze eingetaucht zu vermeiden Absaugen Ihrer Probe in die Mikroinjektor Schlauch zu halten. Da Zellen in der Regel in einem kleinen Volumen, wir in der Regel legen Sie sie in einem kleinen Mikrozentrifuge (ex: 0,5 ml) tube oder direkt auf einem Stück Parafilm in der Lage sein, um die Nadel, ohne die Pipettenspitze zu füllen.
9. Vorsichtig halten jeden Fetus und den Teil des Fötus, das Sie planen, zu injizieren (zB Leber, Bauchhöhle, Bein, etc.). Mit Daumen und Zeigefinger, müssen Sie stabilisieren den Fötus in die Amnionhöhle, damit es nicht zu drehen, während Sie die Injektion werden. Es ist wichtig für den Fötus fest genug, um es noch zu stabilisieren sanft genug, um nicht zu beschädigen ihn zu halten.
10. Schieben Sie die Pipette durch die Gebärmutter, Amnion und fetaler Haut und in das Zielorgan. Wenn die Pipette ist scharf, sollte es leicht passieren diesen Geweben. Wenn die Pipettenspitze ist langweilig, man wi werden bemerken, Zelten der Gebärmutter und Fruchtwasser Membranen. Spritzen Sie die gewünschte Lautstärke in jedem Fötus. Es ist zwingend notwendig, dass Ihre Bewegungen stetige werden während der Zeit der Insertion, Injektion, und dem Rückzug der Pipette.
11. Sobald die gewünschte Lautstärke injiziert ist, ziehen Sie die Pipette vorsichtig. Wenn es richtig gemacht, sollte das Material nicht austreten aus der Amnionhöhle oder Gebärmutter. Wenn ein großes Loch in das Amnion, die man durch Austreten von Fruchtwasser erkennen kann erstellt wird, dann das Überleben gefährdet ist. Schließlich wird für Studien, dass postnatale Ernte zu erfüllen, müssen alle Feten erhalten technisch perfekt Injektionen, da es keine Möglichkeit, die injiziert und injizierten Feten nach der Geburt zu erkennen.
12. Wenn Sie die Durchführung Injektionen werden in der fetalen Leber, kann es zuweilen Blut sehen in der Pipettenspitze, nachdem sie zurückgezogen wird, das bestätigt Ihnen in die richtige Position und sollte keinen Einfluss auf das Überleben. Wenn die Durchführung intraperitoneale Injektionen, leicht unterhalb der fetalen Leber Ziel. Für die intramuskuläre Injektionen, können Sie Position des Fötus bis zur Hüfte und Oberschenkel zu identifizieren und injizieren Sie die gluteus Muskel. Schließlich wird für intraventrikuläre Injektion, ist es leicht, die Koronarnaht sehen Sie die Pipette an die entsprechenden Ziel zu lenken. Für diese Injektionen, sind etwas größer Kaliber Pipetten benötigt, um den Schädel, ohne die Pipette eindringen.
13. Als nächstes legen Sie sorgfältig die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle. Achten Sie darauf, es nicht auf sich selbst oder um seine Gefäßversorgung verdreht. Deliver 1ml steriler 1X PBS in der Mutter Bauchhöhle keine Flüssigkeit, die während des Verfahrens verloren zu ersetzen. Schließen Sie den Schnitt in 2 Schichten mit einer 5-0 Vicryl resorbierbares Nahtmaterial (ex: Vicryl). Schließen Sie zuerst die Faszie ohne Verletzung der darunter liegenden Darm oder Blase, und schließen Sie dann die Haut.
14. Zu diesem Zeitpunkt kann nach dem Eingriff Medikamente zur Analgesie verabreicht werden. Zurück jedes injiziert Buchse auf seinen eigenen Käfig und platzieren Sie den Käfig auf eine wärmende Decke. Überwachen Sie die Maus, bis er aufrecht steht. Put Betten in den Käfig und die Maus in einer ruhigen Gegend von der Maus-Anlage, wo sie nicht gestört werden soll (dh keine Käfig-Reinigung) erst einige Tage nach Lieferung. Minimierung zusätzlicher Stress für das Tier sinkt die Wahrscheinlichkeit von Frühgeburten.
15. Sobald Sie die Injektion beendet haben, reinigen Sie Ihre Pipette zweimal mit sterilem 1X PBS und einmal mit 70% EtOH.
16. Injected Frauen sollen täglich beobachtet, um sicherzustellen, sie sind von dem Verfahren erholt ohne Schwierigkeiten. Der Schnitt sollte bei Schwellungen, Entzündungen, Wunden Trennung und andere Anzeichen einer Infektion überwacht werden. Postoperative Schmerzmittel können bei Bedarf verabreicht werden.

3. Repräsentative Ergebnisse:

Survival of the injiziert Föten zu Begriff Lieferung ist der wichtigste limitierende Faktor für den Erfolg mit dieser Technik. Je nach Material injiziert und die Belastung der Maus verwendet wird, können die Überlebensraten variieren. Im Allgemeinen sollten die Injektionen von hämatopoetischen Zellen in Wildtyp-Mäusen auf E14 in mindestens 50% live-Welpen geboren führen. Höhere Überlebensraten sind je nach sowohl die technischen Aspekte der Injektion sowie die Eigenschaften der Mäuse injiziert werden.

Minimierung der Verletzungen der Gebärmutter und Fruchtwasser Membranen ist die wichtigste technische Aspekt dieses Protokolls. Sharp wird Kleinkaliber Pipetten in minimal uterine Trauma während der Injektion führen. Wir empfehlen nicht, mit Standard-Injektionsnadeln als das Kaliber von vorgefertigten Nadeln ist zu groß und würde in ein großes Loch in der Gebärmutter führen. Handgefertigte Glas-Pipetten sind die einzigen kleinen Kalibers Nadeln, die in utero-Injektionen genutzt werden kann. Sorgfältige und gewissenhafte chirurgische Technik, einschließlich schonenden Umgang mit der Gebärmutter und eine kurze Narkose ist auch entscheidend für optimale Ergebnisse.

Besondere Merkmale des Empfängers Mäusen wie der genetische Hintergrund, Gestationsalter, und Wurfgröße kann auch Auswirkungen auf das Überleben. Bestimmte Stämme von Mäusen sind anfälliger für vorzeitige Wehen und Fehlgeburten in Abhängigkeit von ihrer genetischen Hintergrund. ¹⁵ Transgene Tiere mit Muskel-oder neurodegenerative Defekte können eine gestörte Fähigkeit, Föten vaginal nach Durchlaufen eines medianen Laparotomie liefern haben. ⁸ Diese schwangeren Frauen kann die Lieferung von benötigen Kaiserschnitt. Wir haben auch festgestellt, dass das Gestationsalter zum Zeitpunkt der Injektion kann die Lebensfähigkeit auswirken. Föten, die jünger als embryonale Tag 12 sind, haben niedrigere Überlebensrate als bei älteren Föten. Schließlich haben wir festgestellt, dass große Wurf Größen (> 10 Föten) zu höheren Raten von fetalen Tod nach der Injektion neigen. Achtung, sowohl die technischen Aspekte dieser Technik und die besonderen Merkmale der Mäuse injiziert werden kann das Überleben der injizierten Feten zu maximieren.

ve_content "> Wenn diese Methoden ordnungsgemäß durchgeführt werden, kann man erwarten, dass alle Föten, die eingespritzte Material ausgesetzt sind. Ähnlich wie bei der postnatalen Einstellung, jedoch die erfolgreiche Bereitstellung von Zellen oder Viren in utero nicht immer in Donorzelle Transplantation oder Gen-Ergebnis Ausdruck bzw.. Die Transplantation von Stammzellen, zum Beispiel, ist von mehreren Faktoren abhängig, wie die Dosis und die Quelle der transplantierten Zellen. Auch der Erfolg der viralen Transduktion, ist zum Teil bestimmt durch die Art der viralen Vektor verwendet. Man muss verstehen, die zahlreichen Faktoren, die Auswirkungen Überlebensrate der Jungtiere, zelluläre Transplantation und virale Transduktion zum Erfolg mit diesem Protokoll zu erreichen.

Abbildung 1. Diagramm mit korrekten Schärfen der Injektion Pipetten (Schritt 1,4)

Discussion

Vor über 50 Jahren, Billingham, Brent, und Medawar in utero Transplantation in Mäuse verwendet, um Immuntoleranz gegenüber fremden Proteinen zu induzieren. ¹⁶ Seit dieser Zeit haben mehrere Varianten dieser Technik verwendet worden, um Fragen in der Immunologie und Stammzellbiologie Adresse.

Das Protokoll detaillierte hier ist eine der am besten zugänglichen Methoden zur IUT. Die fetale Leber bietet eine einfach visualisiert Ziel und bietet Zugang zu den systemischen Kreislauf über das Portal und Lebervenen. Allerdings haben einige Modifikationen beschrieben worden, um das Timing und die Position der gewünschten Injektion zu optimieren. Zum Beispiel kann die Injektion in Embryonen jünger als E13.5 schwieriger sein, weil die Gebärmutter ist nicht transparent. Wenn dieser Ansatz ist notwendig, um frühere Ereignisse in der Entwicklung studieren, kann Ultraschall-geführte Injektionen verwendet werden, um bestimmte Gewebe Ziel sein. ¹⁷ Ultraschallkontrolle ist auch nützlich, um die Injektion in bestimmten Organen, wie Herz oder Lunge zu leiten. Die intravenöse Injektionen in die Vene vitelline ^18,19 bieten den Vorteil der Bereitstellung von Zellen direkt in den Blutkreislauf und kann für die Lieferung von größeren Mengen von Zellen zu ermöglichen. ^5. Wir haben absichtlich einen allgemeinen Ansatz zur Durchführung von IUT bei Mäusen beschrieben, so dass der Leser die hat notwendige Grundlage zur Erreichung Erfolg mit diesen Injektionen und können Ihnen diese Methoden auf die jeweilige Anwendung erforderlich ist.

Trotz ihrer erstmaligen Verwendung zur Induktion einer Immuntoleranz vor über 50 Jahren studieren, gibt es noch wichtige offene Fragen, für die IUT lehrreich sein wird. Die Fähigkeit zur Toleranz auf bestimmte fremde Antigene zu induzieren durch ihre Einführung in die fötalen Umwelt hat bei Mäusen nachgewiesen. ^4,6,7 Während der Maus fetalen Immunsystems entwickelt sich später als größere Tiere und darf diese Erkenntnis, die genauen Mechanismen, durch Auswirkungen die fetale Toleranz tritt bei Mäusen weiter untersucht werden müssen. Solche Experimente können aufzuklären Möglichkeiten der Toleranzinduktion in den Menschen zu verbessern. Auch in Mäusen, weiterhin Faktoren wie die Verfügbarkeit von hämatopoetischen Nischen und den Wettbewerbsvorteil von Wirtszellen, um den Erfolg der Stammzell-Transplantation zu begrenzen. ³ Aktuelle Strategien zur weiteren Untersuchung dieser gehören zu manipulieren spezifische Mechanismen der Immunantwort des Wirts und der Optimierung der Route, Timing und Dosierung von Stammzellen Lieferung. IUT in der frühen Schwangerschaft Mäusen stellt ein ideales Modell, in dem Stammzellen Transplantation und Differenzierung zu studieren.

IUT ist ein leistungsstarkes Tool, um grundlegende Fragen in den Bereichen Stammzellforschung und Entwicklungsbiologie verstehen. Definieren der Mechanismen, die zur fetalen Toleranz gegen Antigene in utero eingeführt führen wird erhebliche Auswirkungen auf dem Gebiet der Stammzelltransplantation. Darüber hinaus kann eine erfolgreiche Bereitstellung von viralen Vektoren eine Behandlung für einzelne Gen-Erkrankungen. Die Verfügbarkeit von zahlreichen transgenen und mutanten Mauslinien ermöglicht Erforschung der Rolle bestimmter Gene spielen, um die erwarteten Phänotyp zu ändern. Das Mausmodell der IUT wird zweifellos voraus diese Felder und bringen uns näher zu ihr volles klinisches Potenzial für die Behandlung von Patienten mit angeborenen Anomalien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipettes	Kimble Chase	71900-100
Pipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-30
Microinjector	Narishige International	IM-300
Pipette sharpener	Sutter Instrument Co.	Model BV-10