Summary
אנו מציגים פרוטוקול לייצר אנטיגן ספציפי עכבר מתאי T באמצעות התמרה retroviral
Abstract
T-cell קולטנים (TCRs) תפקיד מרכזי במערכת החיסון. TCRs על תא T משטחים ניתן לזהות באופן ספציפי אנטיגנים פפטידים שהוצגו על ידי תאים המציגים אנטיגן (נגמ"שים) 1. הכרה זו מובילה ההפעלה של T-תאים סדרה של תוצאות תפקודיות (כגון ייצור ציטוקינים, הריגת התאים היעד). הבנת תפקיד פונקציונלי של TCRs הוא קריטי כדי לרתום את כוחה של המערכת החיסונית לטיפול במגוון של מחלות הקשורות אימונולוגיה (סרטן אוטואימוניות כגון או).
זה נוח ללמוד TCRs בעכברי מודל, אשר יכול להתבצע בכמה דרכים. ביצוע TCR מהונדס מודלים העכבר הוא יקר זמן רב, וכיום יש רק מספר מוגבל של אותם לזמינים 2-4. לחלופין, בעכברים עם אנטיגן ספציפי מתאי T יכול להיות שנוצר על ידי מח העצם הכימרה. שיטה זו גם לוקח מספר שבועות ומחייב מומחיות 5. התמרה retroviral של TCRs לתוך מבחנה מופעל עכבר מתאי T הינה שיטה מהירה וקלה יחסית להשיג מתאי T של סגוליות פפטיד MHC הרצוי. Antigen ספציפיות מתאי T יכול להיווצר בשבוע אחד המשמש את כל היישומים במורד הזרם. לימוד transduced מתאי T יש גם יישום ישיר חיסוני אנושי, כמו העברת המאמצת של האדם מתאי T transduced עם אנטיגן ספציפי לערמונית TCRs היא אסטרטגיה המתעוררים לטיפול בסרטן 6.
כאן אנו מציגים פרוטוקול retrovirally transduce TCRs לתוך מבחנה מופעל עכבר מתאי T. שני גנים אנושיים בעכבר TCR ניתן להשתמש. רטרווירוסים נושאת גנים ספציפיים TCR נוצרים נהגו להדביק עכבר מתאי T מופעלים עם נוגדנים אנטי CD3 ו CD28 אנטי. לאחר בהרחבת חוץ גופית, transduced מתאי T מנותחים על ידי cytometry הזרימה.
Protocol
1. הכן Construct retroviral
- תת לשבט את T-cell receptor (TCR) הגן של עניין לתוך וקטור retroviral (איור 1, וקטורים למשל pMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs מ Cellbiolabs). Α TCR ו - גן שרשרת β צריך להיות על אותו וקטור בשליטת היזם אותו כדי להבטיח ביטוי שווה. אם TCR עניין אנושי, אנושי התחומים קבוע צריך להיות מוחלף על ידי תחומים עכבר קבוע 9. תצפית שלנו היא TCRs באורך מלא אדם אינם מבטאים ביציבות על העכבר מתאי T.
- הכן את ה-DNA באיכות גבוהה באמצעות פלסמיד Qiagen מקסי Prep קיט או מוצר דומה. ריכוז הפלסמיד צריך להיות סביב 1 מיקרוגרם / μL.
2. Transfection ו-T-cell בידוד
יום -1 (אריזה תאים פלייט)
- לעקור Platinum-E (Plat-E, Cellbiolabs) תאים אריזה retroviral עם טריפסין-EDTA ולנטרל DMEM עם התקשורת.
- צנטריפוגה התאים XG ב 1000 עבור 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב DMEM התקשורת.
- קבע את מספר התא לדלל את התאים ב 0.6x10 6 / mL. פלייט 10 מ"ל של השעיה תא צלחת 10mm poly-ליזין מצופה תרבות רקמות לגדול בין לילה בתא החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
יום 0 (transfection)
- למחרת בבוקר, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ אור. התאים צריכים להיות כ -80% ומחוברות.
- להסיר בעדינות את התקשורת מן הצלחת. לשטוף את התאים פעם עם 1x PBS ולהוסיף 10 מ"ל מראש חימם, טרי DMEM התקשורת ללא סטרפטומיצין, פניצילין (פן / סטרפטוקוקוס).
(הערה: פן / סטרפטוקוקוס יכול להפריע transfection) - הכן מורכב transfection.
הכינו תערובת A ו-B כדלקמן:מערבבים: DNA פלסמיד 9 מיקרוגרם PCL-Eco פלסמיד עוזר 6.3 מיקרוגרם OptiMEM 1.5 מ"ל מערבבים B: Lipopfectime 2000 60 μL OptiMEM 1.5 מ"ל
דגירה A ו-B בנפרד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר
מערבבים A ו-B יחד בעדינות דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור מורכבות transfection. - לאט לאט לטפטף את התערובת (מ"ל סה"כ 3) לתוך Plat-E תאים. רוק בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה כדי לפזר את התערובת באופן שווה transfection.
- דגירה התאים ב 37 ° CO 5 / 2% בשנת חממה התא.
- לאחר 6-8 שעות, להחליף בינוני עם 10 מ"ל של מדיום DMEM טריים (עם פן / סטרפטוקוקוס) לייצור ויראלי.
סמל צלחת עם נוגדנים
- עכבר מתאי T צריך להיות מופעל לפני התמרה ויראלית. ישנן דרכים שונות כדי להפעיל את T-תאים. כאן אנו משתמשים מחויב צלחת נוגדנים נגד CD3e ו CD28 אנטי. הכינו תערובת נוגדנים של 1 מיקרוגרם / מ"ל של אנטי CD3e ו 2 מיקרוגרם / מ"ל של אנטי CD28 ב PBS סטרילית.
- לוותר על 250 μL של תערובת נוגדנים היטב כל צלחת 24 גם בתרבית רקמה. צלחת יכול להיות מצופה בכל לילה בשעה 37 ° C 4 שעות או 2 ° C.
הכנת ההשעיה תא בודד מתוך טחול עכבר
- עכבר קציר הטחול ולהעביר בינוני RPMI.
- מניחים את הטחול בתוך מסננת התא. מועכים את הטחול עם הבוכנה מזרק לתוך צלחת 5 ס"מ תרבות רקמות. יש לשטוף את התאים מסננת את התא עם סטרילי PBS.
- צנטריפוגה 1000 XG, 5 דקות.
- בטל supernatant. Resuspend תא גלולה במאגר lysing ACK (2 מ"ל לכל טחול). דגירה 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף RPMI בינוני עד 20 מ"ל ו - 1000 צנטריפוגות XG דקות 5.
- בטל supernatant. Resuspend תא גלולה ב סטרילי PBS. קביעת מספר תאים 1000 XG צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 4 ° C. המשך בידודה של תא-T.
ניתוק והפעלה של העכבר מתאי T
- מגנטית התווית תאים על פי המדריך של המוצר (CD8 + T-cell ערכת בידוד Miltenyi BIOTEC).
- המקום טור LS (Miltenyi BIOTEC) ב מ 'agnetic השדה. החל ההשעיה תא שכותרתו על הטור. איסוף flow-through (מועשר עכבר CD8 + T-תאים). לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם חיץ 3 מ"ל לפי ידנית את המוצר לשלב הקודם עם זרימה דרך.
- הכתם התאים עם נוגדנים אנטי CD3e ואנטי CD8a ולנתח ידי cytometry זרימה (איור 2 א). עבור הפרדה טיפוסי, ~ 8-10% של תאים הכולל יכול להיות מבודד. ~ 90% של תאים בודדים הם CD8 + T-תאים.
- צנטריפוגה התאים XG ב 1000, 5 דק '. בטל supernatant. Resuspend התא גלולה במדיום RPMI עם רקומביננטי אנושי IL-2 (rhIL2, 20 ng / mL) בשעה 1x10 6 / mL.
- רק לפני הוספת תאים, להסיר פתרון נוגדן מהצלחת (הכין בעבר 2.11). יש לשטוף היטב עם כל PBS סטרילית להסיר PBS.
- הוסף 1 מ"ל של ההשעיה התא היטב כל אחד. שים את הצלחת ב 37 ° C / 5% CO 2 בתוך תא חממה.
3. (יום 2 ויום 3) של זיהום פעיל מתאי T
- אחרי 2 ימים של הפקה וירוס, המדיום בצלחת Plat-E התא צריך להיות צהוב. העברת supernatant ויראלי צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של מדיום DMEM טרי לצלחת לייצור ויראלי נוסף (אופציונלי).
- צנטריפוגה supernatant וירוס XG ב 1000 דקות 5 להסיר פסולת תאים. בזהירות supernatant העברת הנגיף צינור חדש. השאירו כמה נוזלים בתחתית הצינור לא להפריע פסולת תאים.
- איסוף מופעל מתאי T מהצלחת לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. קבע את מספר התא. שמור כמה תאים לתוך צינור נפרד לשמש מלאה (בלתי transduced) שלילי. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 5 דקות וזורקים supernatant.
- Resuspend התא בנגיף supernatant גלולה בשעה 10 6 תאים לכל 1 מ"ל עם rhIL2 20 נ"ג / מ"ל ו - 10 מיקרוגרם / מ"ל של סולפט protamine. הוסף 1 מ"ל של השעיה התא היטב כל צלחת גם 24. Resuspend התאים בצינור השליטה במדיום RPMI בצפיפות באותו תא עם אותה כמות של סולפט rhIL2 ו protamine. הוסף את התאים צלחת זהה.
- לעטוף את הצלחת עם סרט פלסטי. צנטריפוגה 90 דקות XG 2000, בשעה 32 ° C עם הבלם לא.
- לאחר צנטריפוגה, הסר את סרט פלסטי. הוסף 1 מ"ל של מדיום RPMI טרי עם 20 ng / mL rhIL2 היטב כל אחד. שים את הצלחת בחזרה אל האינקובטור.
- (אופציונאלי) רמת ביטוי גבוהה של TCR ניתן להשיג על ידי איסוף supernatant וירוס ולחזור על הליך זיהום ביום 3.
4. הרחבת תאים והערכה של יעילות התמרה
- בדוק את transduced מתאי T יומי. פצל את התאים על יחסי 01:03 בעת הצורך ב RPMI בינוני rhIL2. אל תתנו לגדול יותר תאים (בינוני פונה צהוב).
- באותו יום 6 או 7 יום, כתם התאים עם הנוגדנים ו tetramer MHC ספציפי עבור TCR להעריך את הביטוי של TCR על פני תא T. שימוש בלתי transduced מתאי T כמו הביקורת (איור 2 ג).
- Transduced מתאי T מוכנים עבור יישומים נוספים במורד הזרם.
5. נציג תוצאות
לעיתים קרובות יתרון לטהר T-cell תת לפני התמרה למרות splenocytes ניתן transduced ללא טיהור. גבוהה T-cell תת טוהר ניתן להשיג באמצעות חרוזים מגנטיים מסחרי (איור 2 א).
כדי להעריך את רמת הביטוי של TCRs על מתאי T, נוגדנים ספציפיים עבור TCR אלפא או בטא שרשרות ניתן להשתמש. בדרך כלל 30% עד 80% של התאים יכולים להביע transduced TCR (איור 2b) בהתאם הגנים TCR ו titers וירוס. MHC ספציפי tetramer עבור TCR יכול לשמש גם כדי לקדם לאמת ביטוי פונקציונלית של TCRs (איור 2 ג).
באיור 1. דוגמה של הגן T-cell receptor לבנות תת משובטים לתוך וקטור retroviral. אלפא אורך מלא וגנים שרשרת בטא מחוברים באמצעות מקשר עצמית cleavable 2A פפטיד 8.
איור 2. דוגמה של בידוד התמרה מוצלח של העכבר מתאי T. (א) CD8 T-תאים היו מבודדים splenocytes באמצעות CD8a + בידוד T Cell Kit (Miltenyi BIOTEC) ומוכתמת עם נוגדנים אנטי CD3e ואנטי CD8a. מבודד CD8 T-תאים היו transduced עם R6C12 TCR ספציפי עבור האדם gp100: 209 -217 4 פפטיד ומוכתמת עם נוגדן אנטי אנושי Vbeta 8 (ב) ו - HLA-A2kb gp100 tetramer (ג).
Discussion
מספר צעדים חיוניים כדי להשיג תוצאות אופטימליות. Plat-E התא קו האריזה צריכים להיות כל הזמן במצב בריא. אם יש צורך, התאים יכולים להיות passaged כמה פעמים DMEM בינוני עם 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל blasticidin למנוע אובדן של הביטוי retroviral מבנה החלבון. ביום transfection, התאים צריכים להיות ומחוברות ~ 80%. תאים מעט מדי או יותר מדי עשוי להפחית את כייל הנגיף. איכות הנגיף ניתן לבדוק על ידי בדיקת על שורות תאים שניתן בקלות transduced. מאז TCRs דורשים CD3 מתחמי לבוא לידי ביטוי על פני התא, אנו משתמשים באופן שגרתי 58α-/β- תאים hybridoma 10 (קו התא אינו מבטא אנדוגני TCR או שרשרת α β, אך אינו מורכב להביע CD3). אנו להשיג כמעט 100% התמרה היעילות של תאים hybridoma כאשר transducing תאים עם 1 מ"ל של supernatant וירוס. לבסוף, ה-T לתאים צריך להיות מופעל מתרבים כי רטרווירוס יכול רק להדביק באופן פעיל בחלוקת תאים.
השיטה המוצגת כאן להפקת אנטיגן ספציפי מתאי T יש מספר מגבלות. ראשית, קשה להגיע ליעילות התמרה 100% עבור העכבר העיקרי מתאי T. חלק מן התאים אינם מבטאים את TCR של עניין. שנית, transduced TCR α β ורשתות יכול mispair עם TCRs אנדוגני 9, אשר עשוי להפחית את רמת הביטוי של TCR של עניין. בנוסף, TCRs mispaired עלול לגרום אוטואימוניות in vivo 11. לבסוף, יש רק מסגרת זמן מוגבלת transduced מתאי T ניתן להשתמש. אחרי בערך שבוע, התאים עוברים אפופטוזיס אלא אם כן להיות מחדש מגורה. עם זאת, תאים עשויים להיות מותשים לאבד פונקציות עם גירויים חוזרים מחדש.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH (5U01CA137070) לבין האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן (RSG-09-070-01-LIB), חוקר במכון לחקר הסרטן פרס (ח"כ), הלב האגודה האמריקאית טרום דוקטורט המילגה (ק"מ) משרד ספרדית החינוך והמדע Fellowship (APG).
ברצוננו להודות לד"ר ניקולס Restifo וד"ר Zhiya יו (NIH / NCI) עבור הצעות מועילות לפרוטוקול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
