Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Summary

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Abstract

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Protocol

RNAi mediada silenciamento de genes em mosquitos exige preparação prévia e purificação de dsRNAs específicos que visam o gene de interesse. Para a síntese de dsRNA, recomendamos o kit Megascript Ambion que faz uso de uma RNA polimerase T7 mediada por reação in vitro de transcrição. Para a purificação de dsRNA, recomendamos o kit Qiagen RNeasy. Amostras de dsRNA devem ser quantificados e ajustado a 3 mcg / mL em água. Outros materiais que você vai precisar incluir: com pontas finas pinças, lâmina de vidro, agulhas de vidro microcapilar, microinjetor (usamos Nanoject Drummond II), um microscópio de luz montada sobre um bloco de frio, uma coberta de vidro prato de Petri, toalhas de papel e um balde de gelo . Você também vai precisar de uma maneira de coletar mosquitos e recipiente adequado para eles, juntamente com uma fonte de alimento, tais como algodão embebido em sacarose 10%.

1. Recolher os seus mosquitos. Usando um aspirador movido a bateria, coletar os mosquitos que deseja injetar. Conecte o bico com uma toalha de papel ou algodão de forma que nenhum mosquito pode escapar e remover o reservatório. Uma vez que as temperaturas frias anestesiar os mosquitos, enterre o reservatório em um balde de gelo e esperar 5-10 minutos para os mosquitos parar de se mover. Anestesiados também pode ser feito colocando o reservatório em uma sala fria ou geladeira ou usando CO _2. Durante esses 5-10 minutos, continue para a próxima etapa.
   
   
2. Prepare sua área de trabalho. Definir um bloco de superfície plana fria a 2 ° C e coloque uma lâmina de vidro sobre ela. Este é o lugar onde os mosquitos vai descansar enquanto você injetá-las. Coloque uma agulha de vidro para o microinjetor e usar sua pinça para quebrar a ponta da agulha para a largura desejada. É importante que a largura é grande o suficiente para permitir espaço suficiente para líquido para fluir através de uma taxa razoável, mas é estreito o suficiente para causar uma ferida mínimos durante a injeção. A ponta da agulha bom será estreito o suficiente para dobrar um pouco, mas não quebrar. Definir o seu equipamento de injeção para o volume de saída desejada (por RNAi, usamos 69 nL). Submergir a ponta de sua agulha em sua amostra e desenhar a sua amostra de líquido para dentro da agulha usando as instruções do fabricante. A amostra de líquido pode ser uma solução dsRNA, suspensão bacteriana, ou outros, o processo de injeção é a mesma para todos. Incorporar uma placa de Petri de vidro no balde de gelo para que o fundo do prato está completamente em contato com o gelo. Isto é onde você irá colocar os mosquitos até que você esteja pronto para injetá-las.
   
   
3. Prepare o seu mosquitos. Transferir 50-100 mosquitos do reservatório para a placa de Petri de vidro. Use sua pinça para thin-los em uma única camada, certificando-se a maioria tem contato com o fundo frio do prato para mantê-los anestesiados. Cobrir esses mosquitos com o prato tampa quando não estiver em uso. Retorno do reservatório para o balde de gelo para manter o resto dos mosquitos anestesiados.
   
   
4. Monte mosquitos em bloco frio. Use sua pinça de ponta fina para transferir os mosquitos um de cada vez do prato para o slide de vidro montada no bloco frio sob o microscópio de luz. Lidar com os mosquitos delicadamente, de preferência pelas pernas. Line up até 30 mosquitos lado a lado no slide, certificando-se que você pode começar a cada um com o microinjetor e certificando-se cada um faz o contato com a lâmina fria. Verifique se o seu mosquitos estão alinhados em ordem, para que enquanto você vai longitudinalmente você sabe que tem e que não tenham sido injetado. Deixe outros mosquitos abordados na placa de Petri refrigeradas.
   
   
5. Injetar o seu primeiro grupo de mosquitos. Segure o de ponta fina pinça com ponta em uma mão e segurar o microinjetor no outro lado como um lápis. Use a pinça para mover o mosquito que você precisa (segurá-los pelas pernas para evitar a lesão) e para manter o mosquito firme como você injetar. Isso funciona melhor se você usar a pinça para apoiar um dos lados do mosquito como você injetar a partir do outro lado. Insira cuidadosamente apenas a ponta da agulha para tórax mosquito. O melhor é injetar uma parte tensa ainda fina da cutícula para minimizar o prejuízo. Além disso, evitar injetar muito profundamente, você quer apenas a ponta de estar dentro do tórax; injeções causa mais profunda feridas maior que irá comprometer a sobrevivência. Uma vez que a ponta da agulha está na posição, pressione e solte o pedal do aparelho microinjetor que vai entregar o seu volume pré-definido de dsRNA. Espere um ou dois segundos e retire a agulha do mosquito. Se uma gota de líquido aparece fora do local da ferida, aguarde alguns segundos para que possa ser absorvida na ferida. Se ele não absorve dentro de alguns segundos, descartamos o mosquito e tente novamente. Continuar o processo de injeção para todos os mosquitos em sua lâmina de vidro.
   
   
6. Armazenar seus mosquitos. Quando terminar, coloque o seu mosquitos injetados dentro de recipientes rotulados (nós preferimos um pint copos de cera revestido de papelão cobertos pormalha de redes e presa com tiras de borracha e uma tampa de papelão).
   
   
7. Continue injeções até terminar. Continue para colocar mosquitos no slide, injetar e transferência para copos até que você tenha o tamanho da amostra que você deseja. Responsáveis ​​por algumas mortes iniciantes terão muitos mosquitos morrem a partir do trauma da injeção. Isto irá melhorar com a prática até quase 100% do seu mosquitos sobrevivem injeção.
   
   
8. Quando terminar, coloque um dobrado, papel toalha molhada sobre o cálice, juntamente com uma fonte de alimento e cobrir os copos com algo a reter a umidade, tais como plástico ou uma tampa de plástico Petri. Mosquitos injetados são propensas a secar assim que a umidade fornecida pela toalha molhada e retido pelo plástico irá ajudar a evitar isso.
   
   
9. Coloque seu mosquitos em uma câmara de ambiente controlado para a incubação.

Nota: Eficiência de silenciamento do gene é altamente variável e depende de uma série de fatores, incluindo transcrição e proteínas turn-over, as taxas de absorção e eficiência dsRNA pelas células e órgãos. Descobrimos que o silenciamento começa tão cedo quanto uma injeção de pós dia, e pode durar até seis dias após a injecção. Utilização de métodos de detecção de transcrição e proteínas, tais como PCR quantitativo e Western blotting para validar silenciar.

Nota: Há diversas variações em várias etapas da injeção mosquito e RNAi mediada técnica de silenciamento gênico. Algumas variações são descritas por: Boisson, et al (2006) e Blandin, et al (2002)...

Discussion

Eficiência do silenciamento do gene é altamente variável e depende de uma série de fatores, incluindo transcrição e proteínas turn-over, as taxas de absorção e eficiência dsRNA pelas células e órgãos. Descobrimos que o silenciamento começa tão cedo quanto uma injeção de pós dia e pode durar até seis dias após a injecção. Utilização de métodos de detecção de transcrição e proteínas, tais como PCR quantitativo e Western blotting para validar silenciar.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond Scientific	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos