Summary
우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을 제시
Abstract
T - 세포 수용체 (TCRs)는 면역 체계의 중심 역할을한다. T - 세포 표면에 TCRs 특별히 항원 제시 세포 (APCs) 1에 의해 제시 펩티드 항원을 인식할 수 있습니다. 이 인식은 T - 세포 (대상 세포의 살해 예 시토킨 생산) 기능 결과 일련의 활성화에 이르게한다. TCRs의 기능 역할을 이해하는 것은 면역학 관련 질병 (예 : 암 또는 autoimmunity)의 다양한 치료하는 면역 시스템의 능력을 활용하는 것이 중요합니다.
그것은 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다 마우스 모델에 TCRs을 연구하기 편리합니다. 만들기 TCR 유전자 변형 마우스 모델은 비용과 시간이 많이 소요되고 현재 2-4 사용 가능한 그들의 단지 한정된 수가있다. 또는와 마우스 T - 세포 항원은 특정은 키메라 골수에 의해 생성하실 수 있습니다. 이 방법은 몇 주 정도 소요과 전문성 5 필요합니다. 체외 활성화 마우스에서 T - 세포에 TCRs의 Retroviral 전달 원하는 펩티드 - MHC 특이성의 T - 세포를 얻기 위해 신속하고 상대적으로 쉬운 방법입니다. 항원에 특정한 T - 세포는 일주일에 생성 및 다운 스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 있습니다. T - 세포 transduced 공부하는 것이 아니라 인간의 immunotherapy에 직접 응용 프로그램을 가지고, 인간 T - 세포의 입양 전송과 같은 항원 특정 TCRs와 transduced 암 치료 6 새로운 전략이다.
여기 retrovirally 체외 활성화 마우스 T - 세포에로 TCRs를 transduce하는 프로토콜을 제시한다. 인간과 마우스 TCR의 유전자 모두 사용할 수 있습니다. 특정 TCR의 유전자를 갖고 Retroviruses가 생성 마우스 안티 인 경우에는 3 번 CD 및 안티 CD28 항체와 활성화된 T - 세포를 감염하는 데 사용됩니다. 체외 확장에 transduced 후 T - 세포 유동세포계측법에 의해 분석됩니다.
Protocol
1. Retroviral 구축 준비
- retroviral 벡터에 관심있는 T - 세포 수용체 (TCR) 유전자 (그림 1, 7 pMSG 예를 들어 벡터, pMIGII 5,8, Cellbiolabs에서 pMXs)을 하위 클론. TCR α와 β 사슬 유전자가 같은 표현을 보장하기 위해 동일한 모터의 제어하에 동일한 벡터에해야합니다. 관심 TCR 인간있다면, 인간의 지속적인 도메인은 마우스를 지속적으로 도메인 9 대체해야합니다. 우리의 관측은 전체 길이가 인간의 TCRs가 안정적으로 마우스 T - 세포에 표현하지됩니다.
- Qiagen 맥시 준비 키트 또는 유사한 제품을 사용 고품질의 플라스미드 DNA를 준비합니다. 플라스미드의 농도가 1 μg 주변 / μL에서해야합니다.
2. Transfection 및 T - 세포 절연
일 -1 (플레이트 포장 세포)
- 플래티넘 - E (플랫 - E, Cellbiolabs) 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)로 retroviral 포장 세포를 이동시키다과 DMEM 매체와 중화.
- 5 분 1000 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 DMEM 미디어 세포 펠렛을 resuspend.
- 휴대폰 번호를 결정하고 0.6x10 6 / ML에서 세포를 희석. 플레이트 10 A 10mm 폴리 - 라이신 코팅 조직 문화 플레이트의 세포 현탁액의 ML 37에서 세포 배양기에서 하룻밤 성장 ° C 5 % CO 2.
데이 0 (Transfection)
- 다음날 아침, 가벼운 현미경으로 세포를 검사합니다. 세포는 약 80 % 합류한다.
- 부드럽게 접시에서 미디어를 제거합니다. 1X PBS로 세포를 한 번 씻고 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 / Strep)없이 10 ML 사전 예열 신선한 DMEM 미디어를 추가할 수 있습니다.
(참고 : 펜 / Strep transfection를 방해할 수) - transfection 복합을 준비합니다.
A와 B 아래와 같이 혼합 준비 :플라스미드 DNA : A 믹스 9 μg 플라스미드 PCL - 에코 도우미 6.3 μg OptiMEM 1.5 ML 믹스 B : Lipopfectime 2000 60 μL OptiMEM 1.5 ML
상온에서 5 분 별도로 A와 B를 품어
부드럽게 A와 B 함께 믹스와 transfection 단지를 형성하기 위해 상온에서 20 분 동안 품어. - 천천히 플랫 - E 세포로 혼합 (총 3 ML) 똑. 부드럽게 골고루 transfection 혼합물을 배포하는 앞뒤 판 바위.
- 37 세포를 품어 ° 세포 배양기에서 C / 5 % CO 2.
- 6~8시간 후, 바이러스 생산을위한 신선한 DMEM 매체 10 ML (펜 / Strep와 함께)로 매체를 바꿉니다.
항체와 코트 플레이트
- 마우스 T - 세포는 바이러스성 전달되기 전에 활성화해야합니다. T - 세포를 활성화하기 위해 다양한 방법이 있습니다. 여기 플레이트 바운드 안티 CD3e 및 안티 CD28 항체를 사용합니다. 1 μg / ML 방지 CD3e의 2 μg / 멸균 PBS에 항 CD28의 ML의 항체 혼합물을 준비합니다.
- 24 잘 조직 문화 판의 각 잘하는 항체 혼합물 250 μL를 분배. 번호판이 37 4 ° C 또는 2 시간에 밤새 코팅 수 있습니다 ° C.
마우스 비장에서 단일 세포 현탁액의 준비
- 수확 마우스 비장 및 RPMI 매체로 전송할 수 있습니다.
- 셀 스트레이너에있는 비장를 놓습니다. 5cm 조직 문화 판에 주사기의 플런저와 매쉬은 비장. 멸균 PBS로 세포 스트레이너에서 세포를 씻어.
- 1000 XG, 5 분 원심 분리기.
- 뜨는 폐기하십시오. ACK lysing 버퍼에 Resuspend 세포 펠릿 (비장 당 2 ML). 상온에서 2-3 분 알을 품다. 20 ML에 RPMI 매체를 추가하고 5 분 1000 XG를 원심 분리기.
- 뜨는 폐기하십시오. 멸균 PBS에서 Resuspend 세포 펠릿. 4 5 분 핸드폰 번호와 원심 분리기 1000 XG ° C.를 결정 T - 세포의 고립을 진행합니다.
마우스 T - 세포의 분리 및 활성화
- 자기 (磁 气) 제품 설명서 (CD8 Miltenyi Biotec에서 + T - 세포 격리 키트)에 따라 세포를 라벨.
- m의 LS 칼럼 (Miltenyi Biotec)를 플레이스agnetic 분야. 칼럼에 표시된 세포 현탁액을 적용합니다. (마우스 CD8 + T - 세포를 풍부)를 통해 흐름을 수집합니다. 제품 설명서에 따라 3 ML 버퍼로 열 세 번 씻고 흐름을 통해 이전과 결합.
- 안티 CD3e 및 안티 CD8a 항체와 세포를 얼룩 및 유동세포계측법 (그림 2A)에 의해 분석할 수 있습니다. 전형적인 분리, 전체 세포의 ~ 80-10%는 격리 될 수 있습니다. ~ 고립된 세포의 90 %는 CD8 + T - 세포 수 있습니다.
- 1000 XG, 5 분에서 세포를 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. 재조합 인간 IL - 2 (rhIL2, 20 NG / ML) 1x10에서 6 / ML로 RPMI 매체에있는 세포 펠렛을 Resuspend.
- 그냥 세포를 추가하기 전에, 접시 (2.11 이전에 준비)에서 항체 솔루션을 제거합니다. 무균 PBS 및 제거 PBS 각 잘 린스.
- 각각 잘 수있는 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 37 ° C / 5 % 나 세포 배양기의 CO 2의 접시를 넣어.
3. 활성의 (제 2 일 및 3 일) 감염 T - 세포
- 바이러스 생산 2 일 후에, 플랫 - E 셀 플레이트의 매체가 노란색이 될 것입니다. 15 ML 원뿔 관에 바이러스 뜨는을 전송합니다. 추가로 바이러스 제작 (옵션)에 대한 판에 신선한 DMEM 매체 10 ML을 추가합니다.
- 세포의 파편을 제거하는 5 분 1000 XG에 바이러스 뜨는을 원심 분리기. 새로운 튜브에 바이러스 뜨는을 신중하게 전송합니다. 튜브의 맨 아래에 몇 가지 액체를두고 세포의 파편을 방해하지 않습니다.
- 수집은 접시에서 50 ML 원뿔 관에 T - 세포를 활성화. 휴대폰 번호를 확인합니다. 부정 (취소 - transduced) 제어로 사용하기 위해 별도의 튜브에 몇 가지 세포를 저장합니다. 5 분 1000 XG에 원심 분리기 및 뜨는 폐기.
- 20 NG / ML rhIL2 10 μg / 프로타민 황산의 ML 1 ML 당 10 6 세포에 바이러스가 뜨는에서 세포 펠렛을 Resuspend. 24 잘 접시의 각 웰에 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. rhIL2과 프로타민 황산 같은 금액과 같은 세포 밀도에서 RPMI 매체에서 제어 튜브에 세포를 Resuspend. 같은 접시에 세포를 추가합니다.
- 플라스틱 필름과 접시를 넣어. 없이 브레이크와 32 ° C에서 2000 년 XG에서 90 분 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 플라스틱 필름을 제거합니다. 각 물론 20 NG / ML rhIL2 신선한 RPMI 매체 1 ML을 추가합니다. 인큐베이터에 다시 접시를 넣어.
- (선택 사항) TCR 높은 표현 수준은 바이러스 표면에 뜨는를 수집하고 3 일에 감염 절차를 반복하여 얻을 수 있습니다.
4. 셀 확장 및 전달의 효율성 평가
- 검사 일일 T - 세포 transduced. 1시 3분 비율 필요한 경우 RPMI 배지 rhIL2에서에서 세포를 분리. 세포의 자라다를 (중간 노란색 전환)시키지 마십시오.
- 일 6 일 7, 항체 및 T - 세포 표면에 TCR의 표현을 평가할 수있는 TCR 특정 MHC의 tetramer로 세포를 얼룩. 사용 제어와 같은 T - 세포 (그림 2C) UN - transduced.
- T - 세포 transduced 추가 하류 어플 리케이션을위한 준비가되어 있습니다.
5. 대표 결과
그것은 splenocytes가 정화없이 transduced 수 있지만 전달하기 전에 T - 세포 집합을 정화하는 것이 유리합니다. 고순도 T - 세포 집합은 상업 자기 구슬을 (그림 2A)를 사용하여 얻을 수 있습니다.
T - 세포에 TCRs의 표현 수준을 평가하기 위해, TCR 알파 또는 베타 체인에 대한 특정 항체를 사용할 수 있습니다. 일반적으로 세포의 30 % ~ 80 %가 표현할 수있는 TCR의 유전자 및 바이러스 titers에 따라 TCR (그림 2B)은 transduced. TCR에 대한 MHC tetramer의 특정도 더욱 TCRs의 기능 표현 (그림 2C)를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1. T - 세포 수용체 유전자의 예 구성 하위 복제 retroviral 벡터로. 전체 길이 알파 및 베타 사슬 유전자가 자체 cleavable 2A의 펩티드 링커 8 시까지 연결되어 있습니다.
그림 2. 마우스 T - 세포의 성공적인 고립과 전달의 예. (A) CD8 T - 세포 CD8a + T 세포 격리 키트 (Miltenyi Biotec) 및 안티 CD3e 및 안티 CD8a 항체 물들일를 사용 splenocytes에서 고립되었다. 209 안티 인간 Vbeta 8 항체 (B)와 HLA - A2kb gp100 tetramer (C)와 -217 4 펩타이드와 스테인드 : CD8 T - 세포를 격리하는 것은 인간의 gp100에 대한 구체적인 R6C12 TCR과 transduced되었습니다.
Discussion
몇몇 단계는 최적의 결과를 달성하기 위해 중요하다. 플랫 - E 패키징 세포주는 건강한 상태로 보관해야합니다. 필요한 경우, 전지가 retroviral 구조 단백질 표현의 손실을 방지하기 위해 1 μg / ML puromycin, 10 μg / ML blasticidin과 DMEM 매체에 몇 번 passaged 수 있습니다. transfection의 날, 세포 ~ 80 %의 합류해야합니다. 너무 적거나 너무 많은 세포가 바이러스 titer를 줄일 수 있습니다. 바이러스 품질 쉽게 transduced 수있는 세포 라인에 대한 테스트하여 확인하실 수 있습니다. TCRs가 인 경우에는 3 번 CD에 들어 단지는 세포 표면에 표현되는 요구 때문에, 우리는 일상적으로 사용하는 58α-/β- 하이 브리 도마 세포 10 (내생 TCR α 또는 β 사슬을 표현하지만, 표현 인 경우에는 3 번 CD에 들어 복합을 수행하지 않는 세포주). 바이러스 뜨는 1 ML과 세포 transducing 때 우리는 하이 브리 도마 세포의 거의 100 % 전달 효율을 얻습니다. 마지막으로 T - 세포가 활성화되고 레트로 바이러스는 적극적으로 세포를 분리 감염될 수 있기 때문에 proliferating해야합니다.
방법은 항원에 특정한 T - 세포가 여러 가지 한계를 가지고 생산 보시려면 여기를 발표했다. 첫째, 기본 마우스 T - 세포에 대한 100 % 전달 효율에 도달하기가 어렵습니다. 세포의 부분은 관심의 TCR을 표현하지 않습니다. 둘째, TCR α를 transduced와 β 사슬 관심의 TCR 표현 수준을 줄일 수있는, 내생 TCRs와 9 mispair 수 있습니다. 또한, mispaired TCRs는 생체내 11 autoimmunity의 원인이 될 수 있습니다. 마지막으로, 단지 제한된 시간 프레임 T - 세포가 사용할 수 transduced있다. 일주 주변 후, 세포가 다시 자극하고 apoptosis 않는 받고있다. 그러나, 세포가 소진되어 다시 stimulations 반복과 기능을 잃을 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (5U01CA137070)에서 부여와 미국 암 협회 (RSG - 09 - 070-01 - LIB), 암 연구소의 탐정 수상 (MK), 미국 심장 협회 사전 - 박사 화목 (KM) 및 지원했습니다 교육 과학 원정대 (APG)의 스페인어 부.
우리는 프로토콜에 도움이 제안에 대한 감사 닥터 니콜라스 Restifo 박사 Zhiya 유 (NIH / NCI)를하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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References
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