Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Summary

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

Abstract

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

Protocol

RNAi mediada por silenciamiento de los genes de los mosquitos requiere preparación previa y la purificación de dsRNAs específicas que se dirigen al gen de interés. Para la síntesis de dsRNA, se recomienda el kit Megascript Ambion que hace uso de un ARN polimerasa T7 mediada por reacción de transcripción in vitro. Para la purificación de dsRNA, se recomienda el kit Qiagen RNeasy. Las muestras de dsRNA deben cuantificarse y ajustado a 3 mg / l en el agua. Otros materiales que se necesitan son: de punta fina pinzas, portaobjetos de vidrio, agujas de vidrio microcapilar, microinyector (usamos Nanoject Drummond II), un microscopio de luz montado encima de un bloque frío, un plato de cristal cubierta de Petri, toallas de papel y un cubo de hielo . Usted también necesitará una manera de recoger los mosquitos y un contenedor adecuado para ellos, junto con una fuente de alimento, como algodón empapado en 10% de sacarosa.

1. Recoja sus mosquitos. Con un aspirador a pilas, reunir a los mosquitos que desee inyectar. Conecte la boquilla con una toalla de papel o de algodón, por lo que no puede escapar de los mosquitos y retirar el depósito. Dado que las temperaturas frías anestesiar a los mosquitos, enterrar el depósito en un cubo de hielo y espere 5-10 minutos para que los mosquitos dejen de moverse. Anestesia también se puede lograr mediante la colocación de la reserva en una habitación fría o en el refrigerador o mediante el uso de CO _2. Durante esos 5-10 minutos, continúe con el siguiente paso.
   
   
2. Prepare su área de trabajo. Establecer un bloque de superficie plana frío a 2 ° C y colocar una placa de vidrio sobre ella. Aquí es donde los mosquitos se apoyará a medida que se inyectan. Coloque una aguja de vidrio en el microinyector y el uso de su pinza para romper la punta de la aguja a la anchura deseada. Es importante que la anchura es lo suficientemente grande como para permitir suficiente espacio para que el líquido fluya a través a una velocidad razonable, pero es lo suficientemente estrecha como para infligir una herida mínima durante la inyección. Una punta de la aguja bien será lo suficientemente estrecha como para doblar un poco, pero no romperse. Configurar su equipo de inyección para el volumen de salida deseado (por RNAi, usamos 69 nL). Sumerja la punta de la aguja en la muestra y extraer la muestra de líquido en la aguja siguiendo las instrucciones del fabricante. La muestra de líquido puede ser una solución de dsRNA, la suspensión bacteriana, o de otro tipo, el proceso de inyección es el mismo para todos. Insertar un plato Petri de vidrio en el cubo de hielo para que el fondo de la fuente es totalmente en contacto con el hielo. Aquí es donde se va a poner los mosquitos hasta que esté listo para inyectar.
   
   
3. Prepare su mosquitos. 50-100 mosquitos desde el depósito hasta el plato Petri de vidrio. Use pinzas para su fina a una sola capa, asegurándose de que la mayoría tiene contacto con el fondo del plato frío para mantenerlos anestesiados. Cubrir estos mosquitos con el plato de tapa cuando no esté en uso. Devolver el depósito hasta el cubo de hielo para mantener el resto de los mosquitos anestesiados.
   
   
4. Monte los mosquitos en el bloque frío. Utilizar su pinza de punta fina para la transferencia de los mosquitos de uno en uno desde la antena a la placa de vidrio montado en el bloque frío bajo el microscopio de luz. Maneje con cuidado los mosquitos, preferentemente por las piernas. Se alinean hasta 30 mosquitos de lado a lado en la diapositiva, por lo que se puede llegar a cada uno de ellos con la microinyector y asegurarse de que cada uno hace contacto con la tapa fría. Asegúrese de que el mosquito se alinean ordenadamente a fin de que a medida que avanza usted sabe que tiene y que no han sido inyectada. Deja mosquitos tratadas en el frío plato de Petri.
   
   
5. Inyecte el primer grupo de los mosquitos. Mantenga la punta fina pinza de punta en una mano y sostener la microinyector en la otra mano como un lápiz. Use las pinzas para mover el mosquito como sea necesario (manejar por las patas para evitar lesiones) y para mantener constante el mosquito al inyectarse. Esto funciona mejor si se utiliza el fórceps para apoyar a un lado del mosquito que se inyecta desde el otro lado. Introduzca con cuidado sólo la punta de la aguja en el tórax del mosquito. Es mejor que se inyecte en una parte tensa aún delgada de la cutícula para minimizar las lesiones. También, evitar la inyección demasiado profunda; desea sólo la punta para estar dentro del tórax, más inyecciones de causa mayor heridas que pondrá en peligro la supervivencia. Una vez que la punta de la aguja está en posición, presione y suelte el pedal del aparato microinyector que entregará su pre-establecer el volumen de dsRNA. Espera un segundo o dos y retirar la aguja del mosquito. Si una gota de líquido aparece fuera del sitio de la herida, espere unos segundos para que sea absorbido en la herida. Si no se absorbe en pocos segundos, se descarta que los mosquitos y vuelva a intentarlo. Continuar con el proceso de inyección para todos los mosquitos en el portaobjetos de vidrio.
   
   
6. Guarde sus mosquitos. Cuando haya terminado, coloque los mosquitos inyectan dentro de los contenedores etiquetados (preferimos un litro forrado de cera vasos de cartón cubiertos porred de malla y se fija con bandas de goma y una tapa de cartón).
   
   
7. Continuar las inyecciones hasta que termine. Siga colocando los mosquitos en la diapositiva, inyección y transferencia de copas hasta que tenga el tamaño de la muestra que usted desea. Responsables de algunas muertes, los principiantes tienen muchos mosquitos mueren por el trauma de la inyección. Esto mejorará con la práctica hasta casi el 100% de su mosquitos sobreviven de la inyección.
   
   
8. Cuando termine, coloque una toalla doblada, papel mojado encima de la taza con una fuente de alimento y la tapa de la taza con algo para retener la humedad, como una envoltura de plástico o una tapa de plástico Petri. Mosquitos inyectan son propensos a la desecación por lo que la humedad proporcionada por la toalla mojada y retenido por el plástico ayudará a evitar esto.
   
   
9. Coloca el mosquito en una cámara de ambiente controlado para la incubación.

Nota: La eficiencia del silenciamiento génico es muy variable y depende de una serie de factores que incluyen la transcripción y las proteínas a su vez-sobre los tipos y la eficiencia dsRNA absorción por las células y órganos. Hemos encontrado que el silenciamiento se inicia tan pronto como un día después de la inyección y puede durar hasta 6 días después de la inyección. Utilizar métodos de transcripción y las proteínas de detección, como la PCR cuantitativa y Western Blot para validar el silenciamiento.

Nota: Hay varias variaciones en varias etapas de la inyección de mosquitos y RNAi mediada por la técnica de silenciamiento génico. Algunas variaciones son descritas por: Boisson, et al (2006) y Blandin, et al (2002)...

Discussion

La eficiencia del silenciamiento génico es muy variable y depende de una serie de factores que incluyen la transcripción y las proteínas a su vez-sobre los tipos y la eficiencia dsRNA absorción por las células y órganos. Hemos encontrado que el silenciamiento se inicia tan pronto como un día después de la inyección y puede durar hasta 6 días después de la inyección. Utilizar métodos de transcripción y las proteínas de detección, como la PCR cuantitativa y Western Blot para validar el silenciamiento.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond Scientific	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos