En musmodell av I livmodern Transplantation

Summary

Den musmodell av

Abstract

Transplantation av stamceller och virus i livmodern har en oerhörd potential för behandling av medfödda sjukdomar i det mänskliga fostret. Till exempel har in utero transplantation (IUT) av hematopoetiska stamceller har använts för att framgångsrikt behandla patienter med svår kombinerad immunbrist. ^1,2 I flera andra villkor har dock IUT prövats utan framgång. ³ Med tanke på dessa blandade resultat, tillgänglighet av en effektiv icke-mänskliga modell för att studera biologiska följdtillstånd av stamcellstransplantation och genterapi är avgörande för att främja detta område. Vi och andra har använt den musmodell av IUT att studera faktorer som påverkar en framgångsrik engraftment in utero transplanterade hematopoetiska stamceller i både vildtyp möss ^4-7 och de med genetiska sjukdomar. ^8,9 Fostrets miljö erbjuder också stora fördelar för framgång i livmodern genterapi. Till exempel har leveransen av adenovirala ^10, Adeno-associerad viral ^10, retrovirus ¹¹ och Lentiviral vektorer ^12,13 till fostret resulterade i transduktion av flera organ långt från injektionsstället med långsiktiga genuttryck. I livmodern genterapi kan därför betraktas som en möjlig behandling strategi för enda gen sjukdomar som muskeldystrofi eller cystisk fibros. En annan potentiell fördel med IUT är förmågan att inducera immun tolerans mot ett specifikt antigen. Som framgår av möss med hemofili, införandet av Faktor IX tidigt i utvecklingen resulterar i tolerans mot detta protein. ¹⁴

Förutom dess användning i att undersöka potentiella mänskliga terapier kan musmodell av IUT vara ett kraftfullt verktyg för att studera grundläggande frågor i utvecklings-och stamcellsbiologi. Till exempel kan en leverera olika små molekyler för att inducera eller hämma specifikt genuttryck vid definierade graviditetsdiabetes skeden och manipulera utvecklingsbanor. Effekterna av dessa förändringar kan bedömas på olika tidpunkter efter den första transplantationen. Dessutom kan en transplantation pluripotenta eller härstamning specifika stamceller till fostrets miljö att studera differentiering stamceller i ett obestrålat och oberörd värd miljö.

Den musmodell av IUT har redan många insikter inom områdena immunologi, samt utvecklings-och stamcellsbiologi. I denna video-baserat protokoll, beskriver vi en steg-för-steg att utföra IUT i mus foster och beskriva de kritiska moment och potentiella fallgropar med denna teknik.

Protocol

1. Beredning av injektionsvätska Pipetter

1. Kalibrera pipetten avdragaren så att separation av glaspipett sker inom 15 sekunder (se tillverkarens anvisningar om kalibrering). Pipetten kommer att ha en konisk där den separerar.
2. Klipp slutet av pipetten så att avståndet från början av koniska till slutet av pipetten är 1.04cm till 1.05cm. Längden på pipetten är omvänt proportionell mot kaliber av pipetten öppning. Var medveten om att göra en längre pipett resulterar också i en svagare tips som är mer mottaglig för skador under injektionen.
3. Nästa steg i att pipetten är att skapa en smidig avfasning av skärpa spetsen på en diamant slipning hjul. Vid tiden för kapning pipetten till lämplig storlek, bryter pipetten ofta med en naturlig avfasning i spetsen som måste användas när du placerar pipetten på hjulet. Under denna process är det viktigt att försiktigt vila pipetten på skärpning hjul och regelbundet omvärdera för att se pipetten fortfarande vidrör hjulet (som avfasning blir smidigare, kommer den att förlora kontakten med skärpa hjulet).
4. När avfasning är smidig, måste pipettspetsen slipas (Figur 1). Höj pipetten så att den inte längre vidrör skärpning hjulet, vrid den medurs 10-50 grader, och placera pipetten tillbaka på den roterande skärpning hjulet för ~ 10 sekunder. Dra ut pipetten ur skärpa hjulet och nu granska kanten. Detta steg behöver oftast upprepas med flera små justeringar för att skapa en skarp kant. Om pipetten placeras på högkant för länge, är det större risk att utveckla en ojämn yta (figur 1). Efter att ha avslutat en sida, kan du fortsätta att skärpa den motsatta kanten genom att upprepa stegen ovan.
5. Använd en permanent spritpenna att dra en omkrets linje varje 4mm börjar där avsmalning av pipetten börjar. Dessa avgränsningar motsvarar 5uL volym.

2. I livmodern Transplantation

1. Efter beredning av injicerbara material (t.ex. celler, virus etc.) kan du ställa upp för injektion. Vi använder en microinjector ansluten till tryckluft med följande inställningar: (Pressure inställningar: ingång 60-80 psi, fyll 40 psi, injicera 8-12 psi, balans 0 psi, håll 0 psi, Insprutning tid 100 millisekunder).
2. Att sterilisera injektionen pipett rengöra den två gånger med 70% EtOH följt av två gånger med steril 1X PBS. Som toppen på pipetten är mycket bräckliga, rekommenderar vi inte autoklavering injektionen pipetter.
3. Injektioner kan antingen göras med 2,5 X-3.5x förstoring luppar eller dissekera mikroskop. Förbered ditt förfarande område med en värmande filt, belysning, och nödvändiga kirurgiska instrument.
4. Bedöva gravid musen (vi använder isofluran och syre levereras via ett kontinuerligt flöde anestesi enhet). Placera musen på en värmedyna i ryggläge och förse varje lem med tejp för att fästa musen på plats.
5. Klipp pälsen. Sedan bär sterila kirurgiska handskar, buken prep med 10% povidon-jod följt av alkohol, och injicera ett smärtstillande såsom buprenorfin.
6. Gör en 1 cm snitt i nedre delen av magen (den sämsta delen av snittet bör vara ca 1 cm överlägsen den introitus). Incise hud och fascia. Var noga med att inte skada bukorganen (tarmar och urinblåsa) som är direkt under det tunna lagret av fascia.
7. Använda bomullspinnar, försiktigt sträcker fascian och leverera gravida livmodern genom snittet. Räkna det totala antalet foster genom att först identifiera höger och vänster äggstockarna så att du visualiserar hela livmodern. Placera livmodern tillbaka i bukhålan innan du fortsätter så att foster förblir varm medan du förbereder för injektioner.
8. Dra upp lämplig volym av material för antal foster du planerar att injicera. Medan fylla nålen med ditt prov, är det viktigt att hålla pipettspetsen nedsänkta för att undvika aspirerande ditt prov i microinjector slangen. Eftersom cellerna är i allmänhet i en liten volym, placerar vi dem vanligtvis i en liten mikrofugrör (ex: 0,5 mL) rör eller direkt på en bit Parafilm för att kunna fylla nålen utan att bryta pipettspetsen.
9. Försiktigt tag varje foster och identifiera den del av fostrets du planerar att injicera (t ex lever, bukhålan, ben, etc.). Med tummen och pekfingret, måste du stabilisera fostret inom amnionkaviteten så att den inte roterar när du utför injektionen. Det är viktigt att hålla fostret ordentligt tillräckligt för att stabilisera det ännu försiktigt nog för att inte skada den.
10. Försiktigt in pipetten genom livmodern, amnion och fostrets hud, och in i målorganet. Om pipetten är skarp, bör den lätt genom dessa vävnader. Om pipettspetsen är tråkigt, wi dig kommer att märka camping i livmodern och membran fostervatten. Injicera önskad volym i varje foster. Det är viktigt att dina rörelser vara stadig under tiden för införandet, injektion, och indragning av pipetten.
11. När önskad volym injiceras, återkalla pipetten försiktigt. Om det görs på rätt sätt, bör materialet läcker inte ut från amnionkaviteten eller livmoder. Om ett stort hål skapas i amnion, som man kan känna igen genom läckage av fostervatten, sedan överlevnad äventyras. Slutligen, för studier som involverar postnatal upptagningen skall alla foster får tekniskt perfekt injektioner eftersom det inte finns något sätt att urskilja injiceras och uninjected foster efter födseln.
12. Om du utför injektioner i fostrets lever, kan du ibland se blod i pipettspetsen efter att den dras tillbaka-Detta bekräftar du är i rätt läge och bör inte påverka överlevnaden. Om du utför intraperitonealt injektioner, sikta lite under lever hos foster. För intramuskulär injektion, kan du placera fostret att identifiera höft och lårbenet och injicera gluteus muskeln. Slutligen, för intraventrikulär injektioner, är det lätt att se koronala suturer att styra pipetten till lämpligt mål. För dessa injektioner, är något större kaliber pipetter som krävs för att penetrera skallen utan att bryta pipetten.
13. Därefter försiktigt i livmodern tillbaka in i bukhålan. Se till att det inte är vridet på sig själv eller kring sin vaskulära utbudet. Leverera 1 mL steril 1X PBS i moderns bukhålan att ersätta vätska som gick förlorat under förfarandet. Stäng snitt i två lager med en 5-0 flätad absorberbara suturer (ex: Vicryl). Först stänger fascian utan att skada den underliggande tarm eller urinblåsa, och stäng sedan huden.
14. Vid denna tid, kan efter förfarande mediciner ges för smärtlindring. Återgå varje injiceras hona till sin egen bur och placera buren på en värmande filt. Övervaka musen tills den är upprätt. Sätt sängkläder i buren och placera musen i ett lugnt område med musen anläggning där det inte bör störas (dvs. ingen bur rengöring) förrän några dagar efter leverans. Minimera eventuella ytterligare stress för djuret kommer att minska risken för tidig förlossning.
15. När du är klar med injektioner, rengöra pipetten två gånger med sterilt 1X PBS och en gång med 70% EtOH.
16. Injicerade kvinnor bör observeras dagligen för att försäkra att de återhämtar sig från förfarandet utan svårighet. Snittet bör kontrolleras med avseende svullnad, inflammation, sår separation, och andra tecken på infektion. Postoperativa smärtstillande medel kan ges vid behov.

3. Representativa resultat:

Överlevnad av den injicerade foster till begreppet leverans är den viktigaste begränsande faktorn för att nå framgång med denna teknik. Beroende på materialet sprutas och stam av möss som används, kan överlevnad variera. I allmänhet bör injektioner av hematopoetiska celler i vildtyp möss vid E14 resultera i minst 50% levande födda valpar. Högre överlevnad är möjliga beroende på såväl de tekniska aspekterna av injektionen samt egenskaperna hos de möss som injiceras.

Minimera trauma livmodern och fostervattnet membran är den viktigaste tekniska aspekten av detta protokoll. Sharp kommer liten kaliber pipetter resultera i minimal livmoder trauma under injektionen. Vi rekommenderar inte med vanliga injektionsnålar som kaliber av prefabricerade nålar är för stor och skulle resultera i ett stort hål i livmodern. Handgjorda glas injektion pipetter är de bara små kaliber nålar som kan utnyttjas för i livmodern injektioner. Noggrann och omsorgsfull kirurgisk teknik, inklusive skonsam hantering av livmodern och en kort bedövning är också avgörande för optimalt resultat.

Specifika egenskaper hos mottagaren möss som den genetiska bakgrunden, gestationsålder och kullstorlek kan också påverka överlevnaden. Vissa stammar av möss är mer mottagliga för tidig förlossning och graviditet förlust beroende på deras genetiska bakgrund. ¹⁵ Transgena djur med muskelkraft eller neurodegenerativa defekter kan ha en nedsatt förmåga att leverera foster vaginalt efter att ha genomgått en mittlinjen laparotomi. ⁸ Dessa dräktiga honor kan kräva leverans av kejsarsnitt. Vi har också funnit att gestationsålder vid tiden för injektion kan påverka lönsamheten. Foster som är yngre än embryonala dag 12 har lägre överlevnad än äldre foster. Slutligen har vi funnit att stora kullen storlekar (> 10 foster) tenderar att ha högre fostrets död efter injektionen. Uppmärksamhet både de tekniska aspekterna av denna teknik och de särskilda egenskaperna hos de möss som injiceras kan maximera överlevnaden av den injicerade foster.

ve_content "> När dessa metoder utförs korrekt, kan man förvänta sig att alla foster utsätts för den injicerade materialet. likhet med den postnatala inställning dock inte framgångsrik leverans av celler eller virus i livmodern inte alltid leder till givaren cell engraftment eller gen uttryck. Det engraftment av stamceller, till exempel, beror på flera faktorer som dos och källan till de transplanterade cellerna. På samma sätt är framgången av viral transduktion, delvis avgörs av vilken typ av virala vektorer. Man måste förstå de många faktorer som påverkar överlevnad, cellulär engraftment, och viral transduktion för att nå framgång med detta protokoll.

Figur 1. Diagram som visar korrekt slipning av injektionen pipetter (steg 1,4)

Discussion

Över 50 år sedan, Billingham, Brent, och Medawar används i utero transplantation på möss för att inducera tolerans mot främmande proteiner. Sedan ¹⁶ har flera varianter av denna teknik använts för att behandla frågor inom immunologi och stamcellsbiologi.

Protokollet beskrivs här är en av de mest tillgängliga metoderna för IUT. Den lever hos foster erbjuder ett enkelt visualiseras målet och ger tillgång till den systemiska cirkulationen via portalen och vener i levern. Dock har flera ändringar beskrivs i syfte att optimera tidpunkten och platsen för den önskade injektion. Till exempel kan injektioner hos foster yngre än E13.5 vara svårare eftersom livmodern inte är transparent. Om detta tillvägagångssätt är nödvändigt att studera tidigare händelser i utvecklingen, kan ultraljud-styrda injektioner används för att rikta vissa vävnader. Är också bra att styra injektion i särskilda organ, såsom hjärta eller lungor ¹⁷ Ultraljud vägledning. Intravenösa injektioner i vitelline ven ^18,19 har fördelen av att leverera celler direkt in i cirkulationen och kan tillåta för leverans av större volymer av celler. ⁵ Vi har avsiktligt beskrivit en generell metod för att utföra IUT hos möss så att läsaren har nödvändiga grunden för att nå framgång med dessa injektioner och kan skräddarsy dessa metoder till den specifika krävs ansökan.

Trots att den tas i bruk för att studera immuntolerans över 50 år sedan, finns det fortfarande viktiga frågor som IUT kommer vara lärorikt. Förmågan att inducera tolerans mot vissa främmande antigener genom att dessa förs in i fostrets miljö har visats i möss. Medan musen fostrets immunsystem utvecklas senare än större djur och kan påverka denna slutsats, de exakta mekanismerna genom ^4,6,7 som foster tolerans förekommer hos möss behöver studeras ytterligare. Sådana experiment kan belysa olika sätt att förbättra toleransen induktion hos människor. Även i möss, faktorer såsom tillgången på hematopoetisk nischer och konkurrensfördelar av värdceller fortsätta att begränsa framgång för stamceller engraftment. ³ Nuvarande strategier för att ytterligare undersöka detta är att manipulera specifika mekanismer i den mottagande immunförsvaret och optimera rutten, timing, och dosen av stamceller leverans. IUT i tidig graviditet möss är en idealisk modell där för att studera engraftment stamceller och differentiering.

IUT är ett kraftfullt verktyg för att förstå grundläggande frågor inom stamceller och utvecklingsbiologi. Definiera mekanismer som leder till fostrets tolerans mot antigener infördes i livmodern kommer att få stora konsekvenser för området stamcellstransplantation. Dessutom kan framgångsrik leverans av virala vektorer ger en behandling för enstaka gen sjukdomar. Tillgången till många transgena och muterade musstammar tillåter utredning roll specifika gener spela för att förändra den förväntade fenotyp. Den musmodell av IUT kommer utan tvekan att främja dessa områden och föra oss närmare att förverkliga deras fulla kliniska potential för behandling av patienter med missbildningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipettes	Kimble Chase	71900-100
Pipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-30
Microinjector	Narishige International	IM-300
Pipette sharpener	Sutter Instrument Co.	Model BV-10