Summary
हम एक प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं माउस रेट्रोवायरल पारगमन का उपयोग कर उत्पादन प्रोटोकॉल वर्तमान
Abstract
टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) प्रतिरक्षा प्रणाली में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. टी सेल सतहों पर TCRs विशेष रूप से पेप्टाइड पेश प्रतिजन (APCs) कोशिकाओं 1 द्वारा प्रस्तुत प्रतिजनों की पहचान कर सकते हैं. यह मान्यता टी कोशिकाओं और कार्यात्मक परिणामों (जैसे cytokine उत्पादन लक्ष्य कोशिकाओं की हत्या) की एक श्रृंखला के सक्रियण के लिए होता है. TCRs के कार्यात्मक भूमिका को समझना महत्वपूर्ण है करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की शक्ति का दोहन करने के लिए इम्मुनोलोगि संबंधित रोगों (जैसे कैंसर या autoimmunity) की एक किस्म के इलाज के.
यह माउस मॉडल में TCRs, जो कई मायनों में पूरा किया जा सकता है है का अध्ययन करने के लिए सुविधाजनक है. बनाना TCR ट्रांसजेनिक माउस मॉडल महंगा है और समय लेने वाली है और वर्तमान में वहाँ केवल उन में से एक सीमित संख्या में 2-4 उपलब्ध हैं. वैकल्पिक रूप से, के साथ चूहों टी कोशिकाओं प्रतिजन विशेष हड्डी कल्पना मज्जा द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है. इस विधि भी कई सप्ताह लगते हैं और 5 विशेषज्ञता की आवश्यकता है. इन विट्रो सक्रिय माउस में टी कोशिकाओं में TCRs के रेट्रोवायरल transduction पेप्टाइड-MHC वांछित विशिष्टता की टी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक त्वरित और अपेक्षाकृत आसान विधि है. टी कोशिकाओं विशिष्ट एंटीजन एक सप्ताह में उत्पन्न किया जा सकता है और किसी भी बहाव के अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया. Transduced टी कोशिकाओं का अध्ययन भी मानव immunotherapy के लिए प्रत्यक्ष आवेदन किया है, मानव टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के रूप में विशिष्ट प्रतिजन TCRs साथ transduced कैंसर के इलाज के लिए 6 एक उभरते रणनीति है.
यहाँ हम एक retrovirally में इन विट्रो सक्रिय माउस टी कोशिकाओं में TCRs transduce प्रोटोकॉल उपस्थित थे. दोनों मानव और चूहे TCR जीनों इस्तेमाल किया जा सकता है. विशिष्ट TCR जीन ले जाने रेट्रोवायरस उत्पन्न कर रहे हैं और माउस विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ सक्रिय टी कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया. के बाद इन विट्रो विस्तार में transduced, टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry से विश्लेषण कर रहे हैं .
Protocol
1. रेट्रोवायरल निर्माण तैयार
- उप - रेट्रोवायरल वेक्टर में टी सेल रिसेप्टर (TCR) हित के जीन (चित्रा 1, उदाहरण के 7 pMSG वैक्टर, pMIGII 5,8, Cellbiolabs से pMXs) क्लोन. TCR α और β श्रृंखला जीन एक ही प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन एक ही सदिश पर बराबर अभिव्यक्ति को यह सुनिश्चित करना चाहिए. यदि ब्याज की TCR मानव है, मानव निरंतर डोमेन के लिए माउस लगातार 9 डोमेन द्वारा प्रतिस्थापित किया जा जरूरत है. हमारे टिप्पणी है कि कि पूर्ण लंबाई मानव TCRs stably टी कोशिकाओं माउस पर व्यक्त नहीं करते.
- उच्च गुणवत्ता प्लाज्मिड डीएनए Qiagen मैक्सी तैयारी किट या इसी तरह के उत्पाद का उपयोग कर तैयार है. प्लाज्मिड की एकाग्रता लगभग 1 μg / μL पर होना चाहिए.
2. अभिकर्मक और टी - सेल अलगाव
दिवस -1 (प्लेट पैकेजिंग कोशिकाओं)
- (बेनी ई, Cellbiolabs) प्लेटिनम ई trypsin EDTA के साथ रेट्रोवायरल पैकेजिंग कोशिकाओं हटाना और DMEM मीडिया के साथ बेअसर.
- 5 मिनट के लिए 1000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और DMEM मीडिया में सेल गोली resuspend.
- सेल नंबर निर्धारित और 6 / 0.6x10 एमएल कोशिकाओं पतला. प्लेट एक 10mm पाली lysine लेपित टिशू कल्चर की थाली में सेल निलंबन के 10 एमएल और 37 पर एक सेल इनक्यूबेटर में रातोंरात बढ़ने डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 .
0 दिवस (अभिकर्मक)
- अगली सुबह, एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच. कोशिकाओं लगभग 80% मिला हुआ होना चाहिए.
- धीरे थाली से मीडिया को हटा दें. कोशिकाओं को एक बार और 1x पीबीएस के साथ धो पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / Strep) के बिना 10 एमएल पूर्व गर्म, ताजा DMEM मीडिया जोड़ने.
(नोट: पेन / Strep अभिकर्मक के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं) - अभिकर्मक जटिल तैयार.
निम्नलिखित ए और बी के रूप में तैयार मिश्रण:मिक्स डीएनए प्लाज्मिड: एक 9 μg PCL पारिस्थितिकी प्लाज्मिड सहायक 6.3 μg OptiMEM 1.5 एमएल मिक्स बी: 2000 Lipopfectime 60 μL OptiMEM 1.5 एमएल
A और B के 5 मिनट के लिए अलग से कमरे के तापमान पर सेते
A और B के साथ धीरे मिश्रण और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते अभिकर्मक जटिल प्रपत्र. - धीरे बेनी ई कोशिकाओं में मिश्रण (कुल 3 एमएल) ड्रिप. धीरे थाली आगे और पीछे रॉक अभिकर्मक मिश्रण समान रूप से वितरित.
- 37 में कोशिकाओं सेते ° सी / 5% एक सेल इनक्यूबेटर में सीओ 2.
- 6-8 घंटे के बाद, ताजा DMEM मध्यम वायरल उत्पादन के लिए 10 एमएल (पेन / Strep के साथ) के साथ मध्यम जगह.
एंटीबॉडी के साथ कोट प्लेट
- माउस टी - कोशिकाओं वायरल पारगमन पहले सक्रिय हो की जरूरत है. वहाँ एक किस्म के तरीके टी कोशिकाओं को सक्रिय कर रहे हैं. यहाँ हम थाली बाध्य विरोधी CD3e और विरोधी CD28 एंटीबॉडी का उपयोग करें. विरोधी CD3e के 1 μg एमएल / और 2 बाँझ पीबीएस विरोधी CD28 के μg / एमएल के एक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें.
- 24 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति की थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए एंटीबॉडी के मिश्रण के 250 μL बग़ैर. थाली 4 डिग्री सेल्सियस या 2 घंटे में रातोंरात लेपित 37 पर कर सकते हैं डिग्री सेल्सियस
माउस तिल्ली से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी
- हार्वेस्ट माउस तिल्ली और RPMI मध्यम करने के लिए स्थानांतरण.
- एक सेल झरनी में तिल्ली प्लेस. मैश एक 5 सेमी टिशू कल्चर थाली में एक सिरिंज सवार के साथ तिल्ली. बाँझ के साथ सेल झरनी पीबीएस बंद कोशिकाओं कुल्ला.
- 1000 XG, 5 मिनट अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें. ACK lysing बफर में Resuspend सेल गोली (तिल्ली प्रति 2 एमएल). कमरे के तापमान पर 2 से 3 मिनट सेते हैं. RPMI मध्यम जोड़ें 20 एमएल और 5 मिनट के लिए 1000 XG अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें. बाँझ पीबीएस में Resuspend सेल गोली. 5 मिनट के लिए सेल नंबर और अपकेंद्रित्र 1000 XG 4 डिग्री सेल्सियस का निर्धारण टी सेल के अलगाव के लिए आगे बढ़ें.
अलगाव और टी कोशिकाओं माउस के सक्रियण
- चुंबकीय उत्पाद पुस्तिका (CD8 + टी सेल Miltenyi बायोटेक से अलगाव किट) के अनुसार कोशिकाओं लेबल.
- मीटर में लोकसभा स्तंभ (Miltenyi बायोटेक) प्लेसagnetic क्षेत्र. स्तंभ पर लेबल सेल निलंबन लागू करें. के माध्यम से प्रवाह (माउस CD8 + टी कोशिकाओं समृद्ध) लीजिए. कॉलम 3 एमएल बफर के साथ उत्पाद पुस्तिका के अनुसार तीन बार धो लें और प्रवाह के माध्यम से पिछले के साथ गठबंधन.
- विरोधी CD3e और विरोधी CD8a एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग और प्रवाह cytometry (2a चित्रा) द्वारा विश्लेषण. एक ठेठ जुदाई के लिए ~ 8-10% कुल कोशिकाओं की अलग किया जा सकता है. ~ अलग कक्षों का 90% CD8 + टी कोशिकाओं रहे हैं.
- 1000 XG, 5 मिनट में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. पुनः संयोजक मानव आईएल (rhIL2, 20 एनजी / एमएल) 1x10 पर 6 एमएल / 2 के साथ गोली RPMI मध्यम में सेल Resuspend .
- कोशिकाओं को जोड़ने से पहले, एंटीबॉडी समाधान प्लेट (2.11 में पहले से तैयार) से हटा दें. बाँझ पीबीएस और हटायें पीबीएस के साथ एक अच्छी तरह कुल्ला.
- सेल निलंबन के 1 एमएल प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें. 37 ° सी / 5% एक सेल इनक्यूबेटर में सीओ 2 पर थाली रखो.
3. (2 दिन और 3 दिन) सक्रिय के संक्रमण टी कोशिकाओं
- वायरस उत्पादन के 2 दिनों के बाद, बेनी ई सेल थाली में मध्यम पीला हो जाना चाहिए. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब वायरल सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. आगे वायरल उत्पादन (वैकल्पिक) के लिए थाली करने के लिए ताजा DMEM माध्यम के 10 एमएल जोड़ें.
- 5 से कोशिकाओं मलबा हटाने मिनट के लिए 1000 XG पर वायरस की सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र. ध्यान से एक नया ट्यूब वायरस सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. कुछ तरल ट्यूब के नीचे छोड़ दो और कोशिकाओं मलबे को परेशान नहीं है.
- लीजिए थाली से एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में टी कोशिकाओं को सक्रिय. सेल नंबर का निर्धारण करते हैं. कुछ कोशिकाओं को एक अलग नकारात्मक नियंत्रण (संयुक्त राष्ट्र transduced) के रूप में इस्तेमाल किया जा ट्यूब में सहेजें. 5 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- 6 10 1 एमएल प्रति कोशिकाओं में 20 एनजी / एमएल rhIL2 और 10 μg / एमएल protamine सल्फेट के साथ वायरस सतह पर तैरनेवाला में सेल गोली Resuspend. एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें. RPMI माध्यम rhIL2 और protamine सल्फेट का एक ही राशि के साथ एक ही सेल घनत्व पर नियंत्रण ट्यूब में कोशिकाओं Resuspend. एक ही थाली में कोशिकाओं जोड़ें.
- लपेटें प्लास्टिक की फिल्म के साथ प्लेट. 2000 XG 90 मिनट अपकेंद्रित्र, कोई ब्रेक नहीं के साथ 32 ° C.
- Centrifugation के बाद, प्लास्टिक की फिल्म से हटा दें. 20 एनजी / एमएल rhIL2 के साथ एक अच्छी तरह से करने के लिए ताजा RPMI माध्यम के 1 एमएल जोड़ें. थाली वापस रखो इनक्यूबेटर के लिए.
- (वैकल्पिक) TCR की उच्च अभिव्यक्ति के स्तर वायरस की सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा और 3 दिन संक्रमण प्रक्रिया दोहरा द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
4. कक्ष का विस्तार और पारगमन क्षमता का मूल्यांकन
- जांच टी कोशिकाओं दैनिक transduced. 01:03 RPMI मध्यम rhIL2 में जब आवश्यक अनुपात में कक्षों भाजित. कोशिकाओं को अधिक बढ़ना (मध्यम पीले रंग बदल जाता) मत देना.
- 6 दिन या 7 दिन, एंटीबॉडी और MHC TCR लिए विशिष्ट tetramer टी कोशिका की सतह पर TCR की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के साथ कोशिकाओं के दाग. का प्रयोग करें नियंत्रण के रूप में टी कोशिकाओं (चित्रा 2c) संयुक्त राष्ट्र transduced.
- टी कोशिकाओं transduced आगे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
यह अक्सर लाभप्रद पारगमन पहले टी सेल सबसेट शुद्ध हालांकि splenocytes शुद्धि के बिना transduced किया जा सकता है है. उच्च शुद्धता टी सेल सबसेट वाणिज्यिक चुंबकीय मोतियों (2a चित्रा) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.
टी कोशिकाओं पर TCRs की अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए, TCR अल्फा या बीटा चेन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता है. आमतौर पर 30 से कोशिकाओं के 80% व्यक्त कर सकते हैं (चित्रा 2b) TCR transduced TCR जीनों और वायरस titers पर निर्भर करता है. MHC TCR के लिए tetramer विशिष्ट भी आगे TCRs के कार्यात्मक अभिव्यक्ति (चित्रा 2c) की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1. टी सेल रिसेप्टर जीन के उदाहरण का निर्माण उप क्लोन रेट्रोवायरल वेक्टर में पूर्ण लंबाई अल्फा और बीटा श्रृंखला जीन एक आत्म cleavable 2A पेप्टाइड linker 8 से जुड़े हुए हैं .
चित्रा 2. सफल और टी कोशिकाओं माउस के अलगाव पारगमन के उदाहरण (क) CD8 टी कोशिकाओं CD8a + टी सेल अलगाव किट (Miltenyi बायोटेक) और विरोधी CD3e और विरोधी CD8a एंटीबॉडी के साथ दाग का उपयोग splenocytes से अलग थे . 209 -217 4 और विरोधी मानव Vbeta 8 (ख) एंटीबॉडी और एचएलए A2kb gp100 tetramer (ग) के साथ पेप्टाइड दाग: CD8 टी कोशिकाओं मानव gp100 R6C12 TCR विशिष्ट के साथ पृथक transduced थे.
Discussion
कई चरणों इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. बेनी ई पैकेजिंग सेल लाइन स्वस्थ हालत में रखा जाना चाहिए. यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं μg 1 / एमएल puromycin, 10 μg / एमएल blasticidin रेट्रोवायरल संरचना प्रोटीन अभिव्यक्ति की हानि को रोकने के साथ DMEM माध्यम से एक बार कुछ passaged कर सकते हैं. अभिकर्मक के दिन पर, कक्षों ~ 80% मिला हुआ होना चाहिए. बहुत कुछ या बहुत सारे कोशिकाओं वायरस टिटर को कम कर सकते हैं. वायरस गुणवत्ता सेल लाइनों है कि आसानी से transduced किया जा सकता है पर परीक्षण द्वारा जाँच की जा सकती है. चूंकि TCRs CD3 परिसरों कोशिका की सतह पर व्यक्त करने की आवश्यकता है, हम नियमित 58α-/β- हाइब्रिडोमा 10 कोशिकाओं (एक सेल लाइन है कि अंतर्जात TCR α या β श्रृंखला व्यक्त नहीं करता, लेकिन व्यक्त CD3 जटिल करता है) का उपयोग. हम हाइब्रिडोमा कोशिकाओं के लगभग 100% पारगमन दक्षता प्राप्त जब यह वायरस की सतह पर तैरनेवाला के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं के लिए transducing. अंत में, टी कोशिकाओं को सक्रिय proliferating क्योंकि retrovirus केवल सक्रिय विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं की जरूरत है.
विधि विशिष्ट प्रतिजन टी कोशिकाओं के उत्पादन कई सीमाएँ हैं के लिए यहाँ प्रस्तुत किया. सबसे पहले, यह मुश्किल है प्राथमिक माउस टी कोशिकाओं के लिए 100% पारगमन क्षमता तक पहुँचने के लिए. कोशिकाओं के एक हिस्से ब्याज की TCR व्यक्त नहीं. दूसरा, TCR α transduced और β चेन अंतर्जात TCRs के साथ 9 mispair कर सकते हैं, जो ब्याज की TCR की अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर सकते हैं . इसके अलावा, mispaired TCRs 11 vivo में autoimmunity के कारण हो सकता है . अंत में, वहाँ केवल एक सीमित समय सीमा transduced टी कोशिकाओं को इस्तेमाल किया जा सकता है. एक सप्ताह के आसपास के बाद, कोशिकाओं जा रहा है फिर उत्तेजित जब तक apoptosis से गुजरना. हालांकि, कोशिकाओं समाप्त हो और दोहराव पुनः stimulations के साथ कार्य खो सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एनआईएच (5U01CA137070) से अनुदान और अमेरिकन कैंसर सोसायटी (RSG-09-070-01-LIB), एक कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट अन्वेषक पुरस्कार (एम के), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप (किमी) और के द्वारा समर्थित किया गया एक स्पेनिश मंत्रालय शिक्षा और विज्ञान फैलोशिप (APG) के.
हम प्रोटोकॉल के लिए उपयोगी सुझाव के लिए धन्यवाद डॉ. निकोलस Restifo और डॉ. Zhiya यू (NIH / NCI) करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
