Summary
Мы представляем протокол производить антиген-специфические Т-мышь клеток с использованием ретровирусной трансдукции
Abstract
Т-клеточных рецепторов (TCR) играют центральную роль в иммунной системе. ТКО на Т-клеточной поверхности могут специально признать пептидные антигены, представленные антиген представляющих клеток (БТР) 1. Это признание ведет к активации Т-клеток и ряда функциональных результатов (например, продукции цитокинов, убийство клеток-мишеней). Понимание функциональной роли ТКО имеет решающее значение для использования возможностей иммунной системы для лечения различных заболеваний, связанных иммунологии (например, рака или аутоиммунных заболеваний).
Это удобно для изучения ТКО на мышах, которая может быть выполнена несколькими способами. Создание TCR трансгенных мышах стоит дорого и отнимает много времени и в настоящее время Есть только ограниченное число их доступными 2-4. Кроме того, мыши с антиген-специфических Т-клеток может быть порождена костного мозга химера. Этот метод также занимает несколько недель и требует экспертных знаний 5. Ретровирусные трансдукции ТКО в в пробирке активированный мыши Т-клеток является быстрым и относительно простой способ получения Т-клетки желаемый пептид-МНС специфику. Антиген-специфические Т-клетки могут быть получены в течение одной недели и использовать в любых приложениях вниз по течению. Изучение трансдуцированных Т-клетки также имеет прямое отношение к человеческой иммунотерапия, как приемные передачи человеческих Т-клеток трансдуцированных с антиген-специфические ТКО является новой стратегией для лечения рака 6.
Здесь мы приводим протокол retrovirally преобразовывать в ТКО в пробирке активированный мыши Т-клеток. Оба человека и мыши TCR генов могут быть использованы. Ретровирусы проведения специфических генов TCR генерируются и используются для заражения мышей Т-клетки, активированные с анти-CD3 и анти-CD28 антител. После того как в пробирке расширения, трансдуцированных Т-клетки анализировали с помощью проточной цитометрии.
Protocol
1. Подготовка Ретровирусные Построить
- Sub-клон Т-клеточный рецептор (TCR) гена в ретровирусные вектора (рис. 1, например векторы PMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs от Cellbiolabs). TCR α и β ген цепи должны быть на тот же вектор под контролем того же промотора для обеспечения равного выражения. Если TCR интересов человека, человека константные домены должны быть заменены с помощью мыши константных доменов 9. Наши наблюдения является то, что всю длину человеческой ТКО не стабильно выразить на мышь Т-клеток.
- Подготовка высококачественных плазмидой ДНК с использованием Qiagen Maxi Prep Kit или аналогичный продукт. Концентрация плазмиды должна быть на уровне около 1 мкг / мкл.
2. Трансфекция и Т-клеточного Изоляция
День 1 (клетки пластины упаковка)
- Выбить Платиновый-E (Плат-E, Cellbiolabs) ретровирусных клетки упаковки с помощью трипсина-EDTA и нейтрализовать с DMEM СМИ.
- Центрифуга клетки при 1000 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в DMEM СМИ.
- Определить номер ячейки и разбавленных клеток 0.6x10 6 / мл. Пластина 10 мл клеточной суспензии в 10 мм поли-лизин покрытием планшета для культуры ткани и расти ночь в камере инкубатора при 37 ° C, 5% СО 2.
День 0 (трансфекции)
- Следующим утром, исследовать клетки под световым микроскопом. Камеры должны быть примерно на 80% вырожденная.
- Аккуратно снимите СМИ от пластины. Вымойте клетки сразу с 1x PBS и добавьте 10 мл подогретого, свежие DMEM СМИ без Пенициллин-Стрептомицин (Pen / Strep).
(Примечание: Ручка / Strep может помешать трансфекции) - Подготовка трансфекции комплекса.
Подготовка смеси А и В следующим образом:Mix: ДНК плазмиды 9 мкг PCL-Эко помощник плазмиды 6,3 мкг OptiMEM 1,5 мл Mix B: Lipopfectime 2000 60 мкл OptiMEM 1,5 мл
Инкубируйте и Б отдельно в течение 5 минут при комнатной температуре
Смешать и В вместе мягко и инкубировать 20 минут при комнатной температуре до трансфекции комплекса. - Медленно капельного смеси (всего 3 мл) в Плат-E клеток. Осторожно пластину вперед и назад, чтобы распространять трансфекции смесь равномерно.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C / 5% СО 2 в камере инкубатора.
- Через 6-8 часа заменить среду с 10 мл свежей среды DMEM (с ручкой / Strep) для вирусного производства.
Пальто пластины с антителами
- Мышь Т-клетки должны быть активирована до вирусной трансдукции. Существуют различные способы активации Т-клеток. Здесь мы используем пластины связаны анти-CD3e и анти-CD28 антител. Подготовка антител смесь из 1 мкг / мл анти-CD3e и 2 мкг / мл анти-CD28 в стерильном PBS.
- Внесите 250 мкл антител смеси в каждую лунку 24-луночного планшета для культуры ткани. Пластины могут быть покрыты в течение ночи при 4 ° С или 2 часа при температуре 37 ° C.
Подготовка одного суспензии клеток селезенки от мышей
- Урожай селезенки мышей и трансфер в среде RPMI.
- Место селезенки в камере фильтра. Маш селезенки поршень шприца на 5 см пластина культуры ткани. Промойте клетки от ячейки фильтра стерильной PBS.
- Центрифуга 1000 мкг, 5 мин.
- Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в буфере ACK лизирующего (2 мл на селезенки). Инкубируйте от 2 до 3 минут при комнатной температуре. Добавить RPMI среде до 20 мл и 1000 мкг центрифуги в течение 5 мин.
- Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в стерильных PBS. Определение количества клеток и центрифуги 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° C. Приступить к изоляции Т-клеток.
Выделение и активация мышью Т-клеток
- Магнитное этикетке клеток в соответствии с руководством по продукции (CD8 + Т-клеток изоляции комплект от Miltenyi Biotec).
- Место LS колонке (Miltenyi Biotec) в мagnetic области. Применение меченых клеточную суспензию в колонку. Сбор проточные (обогащенный мыши CD8 + T-клеток). Промыть колонку в три раза с 3 мл буфера в соответствии с руководством по продукции и комбинировать с предыдущими проточные.
- Пятно клетки с анти-CD3e и анти-CD8a антител и анализировать с помощью проточной цитометрии (рис. 2а). Для типичного разделения, ~ 8-10% от общего числа клеток может быть изолирован. ~ 90% от изолированной клетки CD8 + Т-клеток.
- Центрифуга клетки при 1000 мкг, 5 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в среде RPMI с рекомбинантным человеческим IL-2 (rhIL2, 20 нг / мл) при 1х10 6 / мл.
- Просто, прежде чем добавить соты, удалить раствор антител от пластины (подготовленные ранее в 2.11). Промыть каждую лунку стерильной PBS и удалить PBS.
- Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку. Положите пластины при температуре 37 ° C / 5% СО 2 в камере инкубатора.
3. (2-й день и День 3) Заражение активированных Т-клеток
- Через 2 дня вируса производства, среды, в Плат-E ячейки пластины должны стать желтым. Передача вирусного супернатанта в 15 мл коническую трубку. Добавьте 10 мл свежей среды DMEM к пластине для дальнейших вирусных производства (опционально).
- Центрифуга вирус супернатант при 1000 мкг в течение 5 минут, чтобы удалить клетки мусора. Тщательно передачи вируса супернатант в новую пробирку. Оставьте немного жидкости на дне пробирки и не беспокоить клетки мусора.
- Сбор активированных Т-клеток с пластинки в 50 мл коническую трубку. Определить число клеток. Сохранить некоторые клетки в отдельную трубку для использования в качестве отрицательного (ООН-трансдуцированных) контроля. Центрифуга при 1000 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в вирус супернатант на 10 6 клеток в 1 мл с 20 нг / мл rhIL2 и 10 мкг / мл протамина сульфата. Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночный планшет. Ресуспендируют клеток в контрольную пробирку в среде RPMI при одинаковой плотности ячейки с таким же количеством rhIL2 и протамина сульфата. Добавить клетки той же пластинке.
- Оберните пластину с пластиковой пленкой. Центрифуга 90 минут при 2000 мкг, при 32 ° C, без тормозов.
- После центрифугирования, удалить пленки. Добавьте 1 мл свежей среды RPMI с 20 нг / мл rhIL2 в каждую лунку. Положите пластину обратно в инкубатор.
- (Дополнительно) высшего уровня экспрессии TCR может быть достигнуто путем сбора вируса супернатант и повторяющиеся инфекции процедуры в день 3.
4. Расширение клетки и оценка эффективности трансдукции
- Изучить трансдуцированных Т-клеток в день. Разделение клеток в соотношении 1:03, когда это необходимо в RPMI среду rhIL2. Не позволяйте клетки разрастаются (средний желтеет).
- В день, 6 или 7 дней, пятно клеток с антителами и МНС тетрамер специфичные для ТКС для вычисления выражения ТКР на Т-клеточной поверхности. Использование не-трансдуцированных Т-клеток в качестве контрольных (рис. 2).
- Трансдуцированных Т-клетки готовы к дальнейшему течению приложений.
5. Представитель Результаты
Очень часто выгоднее, чтобы очистить Т-клеточных подмножеств до трансдукции хотя спленоцитов можно трансдуцированных без очистки. Высокая чистота Т-клеточных подмножеств может быть получена с использованием коммерческих магнитных шариков (рис. 2а).
Для оценки уровня экспрессии ТКО на Т-клетки, антитела, специфичные для TCR альфа-или бета-цепи могут быть использованы. Обычно 30% до 80% клеток может выразить трансдуцированных TCR (рис. 2, б) в зависимости от генов TCR и вирусные титры. MHC тетрамер специфичные для TCR также может быть использована для дальнейшего проверить функциональное выражение ТКО (рис. 2в).
Рисунок 1. Пример Т-клеточный рецептор гена построить к югу от клонировали в ретровирусного вектора. Полная длина альфа-и бета-гены цепочки связаны между собой самостоятельно расщепляемого 2А пептидный линкер 8.
Рисунок 2. Пример успешного изоляции и трансдукции мыши Т-клеток. () CD8 T-клетки были выделены из спленоцитов использованием CD8a + Т-клеток изоляции Kit (Miltenyi Biotec) и окрашивали анти-CD3e и анти-CD8a антител. Изолированные CD8 T-клетки трансдуцированных с R6C12 TCR специфичны для человека gp100: 209 -217 4 пептида и окрашивали анти-человеческий Vbeta 8 антител (б) и HLA-A2kb gp100 тетрамер (с).
Discussion
Несколько шагов имеют решающее значение для достижения оптимальных результатов. Плат-E упаковки клеточной линии следует иметь в здоровом состоянии. Если необходимо, ячейки могут быть пассировать несколько раз в среде DMEM с 1 мкг / мл пуромицина, 10 мкг / мл blasticidin для предотвращения потери ретровирусных выражение структуры белка. В день трансфекции клетки должны быть ~ 80% вырожденная. Слишком мало или слишком много клеток может привести к снижению титра вируса. Вирус качества может быть проверена путем тестирования на клеточных линий, которые могут быть легко трансдуцированных. С ТКО требуют CD3 комплексов, которые будут высказаны на поверхности клеток, мы обычно используем 58α-/β- гибридомных клеток 10 (клеточная линия, что не выражает эндогенных TCR α или β цепи, но не выразить CD3 комплекса). Получено почти 100% эффективностью трансдукции гибридомных клеток при трансдукции клеток с 1 мл вируса супернатант. Наконец, Т-клетки должны быть активизированы и пролиферирующих потому что ретровирус может только заразить активно делящихся клеток.
Метод, представленный здесь для получения антиген-специфических Т-клеток имеет ряд ограничений. Во-первых, трудно достигать 100% эффективностью трансдукции для первичной мыши Т-клеток. Часть клетки не экспрессируют TCR интересов. Во-вторых, трансдуцированных TCR α и β цепи могут mispair с эндогенными ТКО 9, что может снизить уровень экспрессии TCR интересов. Кроме того, mispaired ТКО может вызвать аутоиммунные в естественных условиях 11. Наконец, есть только ограниченные сроки трансдуцированных Т-клетки могут быть использованы. Примерно через одну неделю, клетки подвергаются апоптозу, если повторной стимуляции. Тем не менее, клетки могут стать исчерпаны, и терять функций повторный запуск раздражениями.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH (5U01CA137070) и Американского онкологического общества (RSG-09-070-01-LIB), Научно-исследовательский институт рака Следователь премии (MK), Американской ассоциации сердца предварительно докторских стипендий (КМ) и испанского Министерства образования и науки стипендий (ПНГ).
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Николая Restifo и д-р Ю. Zhiya (NIH / НИР) за полезные предложения к протоколу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
