Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

Summary

Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere di

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo semplice per nastro adesivo a base di campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da su-nastro ibridazione in situ fluorescente (FISH) per una rapida indipendente dalla cultura di rilevamento di Salmonella spp. Nastri Cell-paga può anche essere posizionato a faccia in giù su agar selettivo per fase solida arricchimento prima rilevazione. In alternativa, a basso volume arricchimenti liquido (miniculture superficie liquida) può essere effettuata sulla superficie del nastro in brodo non selettivo, seguito da FISH e analisi mediante citometria a flusso. Per iniziare, nastro adesivo sterile è portato a contatto con prodotti freschi, una leggera pressione viene applicata, e il nastro viene rimosso, fisicamente estrazione microbi presenti su queste superfici. I nastri sono montati appiccicosa rivolta verso l'alto su vetrini da microscopio in vetro e le cellule campionate sono fissati con formalina al 10% (30 min) e disidratati attraverso una serie graduata di etanolo (50, 80, e il 95%; 3 minuti per ogni concentrazione). Successivamente, cellule carica nastri sono macchiati con tampone contenente un cocktail mirato Salmonella sonda di DNA e ibridato per 15 - 30 min a 55 ° C, seguita da un breve risciacquo in un buffer di lavaggio per rimuovere la sonda non legata. Aderente, PESCE-etichettati cellule sono poi di contrasto con il DNA colorante 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ed i risultati sono visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Per la fase solida arricchimento, la cella a carica nastri sono disposti a faccia in giù su una superficie adatta agar selettivi e incubate per consentire la crescita in situ di microcolonie Salmonella, seguita dalla FISH e microscopia come descritto sopra. Per miniculture superficie del liquido, la cella a carica nastri sono disposti lato adesivo e una camera di perfusione di silicone viene applicato in modo che il nastro e far scorrere forma microscopio il fondo di una camera a tenuta stagna in cui un piccolo volume (≤ 500 mL) di Trypticase soia Broth (TSB) è introdotto. I condotti di aspirazione sono sigillati e le camere sono incubate a 35 - 37 ° C, permettendo una crescita a base di amplificazione del nastro estratto microbi. Dopo l'incubazione, condotti di aspirazione sono sigillate, le cellule si staccano e mescolato con schiena vigorosa e indietro pipettaggio, raccolte tramite centrifugazione e fissato nel 10% formalina tamponata neutra. Infine, i campioni sono ibridate e esaminati attraverso la citometria a flusso per rivelare la presenza di Salmonella spp. Come descritto qui, il nostro approccio "nastro-FISH" in grado di fornire campionamento semplice e rapida e la rilevazione di Salmonella sulle superfici di pomodoro. Abbiamo inoltre usato questo metodo per il campionamento di altri tipi di prodotti freschi, tra cui spinaci e peperoni jalapeño.

Protocol

1. Campionamento superficie con del nastro adesivo sterile

1. Selezionare un nastro da utilizzare per il campionamento. Disponibili in commercio funghi-Tape o Con-Tatto-It nastri di campionamento sono sterili e appositamente confezionati per la facilità d'uso. Tuttavia, abbiamo scoperto che trasparente (otticamente chiaro) nastro ufficio generico può anche essere usato.
2. Utilizzare un pennarello indelebile per disegnare 1 cm ² quadrati sulla non appiccicoso lato di un pezzo di 10 centimetri di nastro adesivo (un modello di carta può essere utilizzata). Questo servirà come guida visuale per notare che parte del nastro è stato utilizzato per campionare la superficie alimentare o ambientale.
3. Formare una "C" a forma di anello di nastro, con la parte adesiva verso la superficie da campionare. Per fare questo, tenere le estremità adesive con il pollice e il medio e posizionare il dito indice contro il quadrato disegnato sul retro (non appiccicosa lato) del nastro (Figura 1).
4. Posizionare il nastro sulla superficie da campionare e premere delicatamente la zona segnata contro la superficie. Senza rilasciare i bordi del nastro, utilizzare il dito indice per garantire che la parte adesiva del nastro viene a contatto con la superficie del campione, evitando le bolle.
5. Utilizzando un movimento anche, tirare lentamente il nastro lontano dal campione, l'estrazione di superficie fisicamente legato microbi. Fissare la cellula carica nastri, lato adesivo alto, su un vetrino di vetro con il nastro trasparente generico ufficio. Garantire la giusta tensione / allungamento del nastro in modo che un appartamento, non rugosa superficie è creato. Questo aiuterà a ridurre i problemi di deformazione / arricciatura del nastro durante il successivo riscaldamento durante l'ibridazione.

2. Fase solida arricchimento e Miniculture superficie del liquido

1. In fase solida arricchimento viene eseguito ponendo il nastro a faccia in giù su xilosio-lisina-Tergitol 4 (XLT-4) piastre di agar in modo che le cellule campionate sono posti in contatto diretto con la superficie agar. La parte templated contatto / campione del nastro è posto a filo con la superficie di agar e una delle estremità del nastro è liberamente aderito alla parete laterale della scatola di Petri di facilitarne la rimozione del nastro dalla superficie agar seguenti arricchimento.
2. Le piastre sono invertiti (per evitare la condensazione) e incubate a 35 - 37 ° C per consentire una crescita sufficiente di Salmonella spp. La lunghezza del periodo di incubazione necessario per arricchire le cellule ad un livello rilevabile dipende dai livelli iniziali contaminazione da Salmonella. Abbiamo osservato la formazione eccellente microcolony dal basso inoculo iniziale dopo 8 ore di arricchimento.
3. Dopo il periodo di arricchimento desiderato, aprire la piastra di agar. Il nastro manterrà la sua appiccicosità durante l'incubazione. Premere delicatamente il nastro contro l'agar con il dito indice per garantire il recupero massimo di microcolonie formato a nastro-agar interfaccia. Afferrare il nastro dal bordo attaccata alla parete della scatola di Petri e rimuoverlo con un lento, anche il movimento. Montare il cellulare a carica nastro, lato adesivo alto, su un vetrino da microscopio, come descritto al punto 1.5. Procedere al punto "fissazione e disidratazione" di seguito.
4. Per miniculture superficie del liquido, iniziare il fissaggio del nastro utilizzato per il campionamento su un vetrino da microscopio, come descritto al punto 1.5. Successivamente, coprire la parte basati su modelli di contatto / campione del nastro con un non-sterile camera di silicone perfusione (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), formando una camera stagna cui fondo è composto di cellule carica nastro, rivolta verso l'alto. Con fermezza, ma premere delicatamente la camera in posizione per assicurare la tenuta stagna.
5. Utilizzando un gel di carico flessibile puntale, trasferimento ≤ 500 microlitri brodo di soia Trypticase o altro mezzo idoneo di arricchimento attraverso una delle porte piccola insenatura della camera. Seal entrambe le porte con del nastro adesivo trasparente ufficio per evitare l'evaporazione diapositive e incubare a 35 -37 ° C come necessario per l'arricchimento sufficiente. Anche se tutte le operazioni devono essere eseguite secondo le buone pratiche di campionamento e la manipolazione, la sterilità di porta-nastro di tenuta o camere perfusione non è necessaria durante miniculture superficie del liquido. La combinazione di FISH e citometria a flusso consentirà discriminazione chiaro di Salmonella spp. da non bersaglio batteri che possono essere presenti, con il più grande contributo di non bersaglio flora dovrebbe provenire dal campione stesso. Procedere al punto "fissazione e disidratazione" di seguito.

3. Fissazione e disidratazione

1. Per il campionamento di superficie diretta o per l'arricchimento in fase solida di Salmonella spp. XLT su agar-4, eseguire on-nastro fissazione delle cellule per 30 minuti a 25 ° C, coprendo l'area di contatto del campione con 500 microlitri 10% formalina tamponata neutra.
2. Scartare fissativo in un contenitore sigillabile (sotto una cappa chimica per minimizzare l'esposizione a irritanti / vapori tossici).
3. Disidratare in una serie di etanolo (50%, 80% e 95%, 300 ml / 3 minuti per ogni concentrazione). Passare al punto "ibridazione" di seguito.
4. Per il fissaggio del campione di 500 microlitri di liquido miniculture superficies, camere di perfusione sono sigillate, e un flessibile gel-loading puntale viene utilizzato per estrarre il enrichate. Pipettaggio rapido su e giù è usato per contribuire ad assicurare la rimozione efficace di qualsiasi nastro residuo legato cellule.
5. Successivamente, l'intero volume di 500 microlitri miniculture è trasferito in una provetta e centrifugare a 2.000 xg (5 min). Il supernatante viene scartato, il pellet è in agitazione energicamente per 30-60 s, quindi risospeso in un volume pari al 10% formalina tamponata neutra. Le cellule sono fissate per 30 minuti a 25 ° C.
6. Successivamente, fissativo viene rimosso e il campione viene risospeso in un tampone di cella di stoccaggio, come segue. Il campione viene centrifugato a 2.000 xg (5 min, 25 ° C) il supernatante viene scartato, il pellet è in agitazione energicamente per 30 - 60 s, il risospesi in un volume pari al 50% di etanolo non denaturato-50%-fosfato soluzione salina tamponata. Cellule fisse possono essere conservati a tempo indeterminato (anni) a -20 ° C. Nota: Ogni volta che i liquidi sono cambiati (ad esempio, quando l'introduzione di un buffer di fissativo o diverso), è importante per sospendere di nuovo a fondo (con vortex) il pellet di cellule in una porzione minima (~ 10-20 mL) del sistema "in uscita" liquido . Questo aiuterà a prevenire aggregazione e di garantire che le sospensioni, anche di singole cellule si ottengono. Passare al punto "ibridazione" di seguito.

4. Ibridazione

1. Preparare ibridazione / tampone di lavaggio utilizzando il commerciale biologia molecolare-grade soluzioni indicato nella tabella dei Materiali. Finale concentrazioni dei componenti del buffer sono 0.7 M di NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8,0], 10 mM EDTA, solfato di sodio 0,1% dodecil, composto al volume finale desiderato con molecolare acqua di grado e filtrata con una siringa da 0,22 micron o filtro tazza. Il buffer stesso, senza l'aggiunta di sonde (vedi sotto) è usato come tampone di lavaggio. Preriscaldare il buffer di ibridazione e lavaggio a 55 ° C.
2. Aggiungi fluorescenza marcata Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ') e Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) sonde oligonucleotidiche (Tabella Materiali) al buffer di ibridazione preriscaldato. Una concentrazione sonda totale di 5 microlitri ^-1 ng viene utilizzato (ad esempio 2,5 ng microlitri ^-1 ogni sonda; Bisha e Brehm-Stecher, 2009a).
3. Per i campioni di fase direct-to-tape e solida arricchimento, sovrapporre il template area di contatto campione del nastro con 300 l di tampone di ibridazione contenente il cocktail della sonda e ibridare nastro legato cellule in un umido, camera di incubazione sigillata impostato a 55 ° C. Se un contatto diretto come lo strumento Fossato Slide (Tabella Materiali) incubatore è usato, i campioni sono ibridate per 15 min e> 20 diapositive possono essere trattati simultaneamente. Se un rotante in stile fornetto come lo strumento Bambino (Tabella Materiali) è usato, gli scivoli sono posti in provette da 50 ml per centrifuga in polipropilene per l'ibridazione, uno scivolo per provetta. Poiché il trasferimento di calore non è diretto, questi campioni sono ibridate per periodi più lunghi (fino a 30 min).
4. Dopo l'ibridazione, le diapositive vengono rimossi e la sonda overlay contenente tampone di ibridazione viene scartato. Le diapositive vengono poi brevemente e delicatamente sciacquati con preriscaldato tampone di lavaggio pipettando un piccolo volume di tampone su un vetrino inclinato (3 risciacqui di 300 ogni mL), o formalmente lavato (fino a 30 min) o con una sovrapposizione di tampone di lavaggio preriscaldato o immersione in un tubo di polipropilene da 50 ml per centrifuga contenente tampone preriscaldato lavaggio. Nella nostra esperienza, anche se un lavaggio formale fornirà risultati migliori (meno foschia dalla sonda non legata), un semplice risciacquo è sufficiente per l'individuazione univoca di Salmonella spp. Successivamente, le diapositive sono essiccati all'aria, prima di passare alla fase "Rivelazione" di seguito.
5. Ibridazione di campioni liquidi miniculture superficie viene effettuata riducendo la velocità campioni (fresco fisso o tenuti in soluzione per la conservazione a -20 ° C) per 5 min a 2.000 xg, seguita da vortex vigorosa del pellet e risospensione in 100 microlitri di buffer di ibridazione preriscaldato contenente la sonda cocktail. I campioni sono ibridate a 55 ° C per 30 minuti su un blocco di calore o di altri stazione incubazione adatto (Tabella Materiali), seguita da aggiunta di 500 microlitri di lavaggio tampone preriscaldato. Come con il nastro legato campioni, questi campioni possono essere lavati formalmente per un massimo di 30 minuti con ulteriore incubazione a 55 ° C in questo tampone di lavaggio, con vortex intermittente. In alternativa, i campioni possono essere completamente in agitazione dopo l'aggiunta di 500 microlitri di buffer di lavaggio preriscaldato, seguita dalla raccolta immediata per l'analisi (in basso).
6. In preparazione per il rilevamento di Salmonella spp. mediante citometria a flusso, i campioni di liquido miniculture superficie sono centrifugare a 2.000 xg per 5 minuti, il supernatante viene scartato ed i campioni sono risospesi in 300 microlitri temperatura ambiente (~ 25 ° C) PBS. Se i campioni necessitano di trasporto in una struttura lontana, o se il ritardo è prevista tra ibridazione e di analisi, i campioni possono essere refrigerati o in attesa sul ghiaccio prima di analisi. In alternativa, i campioni possono essere trasferiti al buffer di cella di stoccaggio (50:50 miscela di PBS e etanolo assoluto) e ha tenuto a -20 ° C per un massimo di una settimana senza perdite apprezzabili sonda conferito fluorescenza (Bisha e Brehm-Stecher, 2009b) .

5. Rivelazione

1. Per il nastro di rilevamento di Salmonella spp. tramite microscopia a fluorescenza, direct-to-tape o solido campioni arricchimento fase sono sovrapposti con ~ 10 L Vectashield H-1200 mezzo di montaggio contenente il nucleare di contrasto 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), montati con un vetrino, poi incubate al buio per 10 minuti.
2. Olio di immersione è posto sul vetrino, e campioni vengono esaminati con un alto ingrandimento obiettivo olio (63x e 100x). Il filtro DAPI viene utilizzato per portare il campione a fuoco, il microscopio è poi passato al filtro appropriato (verde o rosso, a seconda del colorante usato per terminare le sonde-label) e le cellule di Salmonella sono segnato visivamente in base alla loro fluorescenza (figure 2 e 3).
3. Per il rilevamento mediante citometria di campioni liquidi miniculture superficie, vari strumenti possono essere utilizzati, a seconda della disponibilità locale. Nel nostro laboratorio, PBS, sospeso campioni vengono trasferiti in provette da 5 mL fondo di campionamento (BD Falcon) ed esaminato usando un citofluorimetro FACSCanto con eccitazione a 647 nm (tabella materiali). Per i campioni arricchito contenente un numero elevato di batteri totale, il "basso flusso" impostazione (10 L min ^-1) è usato e 5,000-50,000 eventi vengono raccolti. I dati sono analizzati utilizzando FlowJo software (versione 8.8.6, Albero Star, Inc., Ashland, OR) o altri software di analisi idoneo (Figura 4, pannelli A e B).

6. Rappresentante Risultati

Figura 1. L'uso di nastro adesivo per il campionamento di Salmonella spp. dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminata.

Figura 2. I risultati tipici di direct-to-tape campionamento e l'individuazione del pesce di Salmonella Typhimurium ATCC 14028 dalla superficie di un pomodoro (100 obiettivo olio X). Sonda a due cocktail di Texas Red sonde marcate (Sal3/Salm-63) è stato utilizzato ad etichettare queste cellule.

Figura 3. Microcolonie di Salmonella Typhimurium ATCC 14028 formata sulla superficie del xilosio lisina Tergitol-4 (XLT-4) agar dopo un h 8 su nastro di arricchimento a 37 ° C. L'inoculo iniziale è stato prelevato dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminata. In fase solida arricchimento aumenta il numero di cellule disponibili per la rilevazione e migliora anche cellulari contenuto rRNA.

Figura 4. L'uso di nastro adesivo per il campionamento di S. enterica sierotipo Typhimurium dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminata, seguita da un'analisi diretta tramite FISH e citometria a flusso (pannello A) o dopo 5 ore di arricchimento non selettivo liquido miniculture superficie in una camera di perfusione pieno di 500 microlitri Trypticase Soy Broth (pannello B ).

Discussion

Metodi semplici e rapidi per l'individuazione di agenti patogeni sulle superfici producono possono contribuire a mitigare le malattie di origine alimentare, fornendo dati tempestivi e fruibili. Nastro adesivo a base di metodi di campionamento sono stati utilizzati in termini ambientali, cliniche e microbiologia degli alimenti fin dal 1950 e coinvolgono pressione del tipo "Scotch" nastro alle superfici per la rimozione dei microrganismi, seguito dal diretto esame microscopico o il trasferimento di microrganismi aderente al terreno solido per crescita (Barnetson & Milne, 1973; Edwards e Hartman, 1952; Evancho et al, 2001;. Fung et al, 1980;. Lakshmanan e Schaffner, 2005; Langvad, 1980). Una recente modifica descritta la combinazione di campionamento basato su nastro con ibridazione in situ fluorescente (FISH) per la cultura indipendente di analisi di microrganismi colonizzare le superfici dei monumenti di pietra (La Cono & C. Urzì, 2003). Abbiamo applicato un approccio simile per il campionamento e la rilevazione rapida di Salmonella presenti su prodotti freschi, tra cui i pomodori, spinaci e peperoni Jalapeño (Bisha e Brehm-Stecher, 2009a). Nastro adesivo può essere usato per rimuovere le cellule da questi alimenti e campioni possono quindi essere trattati per FISH e visualizzati tramite microscopia a fluorescenza. In questo modo, da un minimo di 10 ³ CFU Salmonella centimetri ^-2 (il limite di rilevamento per metodi di microscopia-based) possono essere rilevati su prodotti freschi all'interno di ~ 1,5-2 h. In alternativa, breve (8 ore) arricchimenti fase solida può essere effettuata posizionando il cellulare con carica faccia nastro giù su agar selettivo, e il conseguente microcolonie rilevato da FISH. Sovrapponendo il nastro con ≤ 500 microlitri mezzi liquidi, nastro campionato cellule Salmonella può essere staccato e rilevati direttamente dopo PESCE in citometria a flusso (Figura 4, pannello A). Incubazione breve (~ 5 ore) di questi non selettivi minicultures liquido permette l'arricchimento sostanziale dei batteri, con le cellule Salmonella facilmente individuabili in miscele complesse di cellule bersaglio e non bersaglio dopo la FISH (Figura 4, pannello B). Collettivamente, i nostri risultati dimostrano che questo approccio fornisce un nuovo metodo per l'estrazione, la presentazione e l'identificazione di batteri specifici presenti in pomodori e altri prodotti freschi. Anche se abbiamo descritto l'uso di sonde basati sul DNA qui, è probabile che questo approccio può anche essere ampliato per includere chimiche sonda alternative, come gli acidi nucleici peptidici (PNA), per i quali Salmonella sonde specifiche sono state descritte (Almeida et al., 2010).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used