Summary
我们提出了一个协议，以产生抗原特异性的小鼠的T细胞，用逆转录病毒转导
Abstract
在免疫系统的T细胞受体（电阻温度系数）发挥核心作用。在T细胞表面的电阻温度系数，可以特异性识别肽抗原，抗原提呈细胞（APCs）1提出。这种认识导致激活T细胞和一系列功能的结果（如细胞因子的产生，靶细胞的杀伤）。了解电阻温度系数的职能作用是至关重要的，利用免疫系统的力量来治疗各种免疫相关疾病（如癌症或自体免疫）。
研究在小鼠模型的电阻温度系数，它可以通过多种方式完成，这是方便。制作TCR转基因小鼠模型是昂贵和费时，目前还只是一个数量有限的可用 2-4 。另外，与小鼠的抗原特异性T细胞可产生骨髓嵌合体。此方法还需要几个星期，和需要的专业知识 5 。逆转录病毒转导电阻温度系数为T细胞在体外激活鼠标是一个快速和相对容易的方法来获取所需的肽- MHC的特异性T细胞。抗原特异性T细胞可在一周内产生任何下游应用中使用。学习导的T细胞也有直接应用到人类免疫，人类T细胞过继转移与特定抗原的电阻温度系数转导是一个新兴的癌症治疗6战略。
在这里，我们提出了一个协议retrovirally在体外激活的小鼠T细胞转导电阻温度系数到的。可用于人类和小鼠的TCR基因。携带特定的T细胞受体基因的逆转录病毒感染小鼠抗CD3和抗CD28抗体激活T细胞的生成和使用。 在体外扩增后，转导的T细胞流式细胞仪分析。
Protocol
1。准备逆转录病毒载体构建
- 小组克隆利益的T细胞受体（TCR）基因逆转录病毒载体（图1，例如向量，PMSG 7，pMIGII 5,8，从Cellbiolabs pMXs） 。的TCRα和β链基因应该是相同的启动子控制下的同一载体上，以确保平等的表达。如果感兴趣的TCR是人类，人类不断域需要将鼠标不断域9更换。我们的观察是，全长人类电阻温度系数并不稳定表达对小鼠T细胞。
- 准备高质量的质粒DNA用Qiagen公司马克西准备试剂盒或类似的产品。质粒的浓度应在约1微克/μL。
2。转染和T细胞隔离
日-1（板包装细胞）
- 打跑铂- E（PLAT - E Cellbiolabs）用胰蛋白酶- EDTA的逆转录病毒包装细胞，用DMEM媒体和压制。
- 离心5分钟在1000 XG的细胞。吸上清，悬浮细胞沉淀的DMEM媒体。
- 确定细胞数量和0.6x10 6 /毫升稀释的细胞。板10毫升细胞悬浮在一个10mm的多聚赖氨酸涂层的组织培养板和一个细胞培养箱中过夜增长在37℃，5％的CO 2。
0天（转）
- 第二天早晨，检查光显微镜下的细胞。应约80％融合的细胞。
- 轻轻地从板中删除媒体。一次1X PBS清洗细胞，并没有青霉素，链霉素（PEN /链球菌）添加10毫升的预热，新鲜的DMEM媒体。
（注：笔/链球菌可以干扰与转） - 准备转染复杂。
准备组合A和B如下：混合：质粒DNA 9微克 PCL - ECO辅助质粒 6.3微克 OptiMEM 1.5毫升 混合物B：Lipopfectime 2000 60微升 OptiMEM 1.5毫升
孵育5分钟A和B分别在室温
混合A和B一起轻轻为20分钟，在室温下孵育形式转复杂。 - 慢慢地滴入开发平台- E细胞的混合物（共3毫升）。轻轻摇动板来回的转染混合物均匀地分发。
- 细胞在37 ° C / 5％的CO 2在细胞培养箱。
- 6-8小时后，取代病毒生产的新鲜DMEM培养基用10 mL（与PEN /链球菌）的媒介。
涂层板与抗体
- 小鼠T细胞病毒转导前需要激活。有各种方法来激活T细胞。在这里，我们用板的约束反CD3e和抗CD28抗体。准备1微克/毫升抗CD3e和2微克/毫升无菌PBS的抗CD28抗体的混合物。
- 分送250μL抗体的混合物，每孔24孔组织培养板。该板块可以涂在一夜之间在4 ° C或2小时37 ° C。
从小鼠脾脏单细胞悬浮液的制备
- 收获小鼠脾和转移的RPMI培养基。
- 将单元格中的过滤器的脾。捣碎成一个5厘米的组织培养板的注射器柱塞脾。用无菌PBS冲洗掉细胞过滤器的细胞。
- 离心1000 XG，5分钟。
- 弃上清。在确认裂解缓冲液悬浮细胞沉淀（2％毫升脾）。孵育2〜3分钟在室温。添加20毫升的RPMI培养基，离心5分钟XG 1000。
- 弃上清。悬浮细胞沉淀在无菌PBS。确定细胞数为5分钟，离心1000 XG在4 ° C。进入T细胞的分离。
小鼠T细胞的分离和激活
- 根据产品说明书（CD8 + T细胞分离试剂盒从美天旎生物技术），磁标签的细胞。
- 放置在米LS列（美天旎生物技术）agnetic领域。应用到的列标记的细胞悬液。收集流量通过（丰富小鼠CD8 + T细胞）。列洗净，用3 mL缓冲三次，根据产品说明书并结合与以前流过。
- 反CD3e和反CD8a抗体染色的细胞，并通过流式细胞仪分析（图2a）。对于一个典型的分离，细胞总数的8-10％可以被孤立。 〜90％，分离出的细胞CD8 + T细胞。
- 离心机在1000 XG，5分钟的细胞。上清液。重组人IL - 2（rhIL2，20毫微克/毫升）在1 × 10 6 /毫升，重悬细胞沉淀于RPMI培养基。
- 之前加入的细胞，取出板（准备在2.11以前）抗体的解决方案。每孔用无菌PBS和删除PBS冲洗。
- 加入1毫升细胞悬液，每孔。置于37 ° C / 5％CO 2细胞培养箱中板。
3。 （2和第3天天）感染T细胞激活
- 经过2天的病毒生产，在开发平台- E细胞板的介质应变成黄色。病毒上清转移到15 mL锥形管。添加10毫升的新鲜DMEM培养基为进一步的病毒生产板（可选）。
- 离心5分钟，以去除细胞碎片在1000 XG病毒上清。小心病毒上清转移到一个新的管。保留一些液体的试管底部，不打扰细胞碎片。
- 从板材到50 mL锥形管收集激活T细胞。确定细胞数量。保存到一个单独的管为阴性（未转）控制使用的一些细胞。离心机在1000 XG 5分钟，弃上清。
- 重悬在10 6细胞每1毫升20毫微克/毫升rhIL2和10微克/毫升硫酸鱼精蛋白在病毒上清的细胞沉淀。加入1 ml的细胞悬液，每孔24孔板。 rhIL2和硫酸鱼精蛋白的相同数额相同的细胞密度控制在RPMI培养基管重悬细胞。添加细胞相同的板。
- 包装用塑料薄膜板。在2000年的XG离心90分钟，在32 ° C，没有刹车。
- 离心后，取出塑料薄膜。 1毫升新鲜的RPMI培养基添加20 ng / mL的rhIL2每口井。把板的孵化器。
- （可选）的表达水平较高的TCR可以通过收集病毒上清，重复3天的感染过程。
4。扩展的细胞和转染效率的评价
- 检查每日转导的T细胞。拆分在必要时在RPMI培养基rhIL2 1:3比例的细胞。不要让细胞长满（中等变为黄色）。
- 在6或第7天天，染色与抗体和MHC四聚体，以评估对T细胞表面的TCR的表达特定的TCR细胞。使用未转导的T细胞作为对照（图2c）。
- 导的T细胞，准备进一步的下游应用。
5。代表性的成果
它往往是有利的，净化前转导的T细胞亚群，虽然脾可以不净化转。使用商业磁珠（图2a），可以得到高纯度的T细胞亚群。
要评估的T细胞上的电阻温度系数的表达水平，可用于特定抗体TCRα或β链。通常30％至80％的细胞可以表达转导TCR（图2b）根据TCR的基因和病毒滴度。 MHC四聚体为特定的TCR也可用于进一步验证功能表达的电阻温度系数（图2c）。
图1。 T细胞受体基因的例子构造子克隆到逆转录病毒载体 。全长α和β链基因的自我裂解2A肽连接器8挂钩。
图2。成功分离和小鼠T细胞的转导。范 例（一）使用CD8a + T细胞分离试剂盒（美天旎生物技术公司）和反CD3e和反CD8a抗体染色脾CD8 + T细胞隔离。隔离CD8 + T细胞的转R6C12的TCR具体为人类GP100：209 -217 4肽与抗人Vbeta 8抗体（b）和HLA - A2kb GP100四聚体（C）染色。
Discussion
几个步骤，以达到最佳效果的关键。开发平台- E包装细胞系应保持在健康状态。如果有必要，可以传代细胞与1微克/毫升嘌呤，10微克/毫升杀稻瘟逆转录病毒结构蛋白的表达，以防止损失的DMEM培养基几次。细胞在转染当天，应〜80％融合。太少或太多的细胞可能会减少病毒滴度。该病毒的质量可以检查测试可以很容易导的细胞株。由于电阻温度系数要求CD3复合物在细胞表面的表达，我们经常使用58α-/β-杂交瘤细胞10（不表达内源性的T细胞受体α或β链的，但不表达CD3复合物的细胞系）。 1毫升病毒上清转导细胞时，我们获得近100％，杂交瘤细胞的转染效率。最后，T细胞被激活和增殖，因为逆转录病毒只能感染积极分裂的细胞。
这里介绍的方法产生抗原特异性T细胞有几个限制。首先，这是很难达到100％，小学小鼠T细胞的转导效率。部分细胞不表达利益的TCR。二，转导的TCRα和β链，可以mispair与内源性电阻温度系数，这可能会减少利益的TCR的表达水平。此外，mispaired电阻温度系数可能导致在体内 11的自身免疫性疾病。最后，有只导的T细胞可用于有限的时间框架。经过一周左右，除非被重新刺激细胞凋亡的细胞进行。然而，细胞可能会耗尽而失去功能与重复重新刺激。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持由美国国立卫生研究院（5U01CA137070）的赠款和美国癌症协会（RSG - 09 - 070 - 01 - LIB），一个癌症研究所研究员奖（MK），美国心脏协会前博士后研究（KM），和的教育和科学奖学金（APG）的西班牙部。
我们想感谢博士尼古拉Restifo和指压于博士（NIH / NCI）的协议的有益的建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
