Summary
Nous présentons un protocole pour produire l'antigène spécifique de la souris de cellules T à l'aide transduction rétrovirale
Abstract
Récepteurs des cellules T (TCR) jouent un rôle central dans le système immunitaire. TCR sur les cellules T surfaces peuvent reconnaître spécifiquement des antigènes peptidiques présentés par les cellules présentatrices d'antigène (CPA) 1. Cette reconnaissance conduit à l'activation des cellules T et une série de résultats fonctionnels (production de cytokines, par exemple, tuer des cellules cibles). Comprendre le rôle fonctionnel des TCR est essentielle pour exploiter la puissance du système immunitaire pour traiter une variété de maladies liées immunologie (par exemple le cancer ou d'auto-immunité).
Il est commode d'étudier TCR dans des modèles murins, ce qui peut être accompli de plusieurs façons. Faire TCR transgénique modèles de souris est coûteux et prend du temps et actuellement il ya seulement un nombre limité d'entre eux disponibles 2-4. Alternativement, des souris avec des antigènes spécifiques des cellules T peuvent être générés par la moelle osseuse chimère. Cette méthode prend également plusieurs semaines et nécessite une expertise 5. Transduction rétrovirale des TCR en activées in vitro de lymphocytes T de souris est une méthode rapide et relativement facile d'obtenir des cellules T peptide-CMH désirée spécificité. Antigène spécifique de cellules T peuvent être générés en une semaine et utilisé dans toutes les applications en aval. Etudier transduites cellules T a aussi une application directe à l'immunothérapie humaine, comme un transfert adoptif de lymphocytes T humains transduites avec l'antigène spécifique TCR est une stratégie émergente pour le traitement du cancer 6.
Nous présentons ici un protocole à un retrovirus transduire TCR en activées in vitro de lymphocytes T de souris. Les deux gènes humains et de souris TCR peuvent être utilisés. Les rétrovirus transportant des gènes spécifiques du TCR sont générés et utilisés pour infecter la souris de cellules T activées par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28. Après l'expansion in vitro, les lymphocytes T transduits sont analysés par cytométrie en flux.
Protocol
1. Préparer Construire rétroviraux
- Sous-clonage du récepteur des cellules T (TCR) du gène d'intérêt dans un vecteur rétroviral (figure 1, par exemple des vecteurs pMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs partir Cellbiolabs). L'α TCR et gène de la chaîne β devrait être sur le même vecteur, sous le contrôle du même promoteur pour garantir l'expression égale. Si le TCR d'intérêt est humain, les domaines constante humaine doivent être remplacés par des domaines de souris constant 9. Notre observation est que TCR pleine longueur humains ne expriment de façon stable sur les lymphocytes T de souris.
- Préparer l'ADN plasmidique de haute qualité en utilisant Qiagen Maxi Prep Kit ou un produit similaire. La concentration du plasmide devrait être d'environ 1 ug / uL.
2. La transfection et la T-cellule d'isolement
Jour -1 (cellules emballage Plate)
- Déloger Platinum-E (Plat-E, Cellbiolabs) les cellules d'encapsidation rétrovirale à la trypsine-EDTA et neutraliser avec du DMEM médias.
- Centrifuger les cellules à 1000 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du milieu DMEM à granulés.
- Déterminer le nombre de cellules et de diluer les cellules à 0.6x10 6 / mL. Planche 10 ml de suspension cellulaire dans un 10mm poly-lysine plaque de culture de tissus enduits et pousser la nuit dans un incubateur de cellules à 37 ° C, 5% de CO 2.
Jour 0 (transfection)
- Le lendemain matin, examiner les cellules sous un microscope optique. Les cellules doivent être d'environ 80% de confluence.
- Retirer délicatement le support de la plaque. Laver les cellules une fois avec du PBS 1x et ajouter 10 ml pré-chauffé, frais DMEM médias sans pénicilline-streptomycine (Pen / Strep).
(Remarque: Pen / Strep peut interférer avec la transfection) - Préparer complexes de transfection.
Préparer le mélange A et B comme suit:Mix A: L'ADN plasmidique 9 pg PCL-Eco plasmide helper 6,3 mg OptiMEM 1,5 ml Mix B: Lipopfectime 2000 60 uL OptiMEM 1,5 ml
Incuber A et B séparément pendant 5 minutes à température ambiante
Mix A et B ensemble doucement et incuber pendant 20 minutes à température ambiante pour former un complexe de transfection. - Lentement goutte à goutte le mélange (total 3 ml) dans les cellules Plat-E. Secouez doucement la plaque avant en arrière pour répartir le mélange de transfection uniformément.
- Incuber les cellules à 37 ° C CO / 5% 2 dans un incubateur à cellules.
- Après 6-8 heures, remplacez moyenne avec 10 ml de milieu DMEM frais (avec Pen / Strep) pour la production virale.
Plaque Manteau avec des anticorps
- Souris T-cellules ont besoin d'être activé avant de transduction virale. Il ya plusieurs façons différentes pour activer les lymphocytes T. Ici, nous utilisons la plaque liée anticorps anti-CD3e et anti-CD28. Préparer un mélange d'anticorps de 1 pg / mL d'anti-CD3e et 2 pg / ml d'anti-CD28 dans du PBS stérile.
- Distribuer 250 uL du mélange d'anticorps à chaque puits d'une plaque de 24 puits de culture de tissu. La plaque peut être enduit nuit à 4 heures C ou 2 ° à 37 ° C.
Préparation de unicellulaire suspension de rate de souris
- Récolte de rate de souris et de transfert en milieu RPMI.
- Placez la rate dans une passoire cellule. Mash la rate avec un piston de la seringue dans une plaque de 5 cm de culture de tissu. Rincer la crépine cellules hors des cellules avec du PBS stérile.
- Centrifugeuse 1000 xg, 5 min.
- Rejeter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire dans un tampon de lyse ACK (2 ml par rate). Incuber 2 à 3 min à température ambiante. Ajouter milieu RPMI jusqu'à 20 ml et centrifuger 1000 xg pendant 5 min.
- Rejeter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire dans du PBS stérile. Déterminer le nombre de cellules et centrifugation 1000 g pendant 5 min à 4 ° C. Procéder à l'isolement de cellules T.
Isolement et activation des lymphocytes T de souris
- Magnétiquement marquer les cellules selon le manuel du produit (CD8 + kit d'isolation à cellules T de Miltenyi Biotec).
- Placer une colonne LS (Miltenyi Biotec) dans la mchamp agnetic. Appliquer suspension cellulaire étiquetés sur la colonne. Recueillir accréditives (enrichie de souris T CD8 + cellules). Laver la colonne trois fois avec 3 ml de tampon selon le manuel du produit et de combiner avec les précédents accréditives.
- Colorer les cellules avec des anticorps anti-CD3e et anti-CD8a et analyser par cytométrie en flux (Figure 2a). Pour une séparation typique, ~ 8-10% des cellules totales peuvent être isolés. ~ 90% des cellules isolées sont CD8 + T-cellules.
- Centrifuger les cellules à 1000 xg, 5 min. Jeter le surnageant. Resuspendre la cellule dans le milieu RPMI culot avec recombinante humaine IL-2 (rhIL2, 20 ng / ml) à 1x10 6 / ml.
- Juste avant d'ajouter les cellules, enlever la solution d'anticorps à partir de la plaque (préalablement préparé en 2.11). Rincez chaque puits avec du PBS stérile et retirer du PBS.
- Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits. Mettez la plaque à 37 ° C / 5% de CO 2 dans un incubateur à cellules.
3. (Jour 2 et Jour 3) L'infection de cellules T activées
- Après 2 jours de production de virus, le milieu de la plaque de cellules Plat-E devrait devenir jaune. Transférer le surnageant viral pour un tube de 15 ml conique. Ajouter 10 ml de milieu DMEM frais à la plaque pour la production virale supplémentaire (en option).
- Centrifuger le surnageant de virus à 1000 xg pendant 5 min pour enlever les débris des cellules. Soigneusement surnageant transfert de virus à un nouveau tube. Laissez un peu de liquide au fond du tube et ne pas déranger les débris des cellules.
- Recueillir des cellules T activées de la plaque dans un tube conique de 50 ml. Déterminer le nombre de cellules. Enregistrer certaines cellules dans un tube séparé pour être utilisé comme négatif (non transduites) de contrôle. Centrifuger à 1000 xg pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Reprendre le surnageant cellulaire par le virus de bouletage à 10 6 cellules par mL avec 1 à 20 ng / ml rhIL2 et 10 pg / ml de sulfate de protamine. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Resuspendre les cellules dans le tube de contrôle en milieu RPMI à la même densité cellulaire avec la même quantité de sulfate de protamine et rhIL2. Ajouter aux cellules de la même plaque.
- Enveloppez la plaque avec du film plastique. Centrifuger 90 minutes à 2000 xg, à 32 ° C sans frein.
- Après la centrifugation, retirer le film plastique. Ajouter 1 mL de milieu RPMI frais avec 20 ng / mL rhIL2 à chaque puits. Mettez la plaque arrière à l'incubateur.
- (Facultatif) niveau supérieur d'expression du TCR peut être atteint par la collecte du surnageant de virus et répéter la procédure d'infection au jour 3.
4. L'expansion des cellules et l'évaluation de l'efficacité Transduction
- Examinez la transduction des lymphocytes T quotidienne. Fractionner les cellules à des taux de 01h03 lorsque cela est nécessaire dans un milieu RPMI rhIL2. Ne laissez pas l'envahir les cellules (milieu devient jaune).
- Au jour 6 ou 7 jours, les taches les cellules avec des anticorps et tétramère CMH spécifiques pour le TCR pour évaluer l'expression du TCR sur les cellules T de surface. Utilisez le non transduites cellules T comme témoin (figure 2c).
- La transduction des lymphocytes T sont prêts pour d'autres applications en aval.
5. Les résultats représentatifs
Il est souvent avantageux de purifier les cellules T des sous-ensembles, avant de transduction bien splénocytes peuvent être transduites sans purification. Haute pureté des lymphocytes T des sous-ensembles peuvent être obtenus en utilisant des billes magnétiques commerciales (figure 2a).
Pour évaluer le niveau d'expression de TCR sur les cellules T, des anticorps spécifiques pour TCR alpha ou beta des chaînes peuvent être utilisés. Typiquement 30% à 80% des cellules transduites peuvent exprimer TCR (figure 2b) selon les gènes TCR et les titres de virus. CMH tétramère spécifiques pour le TCR peuvent aussi être utilisés pour vérifier davantage l'expression fonctionnelle du TCR (figure 2c).
Figure 1. Exemple de gène du récepteur des cellules T de construire des sous-cloné dans un vecteur rétroviral. Alpha pleine longueur et les gènes de la chaîne bêta sont reliés par un linker auto-clivable 2A peptide 8.
Figure 2. Exemple d'isolation réussie et la transduction des lymphocytes T de souris. (A) cellules T CD8 ont été isolés à partir de splénocytes utilisant CD8a + T isolement des cellules Kit (Miltenyi Biotec) et colorées avec des anticorps anti-CD3e et anti-CD8a. Isolée cellules T CD8 ont été transduites avec R6C12 TCR spécifiques pour l'homme gp100: 209 -217 4 peptide et colorées avec anti-humain Vbeta 8 anticorps (b) et HLA-A2kb gp100 tétramère (c).
Discussion
Plusieurs étapes sont essentielles pour obtenir des résultats optimaux. Plat-E lignée cellulaire d'emballage doivent être maintenus en bon état sain. Si nécessaire, les cellules peuvent être passées à quelques reprises dans du milieu DMEM avec 1 ug / ml de puromycine, 10 pg / ml blasticidine pour prévenir la perte d'expression structure d'une protéine rétrovirale. Le jour de la transfection, les cellules doivent être confluentes ~ 80%. Trop peu de cellules ou d'un trop grand nombre peut diminuer le titre viral. La qualité du virus peut être vérifiée par des essais sur les lignées cellulaires qui peuvent être facilement transduites. Depuis TCR nécessitent CD3 complexes pour être exprimée à la surface cellulaire, nous avons régulièrement recours 58α-/β- hybridomes 10 (une lignée cellulaire qui n'exprime pas endogènes du TCR α ou de la chaîne β, mais exprime CD3 complexe). Nous obtenons près de 100% d'efficacité de transduction des cellules d'hybridomes lors de transduction des cellules avec 1 ml de surnageant de virus. Enfin, les cellules T doivent être activés et prolifèrent en raison des rétrovirus ne peut infecter que les cellules en division active.
La méthode présentée ici pour la production spécifique de l'antigène des cellules T a plusieurs limites. Premièrement, il est difficile d'atteindre une efficacité de transduction de 100% pour principal de la souris T-cellules. Une partie des cellules n'expriment pas le TCR d'intérêt. Deuxièmement, le TCR α transduites et des chaînes β peut mispair avec TCR endogènes 9, ce qui peut réduire le niveau d'expression du TCR d'intérêt. En outre, le TCR mispaired peut causer l'auto-immunité in vivo 11. Enfin, il ya seulement un laps de temps limité de la transduction des lymphocytes T peuvent être utilisés. Après environ une semaine, les cellules en apoptose à moins d'être re-stimulé. Cependant, les cellules peuvent s'épuiser et perdre avec les fonctions répétitives re-stimulations.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (5U01CA137070) et l'American Cancer Society (RSG-09-070-01-LIB), un prix Cancer Research Institute chercheur (MK), une association américaine de coeur de pré-doctorat (KM) et un ministère espagnol de l'Education et des Sciences Fellowship (APG).
Nous aimerions remercier le Dr Nicholas Restifo et le Dr Yu Zhiya (NIH / NCI) pour des suggestions utiles pour le protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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References
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- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
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- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
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