Summary
במצבים ביולוגיים וקליניים רבים הוא יתרון ללמוד תהליכים תאיים כמו שהם להתפתח microenvironment הולדתם. כאן אנו מתארים את הרכבה ושימוש מיקרוסקופ סיב אופטי בעלות נמוכה אשר יכול לספק הדמיה בזמן אמת בתרבות התא, מחקרים בבעלי חיים, ומחקרים קליניים המטופל.
Abstract
מחקרים ביולוגיים וקליניים רבים דורשים את המחקר ניתוח האורך של מורפולוגיה ותפקוד עם רזולוציה ברמה התאית. באופן מסורתי, ניסויים רבים מופעלים במקביל, עם דגימות בודדות הוסרו מהמחקר בנקודות זמן רציפים להערכה על ידי מיקרוסקופ אור. טכניקות intravital פותחו מספר, עם confocal, multiphoton, וכן במיקרוסקופ הרמוני second כל הוכחת יכולתם לשמש עבור הדמיה 1 באתרה. בעזרת מערכות אלו, עם זאת, את התשתית הנדרשת הוא מורכב ויקר, הכוללים מערכות סריקת לייזר ומקורות אור מורכבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לתכנון והרכבה של microendoscope ברזולוציה גבוהה אשר יכול להיות בנוי בתוך יום באמצעות מדף רכיבים עבור תחת 5,000 דולר ארה"ב. הפלטפורמה מציעה גמישות מבחינת רזולוציית התמונה, בתחום של נוף, ופועל גל, ואנחנו מתארים כיצד פרמטרים אלה ניתן לשנות בקלות כדי לענות על הצרכים הספציפיים של משתמש הקצה.
אנו ואחרים בחנו את השימוש microendoscope ברזולוציה גבוהה (HRME) בתוך התרבות תאים במבחנה 2-5, ב 6 נכרת ורקמות חיים חיים 2,5, ו ברקמות אדם in vivo 2,7. המשתמשים דיווחו על שימוש שונה סוכני מספר בניגוד פלורסנט, כולל 2-4 proflavine, benzoporphyrin-נגזרות טבעת monoacid (BPD-MA) 5, ו fluoroscein 6,7, אשר כולם קיבלו מלא, או investigational אישור ה-FDA לשימוש בבני אדם. ברזולוציה גבוהה microendoscopy, בצורה המתוארת כאן, רשאי לערער על מגוון רחב של חוקרים העובדים בתחום מדעי בסיסי וקליני. השיטה מציעה גישה יעילה וחסכונית אשר משלים מיקרוסקופיה benchtop המסורתית, בכך שהיא מאפשרת למשתמש לבצע ברזולוציה גבוהה, הדמיה האורך באתרם.
Protocol
1. Microendoscope האסיפה
Microendoscope ברזולוציה גבוהה המתואר כאן (איור 1 א) צריך להיחשב תצורה בסיס עם כמה וריאציות אפשריות הרכבה היישום. אנו מתארים בפרוטרוט כאן התגלמות של הפלטפורמה אשר נועד לשמש proflavine כסוכן בניגוד ניאון. Proflavine הוא גרעיני כתם בהיר עם שיא קליטה ופליטה של אורכי גל 445 ננומטר 515 ננומטר, בהתאמה. השימוש סוכנים בניגוד אחרים ידרשו למשתמש לבחור עירור, פליטה, ומסננים dichroic כראוי. אלמנטים אחדים של microendoscope ברזולוציה גבוהה הם גנריים ניתן לקבל אצל ספקים מרובים. לדוגמה, רכיבי מיצוב optomechanical זמינים Thorlabs, ניופורט, Linos בין היתר. Compact מצלמות CCD זמינים מחברות מחקר כולל פוינט גריי, Prosilica ו Retiga; רגישות המצלמה יש לבחור עם שיקול של בהירות של fluorophore כדי לשמש, כמו גם את קצב הפריימים הרצוי. כוח גבוהה דיודות פולטות אור (LEDs) ניתן לקבל Luxeon, קריס, ועל Nichia בין היתר. סיבים אופטיים וצרורות זמינים Sumitomo, Fujikura, ואת שוט. בבחירת רכיבים עבור יישום מסוים, המשתמש צריך לשקול את היחסים הגלום מעורב מיקרוסקופ פלואורסצנטי בין ריכוז fluorophore, photobleaching, עוצמת תאורה, רגישות המצלמה, רווח, וזמן החשיפה.
- חבר את 6 "מוטות הכלוב של 1.5" מוטות לכלוב, כדי ליצור זוג 7.5 "מוטות ארוכים. בורג אלה מוטות בפניו אחת יחידה לקפל את המראה. בורג 0.5" מוטות בפניו את ההיפך. החלק את קוביית כלוב על מוטות בכלוב, באמצעות שתי התחתון דרך החורים. בורג את 2 "מוטות בפניו את הצד של הקובייה את הכלוב (1b דמות).
- צרף את המצלמה צלחת כלוב באמצעות C-mount למתאם SM1. אבטח את צלחת כלוב על 0.5 "מוטות הכלוב, סומק בפנים של יחידת מראה לקפל.
- הכנס את העדשה "צינור" לתוך צינור "3 עדשה ארוכה ובטוחה את העדשה עם הטבעת תמך. אורך המוקד של העדשה יש לבחור כזה ליבות של צרור סיבים אופטיים נדגמות על ידי לפחות שני פיקסלים כאשר מוקרן על גבי המצלמה. Drop המסנן פליטה לתוך הצינור על גבי הטבעת שמירה הראשונה, להוסיף עוד טבעת כדי לאבטח את המסנן במקום. ציית האמנה אוריינטציה לסנן המצוין על ידי היצרן לסנן. הברג את הצינור לתוך העדשה לצד כלוב קובייה הקרוב למצלמה CCD. שים לב, באיור 1c, זו העדשה מסנן מוצגים ללא צינור "3 עדשות בהירות.
- חבר את המצלמה למחשב ולהציג את התמונה על המסך. כוונו את הרכבה כלוב על אובייקט מרוחק להחליק את הקוביה בכלוב לאורך המסילה עד בתמונה מופיע להתמקד. נעל את הקוביה כלוב במיקום זה. (זוהי שיטה פשוטה להבטיח את העדשה צינור יהוו תמונה ממוקדת בשילוב עם העדשה, אינסוף תיקן אובייקטיבי).
- הכנס את המראה dichroic לתוך מחזיק המקום בשעה 45 ° בקוביה כלוב.
- בורג העדשה אובייקטיבי, באמצעות RMS למתאם SM1 חוט צינור עדשה מתכווננת, אל פניו של קוביית כלוב מול בעל עדשה צינור. Z-מתרגם ניתן להשתמש במקום צינור עדשה מתכווננת קל יותר להתמקד. בורג מחבר SMA לתוך צלחת כלוב ו הר זה על המוטות, בערך במרחק העבודה של העדשה אובייקטיבי.
- הר LED על צלחת הכלוב והחלק על סוף 2 "מוטות. הוסף העדשה 0.5" צינור עדשה כזו כאשר הצינור מוברג לתוך הצד של הקובייה את הכלוב, זה יהיה בצורת תמונה של ה-LED הממלא את הצמצם האחורי של העדשה אובייקטיבי. תצורה זו (קולר תאורה) תבטיח את פני הפרוקסימלי של צרור סיבים אופטיים הוא מואר באופן אחיד. הוסף את המסנן עירור על הצינור "0.5 עדשה ומאובטח במקום עם טבעת תמך (איור 1 ג).
- צרף מחבר SMA אל צרור סיבים אופטיים. בורג את צרור SMA connectorized אל כלי הקיבול SMA רכוב על מוטות הכלוב. כוונו את קצה דיסטלי של צרור לעבר מקור אור בפס רחב (תאורת פלורסנט יספיקו) ולבחון את התמונה של הפנים צרור הפרוקסימלי על המצלמה CCD. התאם את המיקום של העדשה אובייקטיבי על ידי הברגה פנימה או החוצה של קוביית את הכלוב עד התמונה צרור סיבים מופיע להתמקד. ליבות הפרט צריך להיות נראה בבירור (איור 2).
2. עדשה והחיוך האסיפה
הרזולוציה המרחבית של microendoscope יכול להיות מוגברת על ידי הצמדת עדשה מיקרו או הרכבה העדשה אל קצה דיסטלי של צרור סיבים. אופטיקה אלה מוגדרים כך במקום הנחת קצה צרור ישירות לרקמה, קצה היא הדמיה על פני השטח רקמות עם demagnification, ובכך להגדיל את תדר הדגימה המרחבי שמטיל אור guiding ליבות של צרור סיבים. מידת demagnification מתאים לגידול ברזולוציה מרחבית, ו באותו זמן, לירידה מידתית בתחום התצוגה של-. צבע מדד (והחיוך) מרכיבים עדשות תואמות, סיבים אופטיים ו זמינים GrinTech, NSG, שוט, בין היתר, יכול להיות קשור ישירות אל קצה דיסטלי של צרור סיבים.
- בחר העדשה והחיוך עם ההגדלה הרצוי ומרחק עבודה עבור היישום. ודא בקוטר של העדשה עולה על זו של צרור סיבים אתה מתכנן לעבוד איתו. אנו ממליצים כי את צרור סיבי העדשה והחיוך להיות מותקן על ציר נפרד 3 שלבים מיצוב ידנית תחת מיקרוסקופ כוח stereoscope נמוך או יישור מדויק לפני מליטה.
- מניחים טיפת דבק אופטי (למשל ריפוי בנורלאנד דבק UV) על העדשה או פנים צרור. תביאו את שני המרכיבים במגע באמצעות positioners ידנית. לחשוף את ממשק לאור UV על המנה המומלצת על ידי היצרן.
- כדי להגן על העדשה לחייך ממשק מלוכדות, אורך קצר של צינורות אלומיניום נימי (חלקים קטנים Inc) ניתן להשתמש כדי להקיף את המפרק. החלק את צינורות מעל המפרק ומאובטח במקום עם אפוקסי. צינורות חום לכווץ ניתן להשתמש כדי לסיים את ההרכבה.
3. Microendoscope הדמיה
- החל הסוכן בניגוד תאים או רקמות להיות צילמו. עם proflavine (0.01% w / v ב PBS), בתחום ההדמיה במבחנה של תאים בתרבית יכול להתבצע על ידי דגירה קצר (<1 דקות), שטיפה יסודית. הדמיה של דגימות רקמה לשעבר vivo או ברקמות vivo אפשרי ליישום אקטואלי הבאות של צבע. קליטת proflavine בתנאים אלה נמצא להיות כמעט מיידית, עם הדמיה אפשרי בתוך כמה שניות שנמשך מספר דקות.
- מניחים את צרור סיבים אופטיים במגע עם אור במדגם להיות הדמיה. כאשר תאים הדמיה בתרבות או דגימות רקמה לשעבר vivo, אנו ממליצים הרכבה הקצה הדיסטלי של צרור סיבים מתקן מאובטח עם שלבים מיצוב ידנית על צירים XYZ ליציבות במהלך ההדמיה.
4. נציג תוצאות:
כאשר התאספו כראוי, microendoscope יפעל כמו מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית, מועבר באמצעות צרור סיבים אופטיים קוהרנטית. לקבלת תוצאות הדמיה אופטימלית, יש לשים לב כדי להבטיח כי שלושה תנאים מרכזיים מתקיימים:
- הפנים הפרוקסימלי של צרור סיבים צריך להיות צילמו על מצלמה CCD ללא defocus, על מנת להשיג את הרזולוציה המלאה של המערכת. איור 2a, b, c להדגים חלק צרור סיבים צילמו עם פוקוס עניים, defocus קלה, ולהתמקד טוב, בהתאמה. המוקד האופטימלי נמצא על ידי התאמת עמדת צירית של העדשה אובייקטיבית יחסית מול צרור.
- הפנים הפרוקסימלי של צרור סיבים צריך להיות מואר באופן אחיד על פני קוטר המלא (שדה של נוף). כפי שמתואר טקסט Protocol (1.7), זו מושגת על ידי הגדרת אופטיקה תאורה לתאורה קולר. איור 2 מראה תמונה נרכש כאשר מדגם ניאון אחיד מואר בתצורה זו מועדפת, עם 2e איור הממחיש את התוצאה המתאימה תחת תאורה קריטיות. במקרה האחרון, המבנה של ה-LED היא הדמיה על הפנים חבילת סיבי, וכתוצאה מכך הופעתו של דפוס זה לא רצויים על גבי מבנה המדגם נכון.
- שני הפרצופים הפרוקסימלית ומ דיסטלי של צרור סיבים צריך להיות נקי ללא שריטות וצ'יפס. איור 2f מדגים את נוכחותם של פסולת מחוברת הפנים צרור, עם נזק בצורת שבב קטן בשעה 5 ב למתחם סיבים. רסיסים ניתן להסיר חבילה הפנים על ידי ניקוי באותו אופן כמו סיבים אופטיים מחברים קונבנציונלי, עם נייר העדשה isopropanol, או תקן סיב אופטי וכלי ניקוי. אם צד של צרור סיבים שרוט או סדוק, או אם הצרור הפסקות אורכו, הפנים עשוי להיות מלוטש שטוח ידי ידנית רגילה, או טכניקות ליטוש מכני. אנו ממליצים 12-15 מיקרומטר מלחכת נייר ליטוש גס ראשוני, עם ליטוש סופי על נייר 0.5-1.0 מיקרומטר.
איור 3a מראה הדמיה של 1483 תאים במבחנה, בעקבות תיוג מיקום proflavine עם אור של צרור סיבים חשופים על המדגם. איור 3b מראה את השיפור ברזולוציה מרחבית וצמצום בתחום התצוגה של-הניתנים על ידי העדשה חיוך 2.5x קשור קצה צרור. סרט 1 מדגים בתחום ההדמיה vivo של כרית שומן החלב במודל של עכברים. הנה צרור סיבים בקוטר 0.5 מ"מ החיצוניות (330 מיקרומטר בתחום של נוף) הועבר באמצעות מחט 21-מד מתקדמים לתוך הרקמה. בתאי שומן גלויים לעין, עם תנועה עקב מחזור לב ניכרת רכישה זו ב 15מסגרות לשנייה. איור 3c מדגים הדמיה של רירית הפה של מתנדב של אדם בריא, הפעם באמצעות צרור סיבים גדול בקוטר 1.5 מ"מ החיצוניות (1.4 מ"מ בתחום של נוף). בכל הדוגמאות הראו, proflavine שימש סוכן תיוג גרעיני פלורסנט לעומת זאת.
באיור 1. הרכבת microendoscope ברזולוציה גבוהה (HRME). (א) תרשים סכמטי של מערכת HRME. (ב) האסיפה של מבנה התמיכה העיקרי optomechanical. (ג) תוספת של אלמנטים אופטיים, LED תאורה, ואת המצלמה CCD. (ד) צילום של מערכת HRME, ארוז בתוך 10 "x 8" x המתחם "2.5.
איור 2. הגדרת HRME. דוגמאות הדמיה עם צרור סיבים אופטיים בפוקוס עניים (א), (ב) לסגור להתמקד טוב, (ג) להתמקד אידיאלי. ב (ד), יעד פלורסנט אחידה בקצה הדיסטלי של צרור הוא הדמיה תחת תאורה (אחיד) קולר. (ה) מטרה פלורסנט אחיד צילמו תחת תאורה קריטי, עם מבנה המקור לכאורה על האובייקט. (ו) Loose רקמות ותאי יכול לדבוק פני סיבים צרור, שגם היא נוטה נזק מזערי בפריפריה שלה.
איור 3. הדמיה עם HRME. (א) 1483 תאים במבחנה, צילמו עם צרור סיבים חשופים (IGN-08/30) בעקבות תיוג עם 0.01% proflavine (w / v). (ב) אותה תרבות 1483 התא כפי שמוצג (א), צילמו עם צרור סיבים עם עדשה והחיוך 2.5x המצורפת. (ג) מקדימה של רירית הפה נורמלי אדם in vivo, בעקבות יישום מקומי של 0.01% proflavine (w / v).
סרט 1. הדמיה משטח שומן החלב של עכבר דרך הכניסה של 450 מיקרומטר החיצוני צרור סיבים בקוטר בתוך לומן של מחט 21-מד עברה לתוך הרקמה. Proflavine 0.01% (w / v) נמסר לאתר הדמיה באמצעות מחט אותו לפני החדרת סיב הדמיה. לחץ כאן כדי לצפות וידאו
Discussion
הטכניקה ברזולוציה גבוהה microendoscopy המתואר כאן מספקת לחוקרים בתחומים בסיסיים מחקר ביו קליניים עם שיטה גמיש, חזק, וחסכוני המאפשר הדמיה פרט הסלולר באתרו. תיארנו פרוטוקול להרכבת מערכת הדמיה הדגימו את השימוש בו תרבית תאים במבחנה, בעלי חיים, ורקמות אדם in vivo. בעוד תוצאות ההדמיה שהוצגו כאן בשימוש proflavine כסוכן בניגוד ניאון, קבוצות אחרות הוכיחו גרסאות של מערכת עם אורכי גל תאורה ומסננים LED שנבחרו על מנת להתאים עירור / פליטת ספקטרום של צבעים אחרים 5-7.
רזולוציה ותחום של נוף נקבעים תחילה על ידי ריווח הליבה אל הליבה בקוטר הדמיה של צרור סיבים אופטיים. השתמשנו צרורות עם מרווח של כ 4 מיקרומטר הליבה הליבה, הדמיה בקטרים של 330 מיקרומטר (סרט 1), 720 מיקרומטר (איור 2, איור 3 א, ב), 1400 מיקרומטר (איור 3c). חבילות קטנות יותר יכולה להיות מועברת באמצעות מחטים מד צר באופן משמעותי גמישה יותר סיבים יותר. אנחנו ועוד 8 יש, במקרים מסוימים, ציין את המראה של פליטת autofluorescence מן הסיבים צרור עצמו. כאשר מנסים לעורר fluorophores באורכי גל UV, או לאסוף פליטה בטווח ספקטרלי אדום, יש לשים לב לרמת autofluorescence צרור סיבים התורמים האות הנמדד הכוללת.
בעוד רוב העבודה microendoscopy ברזולוציה גבוהה דיווח עדכני השתמשה צרור סיבים חשופים, הגדלה נוספת יכול להיות מסופק על ידי שימוש בעדשות והחיוך קשור קצה דיסטלי. עדשות והחיוך מציעים דרך פשוטה וחסכונית להגדיל רזולוציה מרחבית, למרות הרגישות שלהם סטיות אופטיות ומוגבל NA מוכרת היטב. אם העדשה אינה מספקת ביצועים והחיוך עבור יישום מסוים, חיוך היברידי / מטרות עדשה כדורי 9 או מיניאטורית עדשה assemblies אובייקטיבי 10-11 יכול להיות מועסק.
Microendoscope ברזולוציה גבוהה המתואר כאן בעצם פועל כמו מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית רחב בתחום, ולכן לא חתך אופטי (כמו מיקרוסקופיה confocal או קוי) צפוי. מניסיוננו, באמצעות עירור 455 ננומטר אור proflavine אקטואלי כסוכן לעומת זאת, אור נאסף בעיקר לעומק המתאים שכבות תאים בודדים.
פרוטוקול זה צריך לאפשר לקורא להרכיב את microendoscope ברזולוציה גבוהה על benchtop, עם טביעת רגל קומפקטית של 10 "x 8". אם תרצה בכך, המערכת עשויה להיות סגורים בתוך קופסה לבין רכיבים חשמליים (LED המצלמה) מופעל על ידי סוללה (איור 1d). מצלמות קומפקטיות רבות יכול להיות מופעל על ידי ה-IEEE-1394 (Firewire) ו יציאות ה-USB של המחשב המארח.
Disclosures
הפרלמנט dy אין לחשוף. RRK מחזיקה פטנטים הקשורים פלטפורמות הדמיה microendoscopic.
Acknowledgments
מחקר זה מומן בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, להעניק R01 EB007594, משרד הביטחון תוכנית לחקר סרטן השד, הצעה BCO74699P7, ואת סוזן ג Komen מענק קרן 26152/98188972.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | |
| LED | Thorlabs Inc. | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Objective lens | Thorlabs Inc. | RMS 10X | |
| Tube lens | Thorlabs Inc. | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD |
| Condenser lens | Thorlabs Inc. | ACL2520 | |
| Cage cube unit | Thorlabs Inc. | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | |
| Cage rods and plates | Thorlabs Inc. | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | |
| Fold mirror unit | Thorlabs Inc. | KCB1, PF10-03-G01 | |
| Lens tubes | Thorlabs Inc. | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | |
| Adapters / couplers | Thorlabs Inc. | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | |
| SMA connectors | Thorlabs Inc. | SM1SMA, 11040A | |
| LED driver | Thorlabs Inc. | LEDD1B TPS001 | |
| Fiber optic bundle | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |
References
- Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer. Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).
- Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope. Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).
- Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).
- Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring. Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).
- Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope. J. Microsc. 207, 108-117 (2002).
- Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -L., Sojic, N. Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle. Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).
- Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles. Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).
- Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).
- Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope. Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).
- Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems. Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).
