Protocol voor RNAi Testen in volwassen muggen (A. gambiae)

Summary

Omgekeerde genetische benaderingen hebben bewezen zeer nuttig voor het bepalen van welke genen de basis liggen van resistentie tegen pathogenen in vector muggen. Deze video protocol illustreert een methode die wordt gebruikt door de Dimopoulos lab dsRNA injecteren in Anopheles gambiae muggen die de malariaparasiet haven. De techniek het manipuleren van de injectie installatie en het injecteren van dsRNA in de thorax wordt geïllustreerd.

Abstract

Omgekeerde genetische benaderingen hebben bewezen zeer nuttig voor het bepalen van welke genen de basis liggen van resistentie tegen pathogenen in vector muggen. Deze video protocol illustreert een methode die wordt gebruikt door de Dimopoulos lab dsRNA injecteren in Anopheles gambiae muggen die de malariaparasiet haven. De techniek het manipuleren van de injectie installatie en het injecteren van dsRNA in de thorax wordt geïllustreerd.

Protocol

RNAi-gemedieerde gen-silencing in muggen vereist de voorafgaande bereiding en zuivering van specifieke dsRNA's die het gen van belang doel. Voor dsRNA synthese, adviseren wij de Ambion Megascript kit die gebruik maakt van een T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcriptie reactie maakt. Voor dsRNA zuivering, adviseren wij de Qiagen RNeasy kit. Monsters van dsRNA moeten worden gekwantificeerd en aangepast aan de 3 ug / ul in het water. Andere materialen je nodig hebt onder andere: fijne punt pincet, glazen schuif, glas microcapillaire naalden, microinjector (we gebruiken Drummond's Nanoject II), een lichtmicroscoop gemonteerd boven een koud blok, een overdekte glazen petrischaal, papieren handdoeken en een emmer met ijs . U zult ook een manier nodig om muggen en geschikte container voor hen te verzamelen, samen met een bron van voedsel, zoals katoen bal gedrenkt in 10% sucrose.

1. Verzamel je muggen. Met behulp van een batterij-aangedreven afzuiger, het verzamelen van de muggen die u wilt injecteren. Steek het mondstuk met een papieren handdoek of katoenen zodat er geen muggen kan ontsnappen en verwijder het reservoir. Omdat koude temperaturen verdoven muggen, begraaf het reservoir in een emmer met ijs en wacht 5-10 minuten voor de muggen om te stoppen met bewegen. Verdoving kan ook worden bereikt door het plaatsen van het reservoir in een koude kamer of koelkast of met behulp van CO _2. Tijdens deze 5-10 minuten, verder met de volgende stap.
   
   
2. Bereid uw werkplek. Stel een plat oppervlak koud blok tot 2 ° C en plaats een glasplaatje erop. Dit is waar de muggen rust als je ze injecteren. Bevestig een glazen naald op de microinjector en gebruik je een tang om de punt van de naald breken op de gewenste breedte. Het is belangrijk dat de breedte is groot genoeg om voldoende ruimte voor de vloeistof door middel van stromen tegen een redelijke snelheid, maar is smal genoeg om een ​​minimale wond tijdens de injectie toe te brengen. Een goede naald tip zal worden smal genoeg om een ​​beetje buigen maar niet breken. Stel uw injectie apparatuur om de gewenste output volume (voor RNAi, gebruiken we 69 nL). Dompel de punt van de naald in de steekproef en trek je vloeistof monster in de naald met behulp van de instructies van de fabrikant. De vloeistof monster kan een dsRNA oplossing, bacteriële suspensie, of andere worden, de injectie proces is hetzelfde voor iedereen. Voeg een glazen petrischaal in het ijs emmer, zodat de bodem van de schaal is volledig contact met het ijs. Dit is waar je zal muggen totdat u klaar bent om ze te injecteren.
   
   
3. Bereid je muggen. Transfer 50-100 muggen uit het reservoir op het glas petrischaal. Gebruik je een tang om ze dun met een enkele laag, zorg ervoor dat de meeste contact hebben met de koude bodem van de schaal om ze onder narcose. Dekking van deze muggen met de schotel te dekken wanneer niet in gebruik. Ga terug het reservoir aan het ijs emmer te houden de rest van de muggen verdoofd.
   
   
4. Mount muggen op koude blok. Gebruik uw fijne punt een tang om muggen een overschrijving op een tijd van het gerecht om het glas schuiven gemonteerd op de koude blok onder de lichtmicroscoop. Ga voorzichtig met de muggen, bij voorkeur door de benen. Line-up maar liefst 30 muggen side-by-side op de dia en zorg ervoor dat je kunt om ieder een te komen met de microinjector en ervoor te zorgen elk contact maakt met de koude glijbaan. Zorg ervoor dat uw muggen zijn opgesteld ordelijk, zodat als je verder gaat weet je die en die niet zijn geïnjecteerd. Laat andere muggen behandeld in de gekoelde petrischaal.
   
   
5. Injecteer de eerste groep van muggen. Houd uw fijne punt getipt tang in de ene hand en houd de microinjector in de andere hand als een potlood. Gebruik de tang om de mug te verplaatsen als u nodig hebt (mee om te gaan door de benen om letsel te voorkomen) en om de mug stabiel als je injecteren. Dit werkt het beste als u de tang aan een kant van de mug te ondersteunen als je injecteren van de andere kant. Steek gewoon de naald in de thorax muggen. Het beste is om te injecteren in een strak toch dun deel uit van de nagelriem om letsel te minimaliseren. Vermijd ook het injecteren van te diep, je wilt gewoon de tip om zich binnen de thorax; diepere injecties leiden tot een grotere wonden die compromissen te overleven. Zodra de top van de naald in positie, drukt u op en laat het voetpedaal van de microinjector apparaat dat je vooraf ingesteld volume van dsRNA zal leveren. Wacht een seconde of twee en verwijder de naald uit de mug. Als een druppel vloeistof verschijnt buiten de wond, wacht een paar seconden om te kunnen worden opgenomen in de wond. Als het niet opnemen binnen een paar seconden, gooi die mug en probeer het opnieuw. Ga door met de injectie proces voor alle muggen op uw glasplaatje.
   
   
6. Bewaar uw muggen. Wanneer u klaar bent, uw geïnjecteerd muggen plek in gelabelde containers (onze voorkeur een pint was omzoomde kartonnen bekers gedekt doormesh netting en vastgezet met elastiekjes en een kartonnen deksel).
   
   
7. Ga door injecties totdat u klaar bent. Blijf muggen op de dia, injecteren en om kopjes totdat u de steekproefomvang die u wenst te dragen. Goed voor ongeveer doden-beginners zullen veel muggen sterven door het trauma van de injectie. Dit zal verbeteren met de praktijk tot bijna 100% van uw muggen overleven injectie.
   
   
8. Wanneer u klaar bent, plaats een gevouwen natte papieren handdoek over de beker, samen met een bron van voedsel en dekking van de cups met iets aan vocht, zoals plastic folie of een plastic Petri deksel behouden. Geïnjecteerd muggen zijn gevoelig voor uitdrogen, zodat het vocht door de natte handdoek en bewaard door het plastic zal helpen dit te voorkomen.
   
   
9. Plaats uw muggen op een milieuvriendelijke gecontroleerde kamer voor incubatie.

Let op: Efficiëntie van gene silencing is zeer variabel en afhankelijk van een aantal factoren, waaronder transcript en eiwit turn-over tarieven en dsRNA opname efficiency door cellen en organen. We hebben ontdekt dat zwijgen begint al een dag na de injectie, en kan duren tot 6 dagen na de injectie. Gebruik transcript en eiwit detectiemethoden zoals kwantitatieve PCR en Western blotting te zwijgen valideren.

Let op: Er zijn verschillende variaties op enkele stappen van de mug injectie en RNAi-gemedieerde gen-silencing-techniek. Sommige variaties worden beschreven door: Boisson, et al. (2006) en Blandin, et al. (2002)...

Discussion

Efficiëntie van gene silencing is zeer variabel en afhankelijk van een aantal factoren, waaronder transcript en eiwit turn-over tarieven en dsRNA opname efficiency door cellen en organen. We hebben ontdekt dat zwijgen zo vroeg een dag na de injectie begint en kan duren tot 6 dagen na de injectie. Gebruik transcript en eiwit detectiemethoden zoals kwantitatieve PCR en Western blotting te zwijgen valideren.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond Scientific	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos