Summary
Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol mevcut
Abstract
T-hücre reseptörleri (TCRS), bağışıklık sisteminde merkezi bir rol oynar. T-hücre yüzeyleri TCRS özellikle peptid antijenleri, antijen sunan hücreler (APC) 1 tarafından sunulan tanıyabilirsiniz . Bu tanıma, T-hücrelerinin (örneğin sitokin üretim, hedef hücrelerinin öldürülmesi) fonksiyonel sonuçlarının bir dizi aktivasyonu yol açar. TCRS işlevsel rolünü anlamak immünoloji ile ilgili hastalıklar (örneğin, kanser veya otoimmünite) çeşitli tedavi etmek için bağışıklık sisteminin gücünü kritik öneme sahiptir.
Bu fare modelleri, çeşitli şekillerde yapılabilir TCRS, çalışma için uygundur. TCR transgenik fare modelleri, masraflı ve zaman alıcı ve şu anda 2-4 bunlardan sadece sınırlı sayıda vardır . Alternatif olarak, fareler ile T-hücrelerinin antijen spesifik chimera kemik iliği tarafından oluşturulan olabilir. Bu yöntem aynı zamanda birkaç hafta sürer ve uzmanlığı 5 gerektirir . , In vitro aktive fare T-hücrelerine TCRS retroviral transdüksiyon istenen peptid-MHC özgüllüğü T hücreleri elde etmek için hızlı ve nispeten kolay bir yöntemdir. Antijen spesifik T-hücrelerinin, bir hafta içinde oluşturulan ve herhangi bir alt uygulamalarda kullanılabilir. T-hücrelerinin transduced incelenmesi insan immünoterapi doğrudan uygulama, insan T-hücrelerinin evlatlık transferi olarak antijen-spesifik TCRS transduced, kanser tedavisi 6 için gelişmekte olan bir stratejidir .
Burada retrovirally, in vitro aktive fare T-hücrelerinin içine TCRS uyum sağlamak bir protokol mevcut . Insan ve fare TCR genleri her ikisi de kullanılabilir. Spesifik TCR genleri taşıyan Retrovirüsler üretilen ve fare anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile aktive T hücreleri enfekte etmek için kullanılır. T-hücrelerinin, in vitro genişleme transduced sonra flow sitometri ile analiz edilir.
Protocol
1. Retroviral Construct hazırlayın
- Alt klon retroviral bir vektör içine ilgi T-hücre reseptör (TCR) geni (Şekil 1, 7 PMSG örnek vektörler, pMIGII 5,8, Cellbiolabs gelen pMXs). TCR α ve β zincir gen eşit ifade sağlamak için, aynı organizatörü kontrol altında aynı vektör olmalıdır. Ilgi TCR insan ise, insan sürekli etki fare sabit etki alanı 9 değiştirilmesi gerekir. Bizim gözlem de tam boy insan TCRS stably fare T-hücrelerinin ifade yoktur.
- Yüksek kalite plazmid DNA Qiagen Maxi Hazırlık Seti veya benzer bir ürün kullanarak hazırlayın. Plazmid konsantrasyonu yaklaşık 1 mcg / ml olmalıdır.
2. Transfeksiyon ve T-hücre İzolasyon
Gün -1 (Levha ambalaj hücreleri)
- Platin-E (Plat-E, Cellbiolabs) tripsin-EDTA ile retroviral ambalaj hücreleri yerinden oynatın ve DMEM medya ile nötralize.
- 5 dakika için 1000 xg'de hücrelerin santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve DMEM medya hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin.
- Hücre sayısını belirlemek ve 0.6x10 6 / mL hücreleri sulandırmak. Plaka 10mm bir poli-lizin kaplı doku kültürü plakasını hücre süspansiyonu 10 ml ve 37 kuvöz bir hücre gecede büyümek ° C,% 5 CO 2.
Gün 0 (Transfeksiyon)
- Ertesi sabah, hafif bir mikroskop altında hücrelerin inceleyin. Hücrelerin yaklaşık% 80 konfluent olmalıdır.
- Plaka medya yavaşça çıkarın. 1x PBS ile bir kez yıkayın ve hücrelerin Penisilin-Streptomisin (Pen / Strep) olmadan 10 ml önceden ısıtılmış, taze DMEM medya ekleyin.
(Not: Kalem / Strep transfeksiyon engelleyebilir) - Transfeksiyon kompleksi hazırlayın.
A ve B aşağıdaki gibi karışımı hazırlayın:Plazmid DNA: A karıştırın 9 mikrogram plazmid PCL-Eco yardımcı 6.3 mikrogram OptiMEM 1,5 mL Mix B: Lipopfectime 2000 60 mcL OptiMEM 1,5 mL
Oda sıcaklığında 5 dakika için ayrı ayrı A ve B inkübe
Nazikçe A ve B karıştırın ve transfeksiyon kompleks oluşturacak şekilde oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. - Plat-E hücrelerin içine yavaş yavaş karışımı (toplam 3 ml) damla. Yavaşça plaka transfeksiyon karışımı eşit olarak dağıtmak için ileri geri sallayın.
- 37 ° hücreleri inkübe ° C /% 5 CO 2 hücre inkübatör.
- 6-8 saat sonra taze DMEM orta viral üretimi için 10 ml (Kalem / Strep ile) orta yerine.
Antikorlar ile Coat plaka
- Fare T-hücrelerinin viral transdüksiyon önce aktif hale getirilmesi gerekir. T-hücrelerinin aktive etmek için çeşitli yolları vardır. Burada plaka bağlı anti-CD3e ve anti-CD28 antikorları kullanın. 1 mcg / ml ve anti-CD3e 2 mcg / ml steril PBS anti-CD28 antikor karışımı hazırlayın.
- 24-iyi bir doku kültürü plakasının her bir kuyunun 250 mcL antikor karışımı koyun. Plaka 37 4 ° C veya 2 saat gece kaplı ° C.
Fare dalak tek hücre süspansiyonu hazırlanması
- Hasat fare dalak ve RPMI medyum transfer.
- Dalak bir hücre süzgeç koyun. 5 cm doku kültürü plaka içine bir şırınga pistonu ezerek dalak. Steril PBS ile hücre süzgeç kapalı hücre durulayın.
- 1000 xg, 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatant atın. ACK parçalama tampon yeniden süspanse hücre pelet (dalak başına 2 ml). Oda sıcaklığında 2 ila 3 dakika inkübe edin. 20 ml RPMI orta ekleyin ve 5 dakika boyunca 1000 xg santrifüj.
- Süpernatant atın. Steril PBS içinde yeniden süspanse hücre pelet. 4 5 dakika hücre sayısı ve santrifüj ile 1000 xg ° C belirleyin T-hücre izolasyonu devam edin.
Fare T-hücrelerinin izolasyonu ve aktivasyon
- Manyetik ürün kılavuzuna (CD8 + Miltenyi Biotec T-hücre izolasyon kiti) göre hücrelerin etiket.
- M bir LS sütun (Miltenyi Biotec) yerleştirin.agnetic alanında. Etiketli hücre süspansiyonu sütun üzerine uygulayın. (Fare CD8 + T-hücrelerinin zenginleştirilmiş) ile akış toplayın. Ürün kılavuzuna göre 3 mL tampon sütun üç kez yıkayın ve flow-through önceki birleştirmek.
- Leke ve anti-CD3e ve anti-CD8a antikorlar ile hücreler flow sitometri ile analiz (Şekil 2a). Tipik bir ayırma için, yaklaşık% 8-10 toplam hücreleri izole edilebilir. ~ Izole hücrelerinin% 90, CD8 + T-hücrelerinin.
- 1000 xg, 5 dakika hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı atın. Rekombinant insan IL-2 (rhIL2, 20 ng / ml) 1x10 6 / ml RPMI medyum içinde hücre pelletini tekrar.
- Sadece hücreleri eklemeden önce, plaka (2.11 önceden hazırlanmış) antikor çözüm kaldırmak. Her steril PBS ve kaldır PBS ile iyice durulayın.
- 1 ml hücre süspansiyonu, her bir kuyunun ekleyin. 37 ° C /% 5 CO 2 inkübatör bir hücre tabak koyun.
3. Aktif (Gün 2 Gün 3) Enfeksiyon T-hücrelerinin
- 2 gün sonra virüs üretim, Plat-E hücre plakasını orta sarı haline gelmelidir. 15 ml konik tüp viral süpernatant aktarın. Daha fazla viral üretim plaka (isteğe bağlı) 10 ml taze DMEM orta ekleyin.
- Hücrelerin enkaz kaldırmak için 5 dakika için 1000 xg'de virüs süpernatant santrifüjleyin. Yeni bir tüp virüs süpernatant dikkatlice aktarın. Borunun alt kısmında bir miktar sıvı bırakın ve hücrelerin enkaz rahatsız etmeyin.
- Toplayın plakadan 50 ml konik tüp içine T-hücrelerinin aktive. Hücre sayısını belirler. (Un transduced) negatif kontrol olarak kullanılmak üzere ayrı bir tüpe bazı hücreler kaydedin. 5 dakika için 1000 xg'de santrifüjleyin ve supernatant atın.
- 20 ng / ml rhIL2 ve 10 mg / ml protamin sülfat ile 1 ml başına 10 6 hücre virüs süpernatant hücre pelletini tekrar. 24 plaka her bir kuyu için 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin. Aynı miktarda rhIL2 ve protamin sülfat ile aynı hücre yoğunluğu RPMI orta kontrol tüpü hücrelerin tekrar Hücreler aynı plaka ekleyin.
- Plaka plastik film ile sarın. Herhangi bir fren ile 32 ° C'de 90 dakika, 2000 xg'de santrifüjleyin.
- Santrifüj sonra, plastik folyoyu çıkarın. 1 ml taze RPMI medyum her bir kuyu için 20 ng / ml rhIL2 ekleyin. Inkübatör geri plaka koyun.
- (Isteğe bağlı) TCR Yükseköğretim ekspresyon seviyesi virüs süpernatant toplama ve 3. gününde enfeksiyon prosedürü tekrar elde edilebilir.
4. Hücre Genişleme ve İletimi Verimliliği Değerlendirme
- Inceleyin günlük T-hücrelerinin transduced. Split gerektiğinde RPMI orta rhIL2 01:03 oranları hücreler. Hücreleri büyümek (orta sarıya döner) izin vermeyin.
- Günde 6 ya da 7 gün, antikor ve T-hücre yüzeyinde TCR ifade değerlendirmek için TCR için özel bir MHC tetramer ile hücre leke. Kullanarak kontrol olarak T hücreleri (Şekil 2c) un transduced.
- T-hücrelerinin transduced daha aşağı uygulamalar için hazır.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Splenositlerin arıtma olmadan transduced olmasına rağmen transdüksiyon önce T-hücre alt arındırmak için genellikle avantajlıdır. Yüksek saflıkta T-hücre alt grupları, ticari manyetik boncuk (Şekil 2a) kullanılarak elde edilebilir.
T-hücrelerinin TCRS ifade düzeyini değerlendirmek için, TCR alfa veya beta zincirleri için özel antikorlar kullanılabilir. Genellikle hücrelerin% 30 -% 80 ifade TCR genleri ve virüs titreleri bağlı olarak TCR transduced (Şekil 2b). MHC tetramer özgü TCR için daha da işlevsel TCRS ifade (Şekil 2c) doğrulamak için kullanılan olabilir.
Şekil 1. Örnek T-hücre reseptör geni inşa alt klonlanmış retroviral bir vektör içine kendi kendine cleavable 2A peptid ilintileyici 8 Tam boy alfa ve beta zincirinin genleri ile bağlantılı.
Şekil 2. Fare T-hücrelerinin başarılı bir şekilde izolasyonu ve transdüksiyon Örnek (a) CD8 T hücreleri kullanarak splenositlerin CD8a + T Hücre İzolasyon Kiti (Miltenyi Biotec) ve anti-CD3e ve anti-CD8a antikorlar ile boyanarak izole edilmiştir. 209 -217 4 peptid anti-insan Vbeta 8 antikor (b) ve HLA-A2kb gp100 tetramer (c) ve vitray: CD8 T hücreleri izole insan gp100 R6C12 TCR özel transduced edildi.
Discussion
En iyi sonuçları elde etmek için birkaç adım kritik öneme sahiptir. Plat-E ambalaj hücre hattı sağlıklı bir durumda tutulmalıdır. Gerekirse, hücrelerin retroviral yapısı protein ekspresyonu kaybını önlemek için 1 mcg / ml puromycin, 10 mcg / ml blasticidin DMEM ortamda bir kaç kez geçişli olabilir. Transfeksiyon gününde, hücrelerin ~ 80% birleşmiş olmalıdır. Çok az ya da çok fazla hücreleri virüs titresi azaltabilir. Virüs kalitesi kolayca transduced hücre hatları üzerinde test ederek kontrol edilebilir. TCRS CD3 kompleksleri hücre yüzeyinde ifade edilmesi gerektiğinden, rutin kullanımı 58α-/β- hibridoma hücrelerin 10 (endojen TCR α veya β zinciri ifade, ancak ifade CD3 kompleksi değil bir hücre hattı). Hücreleri virüs süpernatant 1 ml ile uyum hibridoma hücreleri yaklaşık 100% transdüksiyon etkinliğini edinin. Son olarak, T-hücrelerinin aktive retrovirüs sadece aktif hücreler bölünerek bulaşabilir çünkü prolifere gerekir.
Bu yöntem, antijen-spesifik T-hücrelerinin bazı sınırlamaları vardır üretmek için buraya sundu. İlk olarak, birincil fare T-hücrelerinin% 100 transdüksiyon etkinliğini ulaşmak için zordur. Hücrelerin bir kısmı faiz TCR ifade yoktur. İkincisi, TCR transduced α ve β zincirleri ilgi TCR ifade düzeyini azaltabilir, endojen TCRS 9 mispair. Buna ek olarak, in vivo 11 mispaired TCRS otoimmünite neden olabilir. Son olarak, sadece sınırlı bir zaman diliminde, T-hücrelerinin kullanılabilir transduced vardır. Yaklaşık bir hafta sonra, hücreler yeniden-uyarılmış sürece apoptoz uğrarlar. Ancak, hücreler tükenebilir ve tekrarlayan yeniden tesir ile fonksiyonları kaybetmek olabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH (5U01CA137070) hibe ve Amerikan Kanser Derneği (RSG-09-070-01-LIB), Kanser Araştırma Enstitüsü Araştırmacı Ödülü (MK), Amerikan Kalp Derneği, ön-doktora bursu (KM) ve desteklenmiştir. , Eğitim ve Bilim Bursu (APG) bir İspanyol Bakanlığı.
Biz protokol yararlı önerileri için teşekkür Dr. Nicholas Restifo ve Dr. Zhiya Yu (NIH / NCI) istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
