Summary
We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale transductie
Abstract
T-cel-receptoren (TCRs) spelen een centrale rol in het immuunsysteem. TCRs op T-cel oppervlakken kunnen herkennen specifiek peptide-antigenen gepresenteerd door antigeen presenterende cellen (APC's) 1. Deze erkenning leidt tot de activatie van T-cellen en een reeks van functionele uitkomsten (bv. cytokine productie, het doden van de doelwitcellen). Inzicht in de functionele rol van TCRs is van cruciaal belang om de kracht van het immuunsysteem harnas aan een verscheidenheid van immunologie gerelateerde ziekten (zoals kanker of auto-immuniteit) te behandelen.
Het is handig om TCRs in muis modellen, die kan worden bereikt op verschillende manieren te bestuderen. Het maken van TCR transgene muis modellen is duur en tijdrovend en momenteel zijn er slechts een beperkt aantal van hen beschikbaar 2-4. Als alternatief, muizen met antigeen-specifieke T-cellen kan worden gegenereerd door het beenmerg hersenschim. Deze methode neemt ook een aantal weken en vereist expertise 5. Retrovirale transductie van TCRs in in-vitro-geactiveerde muis T-cellen is een snelle en relatief eenvoudige methode om T-cellen van de gewenste peptide-MHC specificiteit te verkrijgen. Antigeen-specifieke T-cellen kunnen worden gegenereerd in een week en gebruikt in een afgeleide toepassingen. Studeren getransduceerde T-cellen ook rechtstreeks van toepassing voor de menselijke immunotherapie heeft als adoptieve overdracht van menselijke T-cellen getransduceerd met antigeen-specifieke TCRs is een nieuwe strategie voor de behandeling van kanker 6.
Hier presenteren wij een protocol om retrovirally TCRs transduceren in in-vitro-geactiveerde muis T-cellen. Zowel de mens en muis TCR genen kunnen worden gebruikt. Retrovirussen die specifieke TCR-genen worden gegenereerd en gebruikt om de muis T-cellen geactiveerd met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen infecteren. Na in vitro expansie, getransduceerde T-cellen worden geanalyseerd door middel van flow cytometrie.
Protocol
1. Bereid Retrovirale Construct
- Sub-kloon van de T-cel receptor (TCR) gen van belang in een retrovirale vector (Figuur 1, voorbeeld vectoren PMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs uit Cellbiolabs). De TCR α-en β-keten gen moet op dezelfde vector onder de controle van dezelfde promotor gelijke meningsuiting. Als de TCR van belang is de mens, de menselijke constante domeinen moeten worden vervangen door de muis constante domeinen 9. Onze observatie is dat de volledige lengte menselijke TCRs niet stabiel te drukken op de muis T-cellen.
- Bereid hoge kwaliteit plasmide DNA met behulp van Qiagen Maxi Prep Kit of een soortgelijk product. De concentratie van het plasmide moet op ongeveer 1 ug / ul.
2. Transfectie en T-cel-isolatie
Dag -1 (Plate verpakking cellen)
- Verjagen Platinum-E (Plat-E, Cellbiolabs) retrovirale verpakking cellen met trypsine-EDTA en te neutraliseren met DMEM media.
- Centrifugeer de cellen bij 1000 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in DMEM media.
- Bepaal het aantal cellen en verdun de cellen op 0.6x10 6 / ml. Plaat 10 ml celsuspensie in een 10mm poly-lysine gecoate weefselkweek plaat en 's nachts in een cel incubator bij 37 ° C te groeien, 5% CO 2.
Dag 0 (transfectie)
- De volgende ochtend, onderzoekt de cellen onder een lichtmicroscoop. De cellen moet ongeveer 80% confluent.
- Verwijder de media uit de plaat. Een keer wassen van de cellen met 1x PBS en voeg 10 ml voorverwarmde, verse DMEM media zonder penicilline-streptomycine (Pen / Strep).
(Opmerking: Pen / Strep kunnen interfereren met de transfectie) - Bereid transfectie complex.
Bereid mix A en B als volgt:Mix A: Plasmide DNA 9 microgram PCL-Eco helper plasmide 6,3 microgram OptiMEM 1,5 ml Mix B: Lipopfectime 2000 60 pi OptiMEM 1,5 ml
Afzonderlijk incubeer A en B gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur
Meng A en B samen en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur transfectie complexe vorm. - Langzaam druppelen het mengsel (totaal 3 ml) in de Plat-E-cellen. Schud de plaat heen en weer om de transfectie mengsel gelijkmatig te verdelen.
- Incubeer cellen bij 37 ° C / 5% CO 2 in een cel incubator.
- Na 6-8 uur, te vervangen medium met 10 ml vers DMEM medium (met Pen / Strep) voor virale productie.
Coat plaat met antilichamen
- Muis T-cellen moeten worden geactiveerd voordat virale transductie. Er zijn verschillende manieren om de T-cellen te activeren. Hier gebruiken we plaat gebonden anti-CD3e en anti-CD28 antilichamen. Bereid een antilichaam mengsel van 1 ug / ml anti-CD3e en 2 ug / ml van anti-CD28 in steriele PBS.
- Doseer 250 pi van het antilichaam mengsel aan elke well van een 24-well weefselkweek plaat. De plaat kan 's nachts worden gecoat bij 4 ° C of 2 uur bij 37 ° C.
Voorbereiding van de single-cell schorsing van muis milt
- Oogst muis-milt-en transfer naar RPMI medium.
- Plaats de milt in een cel zeef. Pureer de milt met een zuiger in een 5 cm weefselkweek plaat. Spoel cellen uit de cel zeef met steriele PBS.
- Centrifuge 1000 xg, 5 minuten.
- Gooi supernatant. Resuspendeer celpellet in ACK lyseren buffer (2 ml per milt). Incubeer 2 tot 3 minuten bij kamertemperatuur. Voeg RPMI medium tot 20 ml en centrifugeer 1000 xg gedurende 5 minuten.
- Gooi supernatant. Resuspendeer cel pellet in steriele PBS. Bepaal het aantal cellen en centrifugeer 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Ga verder naar de isolatie van T-cel.
Isolatie en activering van muis T-cellen
- Magnetisch label van de cellen volgens de handleiding van het product (CD8 + T-cel isolatie kit van Miltenyi Biotec).
- Plaats een LS kolom (Miltenyi Biotec) in de magnetic veld. Van toepassing zijn gelabeld celsuspensie op de kolom. Verzamel doorstroom (verrijkt muis CD8 + T-cellen). Was de kolom drie keer met 3 ml buffer op basis van de product handleiding en te combineren met de vorige flow-through.
- Vlekken op de cellen met anti-CD3e en anti-CD8a antilichamen en analyseren door flowcytometrie (Figuur 2a). Voor een typische scheiding, kan ~ 8-10% van het totaal cellen worden geïsoleerd. ~ 90% van de geïsoleerde cellen CD8 + T-cellen.
- Centrifugeer de cellen bij 1000 xg, 5 minuten. Giet het supernatans af. Resuspendeer de cel pellet in RPMI-medium met recombinant humaan IL-2 (rhIL2, 20 ng / mL) bij 1x10 6 / ml.
- Net voor het toevoegen van de cellen, te verwijderen antilichaam-oplossing uit de plaat (voorheen opgesteld in 2.11). Spoel elk putje met steriele PBS en verwijder PBS.
- Voeg 1 mL van de celsuspensie in elk putje. Zet de plaat bij 37 ° C / 5% CO 2 in een cel incubator.
3. (Dag 2 en dag 3) Infectie van geactiveerde T-cellen
- Na 2 dagen van het virus productie, moet het medium in de Plat-E celplaat worden geel. Overdracht virale supernatant om een 15 ml conische buis. Voeg 10 ml vers DMEM medium om de plaat voor de verdere virale productie (optioneel).
- Centrifugeer virus supernatant bij 1000 xg gedurende 5 minuten om cellen vuil te verwijderen. Zorgvuldig overdracht virus supernatant naar een nieuwe buis. Laat wat vloeistof op de bodem van de buis en niet verstoren de cellen puin.
- Verzamel geactiveerde T-cellen van de plaat in een 50 ml conische buis. Bepaal het aantal cellen. Bewaar enkele cellen in een aparte buis om te worden gebruikt als negatieve (niet-getransduceerde) controle. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten en gooi supernatant.
- Resuspendeer de cel pellet in virus supernatant bij 10 6 cellen per 1 ml met 20 ng / mL rhIL2 en 10 ug / ml van protamine sulfaat. Voeg 1 ml celsuspensie aan elke well van een 24 wells plaat. Resuspendeer de cellen in de controle-buis in RPMI medium bij dezelfde cel dichtheid met dezelfde hoeveelheid rhIL2 en protamine sulfaat. Voeg de cellen om dezelfde plaat.
- Wikkel de plaat met plastic folie. Centrifugeer 90 minuten bij 2000 xg, bij 32 ° C zonder rem.
- Na het centrifugeren, verwijder de plastic folie. Voeg 1 ml vers RPMI-medium met 20 ng / mL rhIL2 aan elk putje. Leg de plaat naar de incubator.
- (Optioneel) Hoger expressie van TCR kan worden bereikt door het verzamelen van het virus supernatant en het herhalen van de infectie procedure op dag 3.
4. Uitbreiding van de cellen en evaluatie van transductie-efficiëntie
- Onderzoek de getransduceerde T-cellen per dag. Splits de cellen op 01:03 ratio's wanneer dat nodig is in RPMI medium rhIL2. Laat niet de cellen overwoekeren (medium wordt geel).
- Op dag 6 of 7 dagen, vlekken op de cellen met antilichaam en MHC tetrameer specifiek voor de TCR om de expressie van de TCR evalueren op T-cel-oppervlak. Gebruik de niet-getransduceerde T-cellen als controle (figuur 2c).
- De getransduceerde T-cellen zijn klaar voor verdere afgeleide toepassingen.
5. Representatieve resultaten
Het is vaak voordelig om T-cel subsets zuiveren voordat transductie, hoewel splenocyten kan worden getransduceerd zonder zuivering. Hoge zuiverheid T-cel subsets kan worden verkregen met behulp van commerciële magnetische korrels (Figuur 2a).
Het evalueren van de expressie van TCRs op T-cellen, kunnen antilichamen die specifiek zijn voor TCR alfa of bèta-ketens worden gebruikt. Meestal 30% tot 80% van de cellen kan uitdrukken getransduceerde TCR (Figuur 2b) afhankelijk van de TCR genen en virus titers. MHC tetrameer specifiek voor de TCR kan ook worden gebruikt om verder te verifiëren functionele expressie van TCRs (figuur 2c).
Figuur 1. Voorbeeld van een T-cel-receptor genconstruct sub-gekloneerd in een retrovirale vector. Volle lengte alfa-en beta-keten genen zijn verbonden door een self-splitsbare 2A peptidelinker 8.
Figuur 2. Voorbeeld van geslaagde isolatie en transductie van muis T-cellen. (A) CD8 T-cellen werden geïsoleerd uit splenocyten gebruik CD8a + T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) en gekleurd met anti-CD3e en anti-CD8a antilichamen. Geïsoleerde CD8 T-cellen werden getransduceerd met R6C12 TCR specifiek voor de mens GP100: 209 -217 4 peptide en gekleurd met anti-humaan antilichaam vbeta 8 (b) en HLA-A2kb GP100 tetrameer (c).
Discussion
Verschillende stappen zijn cruciaal voor een optimaal resultaat te bereiken. Plat-E verpakking cellijn moet worden bewaard in een gezonde conditie. Indien nodig, kunnen de cellen worden gepasseerd een paar keer in DMEM medium met 1 ug / ml puromycine, 10 ug / ml blasticidine om het verlies van retrovirale structuur eiwitexpressie te voorkomen. Op de dag van de transfectie, moeten de cellen worden ~ 80% confluent. Te weinig of te veel cellen kan het virus titer. Het virus kwaliteit kan worden gecontroleerd door het testen op cellijnen die gemakkelijk kunnen worden getransduceerd. Sinds TCRs nodig CD3 complexen worden uitgedrukt op het celoppervlak, we routinematig gebruik van 58α-/β- hybridoomcellen 10 (een cellijn die niet uitdrukken endogene TCR α of β-keten, maar wel express CD3 complex). We krijgen bijna 100% transductie-efficiëntie van de hybridoma-cellen bij de transducing cellen met 1 ml van het virus supernatant. Ten slotte is de T-cellen moeten worden geactiveerd en prolifererende omdat retrovirus kan alleen infecteren actief delende cellen.
De hier gepresenteerde methode voor de productie van antigeen-specifieke T-cellen heeft verschillende beperkingen. Ten eerste is het moeilijk om 100% transductie-efficiëntie te bereiken voor de primaire muis T-cellen. Een deel van de cellen niet tot expressie van de TCR van belang. Ten tweede, de getransduceerde TCR α-en β-ketens kunnen mispair met endogene TCRs 9, die expressie van de TCR van de rente. Daarnaast kan de mispaired TCRs veroorzaken auto-immuniteit in vivo 11. Tot slot is er slechts een beperkt tijdsbestek de getransduceerde T-cellen kunnen worden gebruikt. Na ongeveer een week, de cellen ondergaan apoptose, tenzij opnieuw worden gestimuleerd. Echter, kunnen cellen uitgeput raken en verliezen functies met repetitieve re-stimulatie.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (5U01CA137070) en de American Cancer Society (RSG-09-070-01-LIB), een Cancer Research Institute Investigator Award (MK), een American Heart Association pre-doctorale beurs (KM) en een Spaanse ministerie van Onderwijs en Wetenschappen Fellowship (APG).
We willen graag het bedanken Dr Nicholas Restifo en Dr Zhiya Yu (NIH / NCI) voor de nuttige suggesties aan het protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
