Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

Summary

Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie van

Abstract

Dit protocol beschrijft een eenvoudige benadering voor lijm-tape-gebaseerde steekproef van tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door on-tape fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) voor snelle cultuur-onafhankelijke detectie van Salmonella spp. Cell-tapes opgeladen kan ook het gezicht naar beneden worden geplaatst op selectieve agar voor vaste-fase verrijking voorafgaand aan de detectie. Als alternatief kan een laag-volume vloeistof verrijkingen (vloeistofoppervlak miniculture) worden uitgevoerd op het oppervlak van de tape in niet-selectieve bouillon, gevolgd door FISH en analyse via flowcytometrie. Om te beginnen, steriele zelfklevende tape is in contact gebracht met verse producten, wordt lichte druk toegepast, en de tape is verwijderd, fysiek extraheren microben aanwezig zijn op deze oppervlakken. Tapes zijn gemonteerd sticky-kant naar boven op glas microscoop dia's en de bemonsterde cellen gefixeerd met 10% formaline (30 min) en gedehydrateerd met behulp van een ethanolreeks (50, 80, en 95%, 3 minuten elke concentratie). Vervolgens cel geladen tapes zijn gespot met een buffer met een Salmonella-gerichte DNA-probe cocktail en gehybridiseerd gedurende 15 - 30 min bij 55 ° C, gevolgd door een korte spoeling in een wasbuffer om ongebonden probe te verwijderen. Aanhanger, zijn FISH-gelabelde cellen vervolgens tegengekleurd met de DNA-kleurstof 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en de resultaten worden bekeken met behulp van fluorescentie microscopie. Voor vaste-fase verrijking, worden cel-betalen tapes face-down geplaatst op een geschikte selectieve agar oppervlak en geïncubeerd om in situ groei van Salmonella microkolonies, gevolgd door FISH en microscopie zoals hierboven beschreven. Voor vloeistofoppervlak miniculture, zijn cel geladen tapes geplaatst kleverige kant omhoog en een siliconen perfusie kamer wordt toegepast, zodat de tape en het objectglaasje vormen de bodem van een waterdichte kamer waarin een klein volume (≤ 500 pi) van trypticasesoja bouillon (TSB) is geïntroduceerd. De inlaat poorten zijn afgesloten en de kamers zijn geïncubeerd bij 35 - 37 ° C, waardoor de groei-gebaseerde amplificatie van de tape-geëxtraheerde microben. Na de incubatie, inlaatpoorten zijn onverhard, cellen zijn vrijstaand en gemengd met krachtig heen en weer pipetteren, geoogst via centrifugeren en gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline. Tot slot, worden monsters gehybridiseerd en onderzocht via flowcytometrie om de aanwezigheid van Salmonella spp onthullen. Zoals hier beschreven, kan onze "tape-FISH 'aanpak van eenvoudige en snelle bemonstering en opsporing van Salmonella op tomaten oppervlakken. We hebben ook gebruik gemaakt van deze aanpak voor de bemonstering andere soorten verse producten, waaronder spinazie en jalapeño pepers.

Protocol

1. Oppervlakte-sampling met steriele Plakband

1. Selecteer een band om te gebruiken voor de bemonstering. De commercieel verkrijgbare Schimmels-Tape of Con-Tact-It sampling tapes zijn steriel en speciaal verpakt voor gebruiksgemak. We hebben echter ontdekt dat transparant (optisch helder) generieke office tape ook kan worden gebruikt.
2. Gebruik een permanent marker op 1 cm ² vierkanten te tekenen op de niet-klevende zijde van een 10 cm stukje plakband (een papieren sjabloon kan worden gebruikt). Dit zal dienen als een visuele leidraad voor het noteren van welk deel van de tape is gebruikt om de voedingsmiddelen-en milieu-oppervlak monster.
3. Vorm een ​​"C"-vormige lus van tape met de plakkerige zijde het oppervlak te bemonsteren. Om dit te doen, houdt u de sticky ends met de duim en middelvinger en de positie van de wijsvinger tegen de getekende vierkant op de rug (niet-klevende zijde) van de band (figuur 1).
4. Plaats de tape op het oppervlak te bemonsteren en druk voorzichtig op het aangegeven gebied tegen het oppervlak. Zonder dat het loslaten van de randen van de tape, gebruik dan de wijsvinger om ervoor te zorgen dat de kleverige zijde van de cassette komt volledig in contact met het monster oppervlak, het vermijden van bubbels.
5. Met behulp van een nog beweging, langzaam trek de tape uit de buurt van het monster, fysiek extraheren oppervlakte-gebonden microben. Bevestig de cel geladen tape, kleverige kant naar boven, op een glazen microscoopglaasje met behulp van generieke transparante kantoor tape. Zorg voor een goede spanning / uitrekken van de tape, zodat een vlakke, niet-rimpelige oppervlak is gecreëerd. Dit zal helpen minimaliseren problemen met vervorming / kromtrekken van de band tijdens de latere verhitting tijdens de hybridisatie.

2. Vaste fase Verrijking en vloeistofoppervlak Miniculture

1. Vaste-fase-verrijking wordt uitgevoerd door het plaatsen van de tape zijde naar beneden op xylose-lysine-Tergitol 4 (XLT-4) agarplaten, zodat de in de steekproef cellen zijn geplaatst in direct contact met het agar oppervlak. De templated / monster contact deel van de tape is geplaatst gelijk met de agar oppervlak en een einde van de band is losjes gehandeld op grond van de zijwand van de petrischaal te gemakkelijke verwijdering van de tape van de agar-agar oppervlak te vergemakkelijken na verrijking.
2. Platen zijn omgekeerd (om condensatie te voorkomen) en geïncubeerd bij 35 - 37 ° C voldoende groei van Salmonella spp mogelijk te maken. De lengte van de incubatietijd die nodig is om de cellen te verrijken tot een detecteerbaar niveau zal afhangen van de eerste Salmonella besmetting niveaus. We hebben gezien uitstekend microcolony vorming van lage initiële inocula na 8 uur verrijking.
3. Na de gewenste verrijking periode, opent u de agarplaat. De band behoudt zijn kleverigheid tijdens de incubatie. Druk de tape tegen de agar met de wijsvinger tot maximale recuperatie van microkolonies gevormd op de tape-agar-interface te verzekeren. Pak de tape van de rand aan de muur van de petrischaal en verwijder het met een trage, zelfs beweging. Monteer de cel geladen tape, kleverige kant naar boven, op een microscoopglaasje zoals beschreven in paragraaf 1.5 hierboven. Ga verder met "Fixation en uitdroging" stap hieronder.
4. Voor vloeistofoppervlak miniculture, te beginnen door het vastmaken van de tape wordt gebruikt voor de bemonstering op een objectglaasje zoals beschreven in paragraaf 1.5 hierboven. Vervolgens dekking van de sjablonen / monster contact gedeelte van de tape met een niet-steriele siliconen perfusie kamer (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc), de vorming van een afgesloten ruimte waarvan de bodem bestaat uit de cel geladen tape, naar boven. Stevig, maar voorzichtig op de kamer op zijn plaats om een ​​waterdichte afdichting te garanderen.
5. Met behulp van een flexibele gel laden pipetpunt, transfer ≤ 500 pL trypticasesoja bouillon of ander geschikt medium via een verrijking van de kleine de kamer van de inlaatpoorten. Seal beide poorten met transparant kantoor tape om verdamping en incubeer dia's te voorkomen bij 35 -37 ° C als nodig is voor voldoende verrijking. Hoewel alle operaties moeten worden uitgevoerd volgens een goede bemonstering en van de uitvoeringspraktijken, is steriliteit van port-afdichtingsband of perfusie kamers niet nodig tijdens vloeistofoppervlak miniculture. De combinatie van vis en flowcytometrie in staat zal stellen duidelijke discriminatie van Salmonella spp. van non-target bacteriën die aanwezig kunnen zijn, met de grootste bijdrage van niet-doelsoorten flora verwacht van het monster zelf. Ga verder met "Fixation en uitdroging" stap hieronder.

3. Fixatie en Uitdroging

1. Voor directe oppervlak bemonstering of voor vaste-fase verrijking van Salmonella spp. op de XLT-4 agar, on-tape cel fixatie te voeren gedurende 30 minuten bij 25 ° C door het bedekken van het monster contact gebied met 500 pi 10% neutraal gebufferde formaline.
2. Gooi fixatief in een afsluitbare container (onder een chemische motorkap om de blootstelling aan irriterende / giftige dampen een minimum te beperken).
3. Uitdrogen in een serie ethanol (50%, 80% en 95%, 300 pi / 3 min elke concentratie). Ga verder met "hybridisatie" stap hieronder.
4. Voor de fixatie van 500 pL vloeistofoppervlak miniculture monsters, zijn perfusie kamers ontsloten, en een flexibele gel laad-pipet tip wordt gebruikt om de enrichate halen. Snel op en neer pipetteren wordt gebruikt om effectieve verwijdering van de resterende tape-gebonden cellen te verzekeren.
5. Vervolgens wordt de gehele 500 pL miniculture volume overgebracht naar een microcentrifugebuis en gecentrifugeerd bij 2.000 xg (5 min). Het supernatant wordt verwijderd, de pellet wordt krachtig gevortexed gedurende 30-60 s, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in een gelijk volume van 10% neutraal gebufferde formaline. Cellen gefixeerd gedurende 30 minuten bij 25 ° C.
6. Vervolgens fixatief is verwijderd en wordt het monster opnieuw gesuspendeerd in cel opslagbuffer, als volgt. Het monster wordt afgedraaid bij 2000 xg (5 min, 25 ° C) het supernatant wordt verwijderd, de pellet wordt krachtig gewerveld voor 30 - 60 s, het opnieuw gesuspendeerd in een gelijk volume van 50% niet-gedenatureerde ethanol-50% fosfaat- gebufferde zoutoplossing. Vaste cellen kunnen onbeperkt worden opgeslagen (jaar) bij -20 ° C. Let op: Wanneer vloeistoffen worden gewijzigd (bijvoorbeeld bij de introductie van een fixerende of andere buffer), is het belangrijk om grondig opnieuw in suspensie (met vortexen) de cel pellet in een minimale portie (~ 10 - 20 ui) van de "uitgaande" vloeibare-systeem . Dit zal helpen voorkomen klonteren en dat zelfs suspensies van de individuele cellen zijn verkregen te verzekeren. Ga verder met "hybridisatie" stap hieronder.

4. Hybridisatie

1. Bereid hybridisatie / wasbuffer met behulp van de commerciële moleculaire biologie-grade oplossingen vermeld in tabel Materials. Laatste buffer component concentraties zijn 0,7 M NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,1% natriumdodecylsulfaat, tot aan het uiteindelijke gewenste volume met moleculair-grade water en gefilterd met behulp van een 0,22 urn spuit of kopje filter. Dezelfde buffer, zonder de toevoeging van sondes (zie hieronder) wordt gebruikt als een wassen buffer. Verwarm de hybridisatie en het wassen van buffers tot 55 ° C.
2. Voeg fluorescent-gelabeld Sal3 (Nordentoft et al., 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ') en Salm-63 (Kutter et al., 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) oligonucleotideprobes (Materials tabel) om voorverwarmde hybridisatiebuffer. In totaal probe concentratie van 5 ng ui ^-1 is gebruikt (bv. 2,5 ng pi ^-1 elke probe, Bisha en Brehm-Stecher, 2009a).
3. Voor de direct-to-tape en de vaste fase verrijking monsters, overlay van de sjablonen monster contactoppervlak van de band met 300 pi van hybridisatie buffer met de probe cocktail en hybridiseren tape-gebonden cellen in een vochtige, afgesloten incubatiekamer ingesteld op 55 ° C. Als er een direct contact incubator, zoals de Slide Moat instrument (Materials tabel) wordt gebruikt, worden monsters gehybridiseerd voor 15 min en> 20 dia's kunnen tegelijk worden verwerkt. Als een roterende-stijl hybridisatie oven, zoals de Bambino instrument (Materials tabel) wordt gebruikt, worden dia's geplaatst in 50 ml polypropyleen centrifugebuizen voor hybridisatie, een dia per buis. Omdat de warmte-overdracht is niet direct, zijn deze monsters gehybridiseerd voor een langere periode (tot 30 min).
4. Na hybridisatie, worden de dia's verwijderd en de probe-bevattende hybridisatiebuffer overlay is weggegooid. Dia's worden vervolgens kort en voorzichtig gespoeld met voorverwarmde wasbuffer door pipetteren een klein volume van de buffer meer dan een gekantelde dia (3 spoelingen van 300 pi per stuk), of formeel gewassen (tot 30 min) met ofwel een overlay van de voorverwarmde wassen buffer of onderdompeling in een 50 ml polypropyleen centrifugebuis met voorverwarmde wasbuffer. In onze ervaring, hoewel een formele wasbeurt geeft betere resultaten (minder haze van ongebonden probe), een eenvoudige spoeling is voldoende voor eenduidige detectie van Salmonella spp. Vervolgens dia's worden de lucht gedroogd voordat ze naar de "Detection" stap hieronder.
5. Hybridisatie van vloeistofoppervlak miniculture monsters wordt uitgevoerd door te stoppen met draaien monsters (vers vaste of bewaard in opslagbuffer bij -20 ° C) gedurende 5 min bij 2000 xg, gevolgd door een krachtige vortexen van de pellet en resuspensie in 100 ul voorverwarmde hybridisatiebuffer met de sonde cocktail. Monsters worden gehybridiseerd bij 55 ° C gedurende 30 minuten op een warmte-blok of een andere geschikte incubatie station (Materialen tabel), gevolgd door de toevoeging van 500 ul voorverwarmde wasbuffer. Net als bij tape-gebonden samples, kunnen deze monsters formeel worden gewassen tot 30 min met verdere incubatie bij 55 ° C in deze wasbuffer, met intermitterende vortexen. Als alternatief kunnen monsters grondig vortex na toevoeging van 500 ul voorverwarmde wasbuffer, gevolgd door onmiddellijke oogsten voor de analyse (zie hieronder).
6. Ter voorbereiding voor de detectie van Salmonella spp. via flowcytometrie, vloeistofoppervlak miniculture monsters worden gecentrifugeerd bij 2000 xg gedurende 5 minuten, het supernatant wordt verwijderd en de monsters zijn geresuspendeerd in 300 pi kamertemperatuur (~ 25 ° C) PBS. Als monsters nodig vervoer naar een verre faciliteit, of als er een vertraging wordt verwacht tussen hybridisatie en analyse, kunnen monsters worden gekoeld of op ijs gehouden voorafgaand aan de analysis. Als alternatief, kunnen monsters worden overgebracht naar cel opslag buffer (50:50 mengsel van PBS en absolute ethanol) en gehouden op -20 ° C voor maximaal een week, zonder noemenswaardige verliezen in de probe-verleende fluorescentie (Bisha en Brehm-Stecher, 2009b) .

5. Opsporing

1. Voor on-tape detectie van Salmonella spp. via fluorescentie microscopie, zijn direct-to-tape of vaste fase verrijking monsters overlayed met ~ 10 pi Vectashield H-1200 montage medium dat de nucleaire tegenkleuring 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), gemonteerd met een dekglas, vervolgens geïncubeerd in het donker gedurende 10 minuten.
2. Immersie olie wordt geplaatst op de cover slip, en monsters worden onderzocht met behulp van een high-vergroting olie doelstelling (63x of 100x). De DAPI filter wordt gebruikt om het monster te brengen in beeld, de microscoop wordt vervolgens in de juiste filter (groen of rood, afhankelijk van de kleurstof gebruikt om de end-label van de probes) en Salmonella cellen zijn visueel gescoord op basis van hun fluorescentie (Cijfers 2 en 3).
3. Voor cytometrische detectie van vloeibare oppervlak miniculture monsters, kunnen verschillende instrumenten worden gebruikt, afhankelijk van de lokale beschikbaarheid. In ons lab, zijn PBS-opgeschort monsters overgebracht naar 5 ml met ronde bodem bemonstering buizen (BD Falcon) en onderzocht met behulp van een FACSCanto doorstroomcytometer met excitatie bij 647 nm (Materialen tabel). Voor verrijkte monsters met hoge aantallen van het totaal bacteriën, is de "low flow rate"-instelling (10 pL min ^-1) gebruikt en 5,000-50,000 gebeurtenissen zijn verzameld. De gegevens worden geanalyseerd met behulp FlowJo software (versie 8.8.6, Tree Star, Inc, Ashland, OR) of een andere geschikte analyse software (figuur 4, panelen A en B).

6. Representatieve resultaten

Figuur 1. Het gebruik van plakband voor de bemonstering van Salmonella spp. van het oppervlak van een kunstmatig besmette tomaten.

Figuur 2. Typische resultaten voor direct-to-tape bemonstering en FISH detectie van Salmonella Typhimurium ATCC 14028 van het oppervlak van een tomaat (100 X olie doelstelling). Een twee-probe cocktail van Texas Red-gelabelde probes (Sal3/Salm-63) werd gebruikt te labelen deze cellen.

Figuur 3. Microkolonies van Salmonella Typhimurium ATCC 14028 gevormd op het oppervlak van Xylose Lysine Tergitol-4 (XLT-4) agar na een acht uur on-tape verrijking bij 37 ° C. De eerste inoculum werd bemonsterd van het oppervlak van een kunstmatig besmette tomaten. Vaste fase verrijking verhoogt het aantal cellen beschikbaar zijn voor detectie en ook verbetert de cellulaire rRNA inhoud.

Figuur 4. Het gebruik van plakband voor de bemonstering van S. enterica serovar Typhimurium van het oppervlak van een kunstmatig besmette tomaten, gevolgd door een directe analyse via FISH en flowcytometrie (paneel A) of na 5 uur non-selectieve vloeistofoppervlak miniculture verrijking in een perfusie kamer gevuld met 500 pL trypticasesoja bouillon (paneel B ).

Discussion

Eenvoudige en snelle methodes voor de detectie van pathogenen op de productie van oppervlakken kan helpen verzachten door voedsel overgedragen ziekten door het verstrekken van tijdige en bruikbare data. Zelfklevende tape op basis van bemonsteringsmethoden zijn gebruikt in milieu-, klinische en levensmiddelenmicrobiologie sinds de jaren 1950 en omvatten indrukken van "Scotch"-stijl tape aan oppervlakken voor het verwijderen van micro-organismen, gevolgd door direct microscopisch onderzoek of de overdracht van het aanklevende micro-organismen aan vaste media voor groei (Barnetson & Milne, 1973; Edwards & Hartman, 1952; Evancho et al., 2001;. Fung et al., 1980;. Lakshmanan & Schaffner, 2005; Langvad, 1980). Een recente wijziging beschreef de combinatie van tape-based sampling met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) voor cultuur-onafhankelijke analyse van micro-organismen koloniseren de oppervlakken van de stenen monumenten (La Cono & C. Urzì, 2003). We hebben toegepast een vergelijkbare aanpak voor een snelle bemonstering en opsporing van Salmonella aanwezig zijn op verse producten, zoals tomaten, spinazie en Jalapeño pepers (Bisha en Brehm-Stecher, 2009a). Zelfklevende tape kan worden gebruikt om de cellen van deze voedingsmiddelen en monsters te verwijderen kunnen dan worden verwerkt voor FISH en bekeken via fluorescentie microscopie. Op deze manier kan zo weinig als 10 ³ CFU cm ^-2 Salmonella (de detectielimiet voor microscopie-gebaseerde methoden) worden gedetecteerd op verse producten binnen ~ 1,5 tot 2 uur Als alternatief kan kort (8 uur) vaste fase verrijkingen worden uitgevoerd door het plaatsen van de cel-opgeladen tape voorkant naar beneden op selectieve agar, en de daaruit voortvloeiende microkolonies gedetecteerd door FISH. Door overlappen van de tape met ≤ 500 pL vloeibaar medium, kan tape in de steekproef Salmonella cellen worden verwijderd en direct gedetecteerd na het vissen met flowcytometrie (figuur 4, panel A). Korte incubatietijd (~ 5 uur) van deze niet-selectieve vloeibare minicultures maakt aanzienlijke verrijking van bacteriën, met Salmonella cellen gemakkelijk gedetecteerd in complexe mengsels van target-en non-target cellen na FISH (figuur 4, paneel B). Collectief, onze resultaten tonen aan dat deze aanpak een nieuwe methode voor de winning, de presentatie en de identificatie van specifieke bacteriën aanwezig zijn op tomaten en andere verse producten biedt. Hoewel we hebben beschreven het gebruik van DNA-gebaseerde probes hier, is het waarschijnlijk dat deze aanpak ook kan worden uitgebreid naar andere probe chemie, zoals peptide nucleïnezuren (PNAS), waarvoor Salmonella-specifieke probes zijn ook beschreven (Almeida bevatten et al.., 2010).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used