Summary
Vi presentiamo un protocollo per la produzione antigene-specifica topo le cellule T mediante trasduzione retrovirale
Abstract
Recettori delle cellule T (TCR) svolgono un ruolo centrale nel sistema immunitario. TCR sulle cellule T superfici possono riconoscere specificamente antigeni peptidici presentati da cellule presentanti l'antigene (APC) 1. Questo riconoscimento comporta l'attivazione delle cellule T e una serie di risultati funzionali (ad esempio la produzione di citochine, l'uccisione delle cellule bersaglio). Comprendere il ruolo funzionale di TCR è fondamentale per sfruttare la potenza del sistema immunitario per trattare una varietà di malattie immunologia correlate (ad esempio il cancro o autoimmunità).
E 'conveniente per studiare TCR in modelli murini, che può essere realizzato in diversi modi. Fare TCR transgenico modelli murini è costoso e richiede molto tempo e attualmente ci sono solo un numero limitato di metterli a disposizione 2-4. In alternativa, i topi con l'antigene-specifiche cellule T possono essere generati dal midollo osseo chimera. Questo metodo richiede anche diverse settimane e richiede competenze 5. Trasduzione retrovirale di TCR in in vitro attivato topo le cellule T è un metodo rapido e relativamente facile da ottenere cellule T del desiderato peptide-MHC specificità. Antigene-specifiche cellule T possono essere generati in una settimana e utilizzato in tutte le applicazioni a valle. Studiare trasdotte cellule T ha anche applicazione diretta di immunoterapia umano, come il trasferimento adottivo di cellule T umane trasdotte con antigene-specifica TCR è una strategia emergente per il trattamento del cancro 6.
Qui vi presentiamo un protocollo per trasdurre retrovirally TCR in in vitro attivato topo le cellule T. Sia umane che il mouse geni TCR può essere utilizzato. Retrovirus trasporto specifici geni TCR sono formati ed utilizzati per infettare topo le cellule T attivate con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28. Dopo l'espansione in vitro, le cellule T trasdotte vengono analizzati mediante citometria di flusso.
Protocol
1. Preparare Costruire retrovirali
- Sub-clone del recettore delle cellule T (TCR) gene di interesse in un vettore retrovirale (Figura 1, vettori esempio PMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs da Cellbiolabs). Il TCR α e β gene della catena dovrebbe essere lo stesso vettore sotto il controllo del promotore stesso per garantire la parità di espressione. Se il TCR di interesse è umano, i domini umano costante bisogno di essere sostituito da domini del mouse costante 9. La nostra osservazione è che TCR lunghezza umani non esprimono stabilmente il topo le cellule T.
- Preparare il DNA plasmidico di alta qualità utilizzando Qiagen Maxi Prep Kit o prodotto analogo. La concentrazione del plasmide deve essere di circa 1 mg / mL.
2. Trasfezione e T-cella di isolamento
Day -1 (cellule imballaggio Plate)
- Sloggiare Platinum-E (Plat-E, Cellbiolabs) cellule imballaggio retrovirale con tripsina-EDTA e neutralizzare con DMEM media.
- Centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in DMEM media.
- Determinare il numero delle cellule e diluire le cellule a 0.6x10 6 / mL. Tavola 10 ml di sospensione cellulare in un 10mm poli-lisina piatto rivestito coltura tissutale e crescere durante la notte in una cella incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2.
Giorno 0 (Transfection)
- La mattina dopo, esaminare le cellule al microscopio ottico. Le cellule dovrebbero essere circa l'80% confluenti.
- Rimuovere delicatamente il supporto dal piatto. Lavare le cellule una volta con PBS 1x e aggiungere 10 ml di pre-riscaldato, fresco DMEM media senza penicillina-streptomicina (Pen / Strep).
(Nota: Pen / Strep possono interferire con la trasfezione) - Preparare complesso trasfezione.
Preparare mix A e B come segue:Mix A: DNA plasmidi 9 mcg PCL-Eco plasmide helper 6,3 mcg OptiMEM 1,5 ml Mix B: Lipopfectime 2000 60 microlitri OptiMEM 1,5 ml
Incubare A e B separatamente per 5 minuti a temperatura ambiente
Mix A e B insieme delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per formare complessi trasfezione. - Lentamente gocciolare la miscela (totale 3 ml) in Plat-E cellule. Agitare delicatamente la piastra avanti e indietro per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione.
- Incubare le cellule a 37 ° C / 5% di CO 2 in un incubatore cellulare.
- Dopo 6-8 ore, sostituire media con 10 ml di DMEM medio fresco (con il Pen / Strep) per la produzione virale.
Piastra cappotto con anticorpi
- Topo le cellule T devono essere attivati prima di trasduzione virale. Ci sono diversi modi per attivare le cellule T. Qui usiamo piatto anticorpi legati anti-CD3e e anti-CD28. Preparare una miscela di anticorpi di 1 mg / mL di anti-CD3e e 2 mg / mL di anti-CD28 in PBS sterile.
- Dispensare 250 microlitri della miscela di anticorpi a ciascun pozzetto di una 24-pozzetti di coltura tissutale. La piastra può essere coperti per una notte a 4 ° C o 2 ore a 37 ° C.
Preparazione di singole cellule sospensione dalla milza del mouse
- Vendemmia milza del mouse e trasferimento in media RPMI.
- Posizionare la milza in un colino cellula. Schiacciate la milza con un stantuffo della siringa in una piastra di coltura tissutale 5 cm. Lavare le cellule fuori dal filtro cella con PBS sterile.
- Centrifuga 1000 xg, 5 min.
- Gettare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in tampone di lisi ACK (2 mL per milza). Incubare 2 a 3 min a temperatura ambiente. Aggiungere mezzo RPMI fino a 20 ml e centrifugare 1000 xg per 5 minuti.
- Gettare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in PBS sterile. Determinare numero di cellulare e centrifugare 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Procedere all'isolamento delle cellule T.
L'isolamento e l'attivazione di topo le cellule T
- Magneticamente etichetta le cellule in base al manuale del prodotto (CD8 + T-cellule kit di isolamento dal Miltenyi Biotec).
- Inserire una colonna LS (Miltenyi Biotec) nel magnetic campo. Applicare sospensione cellulare etichettati sulla colonna. Raccogliere flow-through (arricchito topo CD8 + T-cellule). Lavare la colonna tre volte con 3 mL di tampone in base al manuale del prodotto e si combinano con precedenti flow-through.
- Macchia le cellule con anticorpi anti-CD3e e anti-CD8a e analizzare in citometria a flusso (Figura 2a). Per una separazione tipica ~ 8-10% di cellule totali può essere isolato. ~ 90% delle cellule isolate sono CD8 + T-cellule.
- Centrifugare le cellule a 1000 xg, 5 min. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in medium RPMI con umana ricombinante IL-2 (rhIL2, 20 ng / mL) a 1x10 6 / ml.
- Poco prima di aggiungere le cellule, rimuovere soluzione di anticorpi dalla piastra (preparato precedentemente in 2.11). Lavare ogni pozzetto con PBS sterile e rimuovere PBS.
- Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Mettere il piatto a 37 ° C / 5% di CO 2 in una cella incubatrice.
3. (Day 2 e Day 3) L'infezione di cellule T attivate
- Dopo 2 giorni di produzione del virus, il mezzo in Plat-E piastra cellulare dovrebbe diventare gialla. Trasferire il supernatante virale ad un tubo da 15 ml. Aggiungere 10 ml di DMEM medio fresco alla piastra per l'ulteriore produzione virale (opzionale).
- Centrifugare surnatante virus a 1000 xg per 5 minuti per rimuovere i detriti delle cellule. Con attenzione trasferimento sopranatante virus in una nuova provetta. Lasciare un po 'di liquido sul fondo del tubo e non disturbare i detriti cellule.
- Raccogliere cellule T attivate dalla piastra in un tubo da 50 ml. Determinare il numero delle cellule. Risparmiare un po 'le cellule in una provetta a parte per essere usato come negativo (un-trasdotte) di controllo. Centrifugare a 1000 xg per 5 minuti e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in virus supernatante a 10 6 cellule per 1 ml a 20 ng / mL rhIL2 e 10 mg / mL di solfato di protamina. Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra ben 24. Risospendere le cellule in provetta di controllo nel medio RPMI alla densità stessa cella con la stessa quantità di solfato di rhIL2 e protamina. Aggiungi le cellule alla piastra stessa.
- Avvolgere il piatto con film plastico. Centrifugare 90 minuti a 2000 xg, a 32 ° C senza freno.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere la pellicola di plastica. Aggiungere 1 ml di fresca media RPMI con 20 ng / mL rhIL2 a ciascun pozzetto. Mettere la piastra posteriore per l'incubatrice.
- (Opzionale) livello di espressione Superiore di TCR può essere raggiunto attraverso la raccolta del surnatante virus e ripetendo la procedura di infezione al giorno 3.
4. Espansione di cellule e di valutazione del rendimento di trasduzione
- Esaminare il trasdotte cellule T quotidiano. Dividere le celle con un rapporto 01:03, quando necessario, in RPMI medio rhIL2. Non lasciate che il proliferare delle cellule (medium diventa giallo).
- Al giorno 6 o 7 ° giorno, macchia le cellule con l'anticorpo e tetramero MHC specifici per il TCR per valutare l'espressione del TCR sulle cellule T di superficie. Utilizzare il non-trasdotte cellule T come controllo (Figura 2c).
- Il trasdotte cellule T sono pronti per ulteriori applicazioni a valle.
5. Rappresentante Risultati
Spesso è vantaggioso per purificare cellule T sottoinsiemi prima di trasduzione splenociti anche se possono essere trasdotte senza purificazione. Elevata purezza delle cellule T sottoinsiemi può essere ottenuto utilizzando commerciale sfere magnetiche (Figura 2a).
Per valutare il livello di espressione del TCR sulle cellule T, anticorpi specifici per le catene di TCR alfa o beta può essere utilizzato. Tipicamente 30% al 80% delle cellule può esprimere trasdotte TCR (Figura 2b), a seconda dei geni TCR e titoli virus. MHC tetramero specifici per il TCR può essere utilizzato anche per verificare ulteriormente espressione funzionale di TCR (Figura 2c).
Figura 1. Esempio di cellule T del gene del recettore costruire sub-clonato in un vettore retrovirale. Alfa a tutta lunghezza e geni catena beta sono collegati da un auto-cleavable linker peptide 2A 8.
Figura 2. Esempio di isolamento di successo e di trasduzione del mouse cellule-T. (A) CD8 T-cellule sono state isolate da splenociti utilizzando CD8a + T cella di isolamento Kit (Miltenyi Biotec) e colorati con gli anticorpi anti-CD3e e anti-CD8a. Isolato CD8 T-cellule sono state trasdotte con R6C12 TCR specifico per l'uomo gp100: 209 -217 quattro peptidi e colorati con anti-umano Vbeta 8 anticorpi (b) e HLA-A2kb gp100 tetramero (c).
Discussion
Diversi passaggi sono fondamentali per ottenere risultati ottimali. Plat-E linea cellulare di packaging deve essere conservato in condizioni di buona salute. Se necessario, le cellule possono essere diversi passaggi un paio di volte in medium DMEM con 1 mg / ml puromicina, 10 mg / ml blasticidin per prevenire la perdita di espressione delle proteine retrovirali struttura. Il giorno della transfezione, le cellule dovrebbero essere confluenti ~ 80%. Celle troppo pochi o troppi possono ridurre il titolo virus. La qualità virus può essere controllata mediante la prova su linee cellulari che possono essere facilmente trasdotte. Dal TCR richiedono CD3 complessi per essere espressi sulla superficie cellulare, si usano abitualmente 58α-/β- ibridomi 10 (una linea cellulare che non esprime endogeno TCR α o β catena, ma non esprime complesso CD3). Si ottiene quasi il 100% di efficienza di trasduzione ibridomi quando trasduzione cellule con 1 ml di sopranatante virus. Infine, le cellule T devono essere attivati e proliferano perché retrovirus possono infettare solo attivamente divisione delle cellule.
Il metodo presentato qui per la produzione di antigene-specifiche cellule T ha diversi limiti. In primo luogo, è difficile raggiungere l'efficienza di trasduzione del 100% per le primarie del mouse T-cellule. Una parte delle cellule non esprimono il TCR di interesse. In secondo luogo, il trasdotte TCR α e β catene possono mispair con TCR endogena 9, che possono ridurre il livello di espressione del TCR di interesse. Inoltre, il TCR mispaired può causare l'autoimmunità in vivo 11. Infine, vi è solo un periodo di tempo limitato la trasdotte cellule T possono essere utilizzati. Dopo circa una settimana, le cellule subiscono apoptosi salvo per essere nuovamente stimolata. Tuttavia, le cellule si esaurisca e perdere con funzioni ripetitive ri-stimolazioni.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH (5U01CA137070) e l'American Cancer Society (RSG-09-070-01-LIB), una ricerca sul cancro Investigator Award Institute (MK), un American Heart Association pre-dottorato (KM) e un Ministero spagnolo dell'Educazione e della Scienza Fellowship (APG).
Vorremmo ringraziare il Dr. Nicholas Restifo e il Dr. Zhiya Yu (NIH / NCI) per suggerimenti utili al protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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References
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- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
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