Summary
Этот протокол описывает простую клей-ленты на основе подход к отбору проб из помидоров и другой свежей поверхности продукции, с последующим быстрым целом обнаружения ячейки
Abstract
Этот протокол описывает простой подход для клея-ленты на основе выборки из помидоров и других свежих поверхностей производят, а затем на ленту флуоресценции в гибридизация (FISH) для быстрого культуры независимой обнаружения бактерии рода сальмонелла. Сотовые заряженные ленты могут также быть помещены лицевой стороной вниз на селективном агаре для твердофазной обогащения до обнаружения. Кроме того, низкие объемы жидкости обогащения (жидкие miniculture поверхности) могут быть выполнены на поверхности ленты в неселективных бульон, а затем FISH и анализ с помощью проточной цитометрии. Во-первых, стерильные клейкой ленты приводят в контакт со свежими продуктами, нежное давление применяется, и лента удаляется, физически извлечения микробы присутствуют на этих поверхностях. Ленты крепятся липкой стороной вверх на предметные стекла микроскопа и стекла пробы клетки фиксировали 10%-ного формалина (30 мин) и обезвоженной использованием градуированных серии этаноле (50, 80 и 95%; 3 мин каждой концентрации). Затем клетка заряженные ленты пятнистый с буфером, содержащим Salmonella ориентированных коктейль ДНК-зонда и гибридизовали в течение 15 - 30 мин при 55 ° С с последующим кратким полоскания в стиральной буфера для удаления несвязанного зонда. Приверженец, FISH-меченых клеток, затем контрастно с ДНК красителя 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI), а результаты просматривать с помощью флуоресцентной микроскопии. Для твердой фазы обогащения, сотовые заряженные ленты расположены лицевой стороной вниз на подходящей поверхности селективного агара и инкубировали, чтобы на месте рост сальмонелл микроколоний, а затем FISH и микроскопии, как описано выше. Для жидких miniculture поверхности клеточной взимается ленты размещены липкой стороной вверх и камеры силиконовые перфузии применяется таким образом, чтобы лента и стекло микроскопа форма нижней части водонепроницаемую камеру, в которой малый объем (≤ 500 мкл) Trypticase Соевый Отвар (БСЭ) вводится. Впускные отверстия герметизируются и камер инкубируют при 35 - 37 ° C, что позволяет на основе роста усиления ленты экстрагировали микробов. После инкубации, впускные порты распечатал, клетки отделяются и смешивается с энергичным и обратно пипетки, собранных с помощью центрифугирования и фиксировали в 10% нейтральный буферный формалин. Наконец, образцы гибридизированных и исследовали с помощью проточной цитометрии выявить наличие бактерии рода сальмонелла. Как описано здесь, наш «Лента-FISH" подход может обеспечить простой и быстрый отбора проб и обнаружения сальмонеллы в томатном поверхностей. Кроме того, мы использовали этот подход для отбора проб другие виды свежих продуктов, включая шпинат и халапеньо перец.
Protocol
1. Поверхность выборки с Стерильные клейкая лента
- Выберите ленту использовать для отбора проб. Имеющихся в продаже грибов-Tape или контакт-It выборки ленты стерильные и специально упакованы для простоты использования. Тем не менее, мы обнаружили, что прозрачный (оптически прозрачный) общие ленты офиса может также использоваться.
- Используйте маркер, чтобы нарисовать 1 см 2 площади на нелипкую стороной 10 см кусок клейкой ленты (бумажный шаблон может использоваться). Это будет служить руководством для визуального отметить, какая часть ленты была использована для образцов пищи или окружающей среды поверхности.
- Форма "С"-образная петля ленты, с липкой стороной к поверхности, чтобы быть в выборку. Для этого, удерживая липкие концы с большого и среднего пальца и положение указательного пальца против обращается квадрат на спине (не клейкой стороной) на кассету (рис. 1).
- Место ленты на поверхность, чтобы быть отобраны и слегка нажмите выделенную область на поверхность. Не отпуская края ленты, используйте указательный палец, чтобы липкая сторона ленты происходит в полном контакте с поверхностью образца, избегая пузырей.
- Использование даже движения, медленно потяните ленту от образца, физически извлечения поверхностно-связанной микробов. Закрепите клеточной взимается ленты, липкой стороной вверх, на предметное стекло микроскопа с использованием общих прозрачная лента офиса. Обеспечить надлежащее напряжение / растяжение ленты так, чтобы плоская, без морщинистой поверхностью создается. Это поможет свести к минимуму проблемы с деформацией / свертывания ленты во время последующего нагрева при гибридизации.
2. Твердофазные обогащению и жидких Miniculture поверхности
- Твердофазные обогащения осуществляется путем размещения ленты лицевой стороной вниз на ксилозы-лизин-Tergitol 4 (XLT-4) агаром, чтобы пробы клетки находятся в непосредственном контакте с поверхности агара. Шаблонный / образец контакт часть ленты находится вровень с поверхностью агара и один конец ленты свободно придерживаться боковой стенке чашки Петри для облегчения удаления ленты от поверхности агара следующие обогащения.
- Плиты перевернутый (чтобы избежать конденсации) и инкубировали при 35 - 37 ° С тем чтобы обеспечить достаточное рост бактерии рода сальмонелла. Длина инкубационного периода, необходимые для обогащения клетки обнаруживаются уровне будет зависеть от начального уровня загрязнения сальмонеллой. Мы наблюдали отличное образование микроколоний с низкой начальной инокулята через 8 ч обогащения.
- После обогащения желаемого периода, открытых агар пластины. Лента сохранит свою липкость во время инкубации. Аккуратно нажмите лента против агар использовании указательного пальца для обеспечения максимального извлечения микроколоний формируется на ленту-агар интерфейс. Возьмите ленту с краем прикреплен к стене чашку Петри и удалить его с медленным, даже движения. Горы клеточной взимается ленты, липкой стороной вверх, на стекло микроскопа, как описано в разделе 1.5 выше. Перейдите к разделу "Фиксация и обезвоживание" ступеньку ниже.
- Для жидких miniculture поверхности, начать с крепления ленты используются для отбора проб на предметное стекло, как описано в разделе 1.5 выше. Затем крышку шаблонных / образец контакт часть ленты с нестерильных силиконовые перфузии камеры (Coverwell, Грейс Био-Labs, Inc), образуя герметичную камеру, дно которой состоит из клеточной взимается ленты, вверх. Крепко, но аккуратно нажмите камеру на место, чтобы обеспечить уплотнение водонепроницаемыми.
- Использование гибких гель загрузкой пипетки, передача ≤ 500 мкл Бульон Соевый Trypticase или другой подходящей среде обогащения с помощью одного из малых портов камеры на входе. Печать оба порта с прозрачной лентой офис для предотвращения испарения и инкубировать слайды на 35 -37 ° C, сколько необходимо для достаточного обогащения. Хотя все операции должны выполняться в соответствии с надлежащей практикой отбора и обработки, стерильность порта уплотнительную ленту или перфузии камер не требуется в течение жидкой miniculture поверхности. Сочетание FISH и проточной цитометрии позволит ясно дискриминации бактерии рода сальмонелла. от нецелевых бактерии, которые могут присутствовать, с наибольший вклад нецелевых флоры ожидаются из самого образца. Перейдите к разделу "Фиксация и обезвоживание" ступеньку ниже.
3. Фиксация и обезвоживание
- Для прямой отбор проб поверхностных или для твердых обогащение фазы бактерии рода сальмонелла. на XLT-4-агар, выступать на ленту фиксации клеток в течение 30 мин при 25 ° С, покрывая площадь образца контакт с 500 мкл 10% нейтральный буферный формалин.
- Отменить фиксатором в герметичный контейнер (под капотом химические сведения к минимуму воздействия раздражающих / токсичных паров).
- Дегидрировать в серии этанола (50%, 80% и 95%; 300 мкл / 3 мин каждой концентрации). Перейдите к разделу "гибридизации" ступеньку ниже.
- Для фиксации 500 мкл жидкого образца miniculture поверхностис, перфузии камеры распечатал и гибкий гель загрузкой пипетки используется для извлечения enrichate. Быстрое вверх и вниз пипетирования используется, чтобы помочь в обеспечении эффективного удаления каких-либо оставшейся ленты связанного клеток.
- Далее, все 500 мкл объема miniculture передается микроцентрифужных трубки и остановлен на 2000 мкг (5 мин). Супернатант отбрасывается, осадок перемешивают энергично в течение 30-60 с, затем ресуспендировали в равном объеме 10% нейтральный буферный формалин. Клетки фиксированной в течение 30 мин при 25 ° C.
- Далее, фиксирующий удаляется и образец ресуспендировали в ячейку буферной памяти, следующим образом. Образец остановлен на 2000 мкг (5 мин, 25 ° С) супернатант отбрасывается, осадок перемешивают энергично в течение 30 - 60 с, ресуспендировали в равном объеме 50% неденатурированный этиловый спирт-50% фосфатов буферный солевой раствор. Фиксированные клетки могут храниться бесконечно (лет) при температуре -20 ° C. Примечание: Каждый раз, когда жидкости изменяется (например, при введении фиксирующие или различные буфера), важно тщательно ресуспендируют (с вортексе) осадок клеток в минимальном часть (~ 10 - 20 мкл) "исходящих" жидкостной системой . Это поможет предотвратить слипание и гарантируют, что даже суспензии отдельных клеток получаются. Перейдите к разделу "гибридизации" ступеньку ниже.
4. Гибридизация
- Подготовка гибридизации / мойка буфера с помощью коммерческих молекулярной биологии класса решений отмечено в таблице материалов. Заключительные концентрации компонентов буфера 0,7 М NaCl, 0,1 М Трис [рН 8,0], 10 мМ ЭДТА, 0,1% додецилсульфата натрия, доливают до окончательного желаемого объема с молекулярно-класса водой и фильтруется с помощью шприца 0,22 мкм или чашка фильтра. Этот же буфер, без добавления зондов (см. ниже) используется в качестве моющего буфера. Разогреть гибридизации и стиральные буферов до 55 ° C.
- Добавить флуоресцентно меченных Sal3 (Nordentoft и др., 1997;. 5'-ААТ CAC TTC АКК TAC GTG-3 ') и Salm-63 (Куттер и др., 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) олигонуклеотидных зондов (Материалы таблицу) на разогретой буфером гибридизации. Общая концентрация зонда 5 нг мкл -1 используется (например, 2,5 нг мкл -1 каждый зонд; Биша и Брем-Stecher, 2009a).
- Для прямого-лента и твердых образцов фазы обогащения, наложение шаблонных площадь контакта образец ленты с 300 мкл буфера, содержащего гибридизации зонд коктейль и гибридизации ленты связанного клеток в влажной, герметичной камере инкубации набор до 55 ° C. Если прямой контакт инкубатор, такие как инструмент Слайд Ров (Материалы таблицы) используется, образцы гибридизированных в течение 15 мин и> 20 слайдов могут быть обработаны одновременно. Если роторно-стиль гибридизации духовке, такие как инструмент Бамбино (по материалам таблицы) используется, слайды расположены в 50 мл полипропиленовые трубы для центрифуг гибридизации, одного слайда в трубке. Поскольку перенос тепла не является прямым, эти образцы гибридизированных на более длительный срок (до 30 мин).
- После гибридизации, слайды удаляются и зонд содержащих гибридизации буфера наложения отбрасывается. Слайды то либо кратко и осторожно промыть разогретой промывочного буфера с помощью пипетки небольшой объем буфера более наклонена слайд (3 полоскания в 300 мкл каждой), или формально промывают (до 30 мин), либо с наложением разогретой буфера мытья или Погружение в 50 мл трубки полипропилена центрифуги содержащие разогретой буфера стирки. По нашему опыту, хотя формального мыть обеспечит более высокие результаты (меньше дымка от несвязанного зонда), простые полоскания достаточно для однозначного обнаружения бактерии рода сальмонелла. Далее, слайды сушат на воздухе, прежде чем перейти к "Обнаружение" ступеньку ниже.
- Гибридизация жидких проб miniculture поверхности осуществляется за счет остановки образцов (свеже-фиксированные или хранятся в буфере хранения при температуре -20 ° С) в течение 5 мин при 2000 мкг, а затем энергично вортексе из гранул и ресуспендирования в 100 мкл буфера разогретой гибридизации содержащие Зонд коктейль. Образцы гибридизированных при 55 ° С в течение 30 мин на блок тепла или другой подходящей станции инкубации (материалы см. таблицу), с последующим добавлением 500 мкл буфера разогретой стирки. Как и в ленте связанного образцов, эти образцы могут быть формально мыть в течение до 30 мин с последующей инкубации при температуре 55 ° C в этом промывочный буфер, с прерывистым вортексе. Кроме того, образцы могут быть тщательно перемешивают после добавления 500 мкл буфера разогретой стирки, с последующим немедленным уборки для анализа (см. ниже).
- В ходе подготовки к выявлению бактерии рода сальмонелла. с помощью проточной цитометрии, жидких проб miniculture поверхности остановлен на 2000 мкг в течение 5 мин, надосадочную жидкость отбрасывается и образцы ресуспендируют в 300 мкл комнатной температуре (~ 25 ° C) PBS. Если образцы требуют транспорта в далеком объекта, или если задержка, как ожидается, между гибридизации и анализа, образцы могут хранить в холодильнике или находящиеся на льду до анализиса. Кроме того, образцы могут быть переданы в ячейку хранения буфера (50:50 смеси PBS и абсолютного этилового спирта) и выдерживают при температуре -20 ° С до недели без заметных потерь в зонд-возложенных флуоресценции (Биша и Брем-Stecher, 2009b) .
5. Обнаружение
- Для на-ленту обнаружения бактерии рода сальмонелла. с помощью флуоресцентной микроскопии, прямо к ленте или твердых образцов фазы обогащения наложенных с ~ 10 мкл Vectashield H-1200 монтаж среде, содержащей ядерные контрастирующая 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI), установленного с покровным стеклом, затем инкубировали в темноте в течение 10 мин.
- Погружение нефти находится на покровное стекло, и образцы изучены с помощью высоким увеличением нефти цели (63x или 100x). DAPI фильтр используется для внесения образца в фокусе, микроскоп, затем переключился на соответствующий фильтр (зеленого или красного цвета, в зависимости от красителя используется для конечного этикетке зондов) и сальмонеллы клетки оцениваются визуально по их флуоресценции (рис. 2 и 3).
- Для цитометрии обнаружения жидких проб miniculture поверхности, различные инструменты могут быть использованы, в зависимости от наличия в конкретном регионе. В нашей лаборатории, PBS-приостановлены образцы передаются в 5 мл круглым дном выборки труб (BD Falcon) и изучены с помощью цитометра FACSCanto потока с возбуждения при 647 нм (Материалы таблицу). Для обогащенных образцов, содержащих большое число от общего числа бактерий, "низкий расход" настройки (10 мкл мин -1) используется и 5,000-50,000 событий собираются. Данные анализируются с помощью программного обеспечения FlowJo (версия 8.8.6, Дерево Star, Inc, Ashland, OR) или другое подходящее программное обеспечение для анализа (рис. 4, панелей и В).
6. Представитель Результаты
Рисунок 1. Использование клейкой ленты для отбора проб бактерии рода сальмонелла. с поверхности искусственно загрязненных помидор.
Рисунок 2. Типичные результаты для прямой-лента отбора проб и FISH обнаружения сальмонеллы Typhimurium АТСС 14028 от поверхности томатный (100 X нефти цель). Двухзондовой коктейль из Texas Red-меченых зондов (Sal3/Salm-63) был использован для обозначения этих клеток.
Рисунок 3. Микроколонии сальмонеллы Typhimurium АТСС 14028 формируются на поверхности Ксилоза Лизин Tergitol-4 (XLT-4) агара после 8 часов на ленту обогащения при температуре 37 ° C. начального инокулята был пробы с поверхности искусственно загрязненных помидор. Твердофазные обогащение увеличивает количество клеток для обнаружения, а также повышает клеточный содержание рРНК.
Рисунок 4. Использование клейкой ленты для отбора проб С. enterica серовар Typhimurium от поверхности искусственно загрязненных помидор, а затем с помощью прямого анализа FISH и проточной цитометрии (панель) или после 5 часов неселективным жидким обогащения miniculture поверхности в перфузионной камере, наполненной 500 мкл Trypticase соевом бульоне (группа В ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Простые и быстрые методы для обнаружения патогенов на производство поверхности могут помочь смягчить болезней пищевого происхождения путем предоставления своевременной и актуальной информации. Скотч основе методов выборки были использованы в экологические, клинические и микробиологии пищевых продуктов с 1950-х годов и включают нажатием "скотч" стиле ленту к поверхности для удаления микроорганизмов с последующей прямой микроскопии или передача приверженцем микроорганизмов твердых сред для роста (Барнетсон и Милн, 1973; Edwards & Hartman, 1952; Evancho и др., 2001;. Фанг и др., 1980;. Lakshmanan & Schaffner, 2005; Langvad, 1980). Последние модификации описаны сочетания ленты на основе выборки с флуоресценции в гибридизация (FISH) для культуры независимый анализ микроорганизмы колонизируют поверхности каменных памятников (La Коно & C. Urzì, 2003). Мы применили аналогичный подход для быстрого отбора проб и обнаружения сальмонеллы присутствует на свежие продукты, в том числе помидоры, шпинат и Jalapeño перец (Биша и Брем-Stecher, 2009a). Скотч может быть использован для удаления клеток из этих продуктов и образцы затем могут быть обработаны на рыбу и посмотреть с помощью флуоресцентной микроскопии. Таким образом, всего лишь 10 3 КОЕ см -2 Salmonella (предел обнаружения для микроскопии основе методов) могут быть обнаружены на свежие продукты в течение ~ 1,5 - 2 ч. Кроме того, короткие (8 ч) твердой фазы обогащения могут быть выполнены путем размещения клеточной взимается ленты лицом вниз на селективном агаре, и в результате микроколоний обнаружены FISH. Наложение ленты с ≤ 500 мкл жидких сред, лента-пробы клетки сальмонеллы могут быть отделены и обнаружены непосредственно после FISH с использованием проточной цитометрии (рис. 4, панель). Краткая инкубации (~ 5 ч) этих неселективных minicultures жидкости позволяет существенно обогащения бактерий, сальмонеллой клетки легко обнаружить в сложных смесях целевых и нецелевых клеток после FISH (рис. 4, группа В). В совокупности наши результаты показывают, что этот подход обеспечивает новый способ добычи, представление и определение конкретных бактерий, присутствующих на томатах и других свежих продуктов. Хотя мы описали использование ДНК-зондов здесь, вполне вероятно, что этот подход может быть расширен за счет включения альтернативных химических датчика, например, пептид нуклеиновых кислот (PNAS), для которой сальмонелла-зондами также были описаны (Алмейда и соавт., 2010).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Финансирование этих работ было предоставлено расти Айова Значения фонда награду BFBS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungi-Tape sampling tape | Scientific Device Laboratory | 745 | http://www.scientificdevice.com/ |
| Con-Tact-It sampling tape | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | |
| Clear office tape, generic | Various | Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence | |
| Food surface | Local Grocery Store | Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here | |
| Trypticase Soy Broth | Difco Laboratories | 211768 | For non-selective liquid surface miniculture enrichment |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base | Difco Laboratories | 223420 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement | Difco Laboratories | 235310 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011 | 10% solution, neutral, buffered (cell fixative) |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration) |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase-free | |
| Microscope slides and cover slips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| NaCl solution | Sigma-Aldrich | S5150 | Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component) |
| Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) | Sigma-Aldrich | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component) |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-Aldrich | L4522 | 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component) |
| Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes | Integrated DNA Technologies | 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified | |
| Variable speed microcentrifuge | Various | Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol | |
| CoverWell perfusion chamber | Grace Bio-Lab Inc. | PC1R-2.0 | Non-sterile |
| Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 05-408-151 | Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber |
| Aluminum heat block or precision-controlled heating station | Various | Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here | |
| Bambino mini hybridization oven | Boekel Scientific | Model 230300 | Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct |
| Slide Moat slide hybridizer | Boekel Scientific | Model 240000 | Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide |
| Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain |
| Fluorescence microscope | Various | Leitz Laborlux S used here | |
| Digital camera | Various | Canon PowerShot A640 camera used here | |
| Image acquisition software | Various | Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used | |
| Adobe Photoshop | Adobe | For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels) | |
| Flow cytometer | Various | FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used | |
| Flow cytometry analysis software | Various | FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used |
References
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).
- Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. Skin sampling for Candida with adhesive tape. Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 Forthcoming.
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system. Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).
- Edwards, R. W., Hartman, E. A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces. Lloydia. 15, 39-39 (1952).
- Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F. Microbiological monitoring of the food processing environment. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Pouch Downes, F., Ito, K. , 4th edition, American Public Health Association. Washington, D.C. (2001).
- Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces. J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).
- Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp. FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).
- La Cono, V., Urz, C. Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips. J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).
- Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations. Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).
- Langvad, F. A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves. Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).
- Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears. J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).
