Summary
我々はレトロウイルス導入を用いて抗原特異的マウスT細胞を生成するためにプロトコルを提示
Abstract
T細胞受容体（TCR）は、免疫系で中心的な役割を果たします。 T細胞表面上のTCRは特に抗原提示細胞（APC）1によって提示されたペプチド抗原を認識することができます。この認識は、T細胞の活性化と機能的転帰（例えば、サイトカイン産生、標的細胞の殺傷）のシリーズにつながる。 TCRの機能的役割を理解することは、免疫関連疾患（例えば、がんや自己免疫）の様々な治療に免疫システムのパワーを活用することが重要です。
それはいくつかの方法で達成することができるマウスモデルにおけるTCRは、勉強すると便利です。 TCRトランスジェニックマウスモデルを作ることはコストと時間がかかり、現在入手可能なそれらの2-4の限られた数があります。また、T細胞抗原特異的とマウスはキメラ骨髄で生成することができます。また、このメソッドは数週間かかると専門知識5が必要です。 in vitroで活性化したマウスにおける T -細胞にTCRのレトロウイルス導入は、所望のペプチド- MHC特異性のT細胞を得るために迅速かつ比較的簡単な方法です。抗原特異的T -細胞は、1週間で生成され、任意のダウンストリームアプリケーションで使用することができます。 T -細胞形質勉強することも、人間の免疫療法に直接アプリケーションを持っている、ヒトT細胞の養子移入として抗原特異的TCRの形質導入は、がんの治療6新たな戦略です。
ここでは、レトロウイルスin vitroで活性化したマウスのT細胞の中にするTCRを形質導入するプロトコルを提示する。ヒトとマウスのTCR遺伝子の両方を使用することができます。特定のTCR遺伝子を有するレトロウイルスが生成され、マウス抗- CD3および抗CD28抗体で活性化T細胞に感染するために使用されます。 in vitroでの展開で 、形質導入の後にT細胞をフローサイトメトリーによって分析されています。
Protocol
1。レトロウイルスコンストラクトを準備
- レトロウイルスベクター（図1、7 PMSG例のベクトル、pMIGII 5,8、CellbiolabsからpMXs）に興味のあるT細胞受容体（TCR）遺伝子をサブクローン。 TCRαおよびβ鎖遺伝子は同じ発現を保証するために、同じプロモーターの制御下にある同じベクトル上に存在する必要があります。興味のTCRが人間である場合、ヒト定常ドメインは、マウスの定常領域9によって置き換える必要があります。私たちの観察は、その全長ヒトTCRのが安定してマウスのT細胞に発現しないです。
- キアゲンマキシプレップキットまたは類似の製品を使用して高品質のプラスミドDNAを準備します。プラスミドの濃度は約1μg/μLのになっているはず。
2。トランスフェクションとT細胞の分離
デイ-1（プレートのパッケージング細胞）
- トリプシン- EDTAでプラチナ- E（PLAT - E、Cellbiolabs）レトロウイルスパッケージング細胞を取り除くとDMEM培地で中和する。
- 5分間1,000 × gで細胞を遠心分離します。上清を吸引除去し、DMEM培地で細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞数を決定し、0.6x10 6 / mLで細胞を希釈する。プレート10 10ミリメートルポリリジンコートした組織培養プレートに細胞懸濁液の添加および37℃で細胞インキュベーターで一晩増殖° C、5％CO 2。
0日目（トランスフェクション）
- 翌朝、光学顕微鏡下で細胞を調べます。細胞は約80％コンフルエントにする必要があります。
- 静かにプレートからメディアを取り外します。 1 × PBSで細胞を1回洗浄し、ペニシリン - ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）なしで10 mLを予め温めておいた、新鮮なDMEM培地を加える。
（注：ペン/咽頭トランスフェクションに干渉することができます） - トランスフェクション複合体を準備する。
次のようにAとBを混ぜる準備します。プラスミドDNA：ミックス 9μgの プラスミドPCL -エコヘルパー 6.3μgの OPTIMEM 1.5 mLの ミックスB：Lipopfectime 2000 60μL OPTIMEM 1.5 mLの
室温で5分間別々にAとBをインキュベート
優しく一緒にAとBを混ぜ合わせ、トランスフェクション複合体を形成するために、室温で20分間インキュベートする。 - ゆっくりPLAT - E細胞に混合物（合計3 mL）を滴下。ゆっくりと均等にトランスフェクション混合物を配布するために、プレートを前後揺らし。
- 37細胞をインキュベート° C / 5％セルインキュベーターのCO 2。
- 6-8時間後に、ウイルス産生のための新鮮なDMEM培地（ペン/連鎖球菌を含む）の10mLで培地を交換してください。
抗体でコーティングプレート
- マウスT細胞はウイルスの形質導入の前にアクティブにする必要があります。 T -細胞を活性化するために、さまざまの方法があります。ここでは、プレート結合抗CD3eと抗CD28抗体を使用してください。抗CD3eと滅菌PBSで抗CD28の2μg/ mLの1μg/ mLの抗体の混合物を準備します。
- 24ウェル組織培養プレートの各ウェルに抗体の混合物の250μLを分注します。プレートは4℃で一晩コーティングすることができます℃または37℃で2時間を
マウスの脾臓からの単一細胞懸濁液の調製
- 収穫のマウスの脾臓およびRPMI培地への転送。
- セルストレイナーで脾臓を置きます。マッシュ5 cmの組織培養プレートにシリンジのプランジャーと脾臓。滅菌PBSで細胞ストレーナーから細胞をすすいでください。
- 1000年XG、5分間遠心します。
- 上清を捨てる。 ACK溶解緩衝液で再懸濁し、細胞ペレット（脾臓あたり2 mL）で。室温で2〜3分インキュベートします。 20 mLのにRPMI培地を加え、5分で1000 × gで遠心する。
- 上清を捨てる。滅菌PBSで再懸濁し、細胞ペレット。細胞数を決定し、4℃で5分間1000 × gでの遠心℃にT細胞の分離に進んでください。
マウスT細胞の単離と活性化
- 磁気製品の取扱説明書（Miltenyi Biotec社からCD8 + T細胞単離キット）にしたがって細胞を標識する。
- mのLSカラム（Miltenyi Biotec社）を配置agneticフィールド。カラムに標識細胞懸濁液を適用する。 （マウスCD8 + T細胞を豊かに）、フロースルーを収集する。製品のマニュアルにしたがって3 mLのバッファーでカラムを3回洗浄し、フロースルー前で組み合わせる。
- 抗CD3eと抗CD8a抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリー（図2a）で分析する。典型的な分離のために、全細胞の〜80〜10パーセントを単離することができる。 〜単離された細胞の90％はCD8 + T細胞です。
- 1000年XG、5分で細胞を遠心分離します。上清を捨てる。 1 × 10 6 / mLで組換えヒトIL - 2（rhIL2、20 ng / mL）を含むRPMI培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
- 単にセルを追加する前に、プレート（2.11で事前に準備された）から抗体溶液を除去。滅菌PBSと削除PBSで各ウェルを洗浄します。
- 各ウェルに細胞懸濁液1 mLを追加します。 37℃/ 5％セルインキュベーターのCO 2でプレートを置く。
3。活性化T細胞の（2日目と3日目）感染
- ウイルス産生の2日後、PLAT - E細胞プレートの培地が黄色になるはず。 15 mLコニカルチューブにウイルス上清を移す。さらにウイルス産生（オプション）用のプレートに、新鮮なDMEM培地10mLを追加します。
- 細胞片を除去するために5分間1,000 × gでウイルス上清を遠心してください。慎重に新しいチューブにウイルス上清を移す。チューブの底にある液体のままにして、細胞の残骸を乱すことがありません。
- プレートから50 mLコニカルチューブにT細胞活性化集める。細胞数を決定します。ネガティブ（非形質導入）コントロールとして使用される別々のチューブにいくつかのセルを保存。 5分間1,000 × gで遠心すると上清を捨てる。
- 硫酸プロタミンの20 ng / mLのrhIL2および10μg/ mLの1 mL当たり10 6個の細胞でウイルス上清中の細胞ペレットを再懸濁します。 24ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液1 mLを追加します。 rhIL2と硫酸プロタミンの同量で同じ細胞密度でのRPMI培地でのコントロールのチューブに細胞を再懸濁します。同じプレートにセルを追加。
- プラスチックフィルムとプレートを包みます。ブレーキなしで32℃で、2000 × gで90分間遠心します。
- 遠心分離後、プラスチックフィルムを取り外します。各ウェルに20 ng / mLのrhIL2と新鮮RPMI培地1 mLを追加します。インキュベーターにバックプレートを置く。
- （省略可能）TCRの高い発現レベルは、ウイルス上清を収集し、3日目に感染症の手順を繰り返すことによって達成することができます。
4。細胞の増殖と形質導入効率の評価
- 毎日T -細胞形質を調べます。 1時03分比、必要なときRPMI培地rhIL2の時にセルを分割する。細胞の生い茂るを（培地が黄色に変わる）ようにしてください。
- 6日目または7日目では、抗体とT細胞の表面上のTCRの発現を評価するためにTCRのための特定のMHCテトラマーで細胞を染色。使用してコントロールとしてT細胞（図2c）非形質導入。
- T -細胞形質導入は、さらに下流のアプリケーションのための準備が整いました。
5。代表的な結果
脾細胞を精製せずに形質導入することができますが、それは伝達の前にT細胞サブセットを精製することがしばしば有利である。高純度のT細胞サブセットは、商業的な磁気ビーズを（図2a）を使用して取得できます。
T細胞上のTCRの発現レベルを評価するために、TCRのαまたはβ鎖に特異的な抗体を使用することができます。一般的に細胞の30％〜80％が発現することができるTCR遺伝子とウイルスの力価に応じて、TCR（図2b）を導入した。 TCRのためのMHCテトラマー特定はさらにTCRの機能的発現（図2c）を確認するために使用することができます。
図1。 T細胞受容体遺伝子の例は、構築するサブクローン化レトロウイルスベクターに。全長αおよびβ鎖の遺伝子は、自己開裂可能な2Aのペプチドリンカー8によってリンクされています。
図2。マウスのT細胞の正常な分離と伝達の例は、。（）CD8 T細胞は、CD8a + T Cellアイソレーションキット（Miltenyi Biotec社）と抗CD3eと抗CD8a抗体で染色を用いて脾細胞から単離した。抗ヒトVbeta 8抗体（B）およびHLA - A2kb gp100四量体（c）と209 -217 4ペプチドとステンドグラス：CD8 T細胞の単離されたヒトgp100のためのR6C12 TCR特異的に導入した。
Discussion
いくつかのステップは、最適な結果を達成するために重要です。 PLAT - Eパッケージング細胞株は、健康な状態に維持する必要があります。必要に応じて、細胞はレトロウイルス構造タンパク質の発現の消失を防ぐために、1μg/ mlのピューロマイシン、10μg/ mlのブラストサイジンを含むDMEM培地中で数回継代することができます。トランスフェクション当日に、細胞が〜80％コンフルエントにする必要があります。少なすぎるまたは多すぎる細胞は、ウイルスの力価が低下する可能性があります。ウイルスの品質を容易に形質導入することができる細胞株でのテストで確認することができます。 TCRのはCD3複合体が細胞表面に発現することが必要とするため、我々は日常的に使用58α-/β-ハイブリドーマ細胞10（内因性TCRαまたはβ鎖を発現しますが、速達CD3複合体を行いますしない細胞株）。ウイルス上清1mlで細胞を形質導入するときに我々は、ハイブリドーマ細胞のほぼ100％の導入効率を得る。レトロウイルスだけ積極的にセルを分割感染することができますので、最後に、T -細胞が活性化し増殖する必要があります。
抗原特異的T -細胞を産生するためにここで紹介する方法はいくつかの制限があります。最初に、それは一次マウスT細胞のために100％の導入効率を達成することは困難です。セルの部分は、金利のTCRを発現しない。第二に、TCRαおよびβ鎖は関心のTCRの発現レベルを減少させる可能性がある、内在性TCRは9に誤対合できる形質。さらに、mispaired TCRは生体 11 の自己免疫を引き起こす可能性があります。最後に、限られた時間枠T -細胞を使用することができる形質導入は、唯一の存在です。約1週間後、細胞を再刺激されている場合を除きアポトーシス受ける。しかし、細胞が枯渇し、反復的な再刺激と機能を失う可能性があります。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIH（5U01CA137070）からの助成金と米国癌学会（RSG - 09から070 - 01 - LIB）、がん研究所の研究者賞（MK）、米国心臓協会の事前博士フェローシップ（KM）とによってサポートされていました教育と科学フェローシップ（APG）のスペイン省。
我々は、プロトコルに有用な提案に感謝博士ニコラスRestifoと博士致雅ゆう（NIH / NCI）をしたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
