Summary
Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü Dimopoulos laboratuar tarafından dsRNA Anofel gambiae sivrisinekler, sıtma paraziti limanın içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. Enjeksiyon kurulum ve toraks içine enjekte dsRNA manipüle tekniği gösterilmiştir.
Abstract
Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü Dimopoulos laboratuar tarafından dsRNA Anofel gambiae sivrisinekler, sıtma paraziti limanın içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. Enjeksiyon kurulum ve toraks içine enjekte dsRNA manipüle tekniği gösterilmiştir.
Protocol
Sivrisinek RNAi-aracılı gen susturulması ilgi gen hedef belirli dsRNAs önceden hazırlanması ve arıtma gerektirir. DsRNA sentezi için, biz bir T7 RNA polimeraz aracılı in vitro transkripsiyon reaksiyonu kullanır Ambion Megascript kitini tavsiye ederiz . DsRNA arıtma için, biz Qiagen RNeasy kitini tavsiye ederiz. DsRNA, Örnekleri sayısal ve 3 mikrogram / mcL su ayarlanmış olmalıdır. Gereksinim duyacağınız diğer malzemeler şunlardır: ince uçlu forseps, cam Slayt, cam microcapillary iğneler, mikroenjektör (Drummond Kullanıcı Nanoject II kullanırız), soğuk bir blok, bir kapalı cam Petri çanak, kağıt havlu ve bir kova buz üstünde monte edilmiş bir ışık mikroskobu . Ayrıca% 10 sakaroz batırılmış pamuk gibi bir besin kaynağı ile birlikte sivrisinek ve onlar için uygun bir kap toplamak için bir yol gerekir.
- Sivrisinekler toplayın. Pilli bir aspiratör kullanılması, enjekte etmek istediğiniz sivrisinek toplamak. Bir kağıt havlu ya da pamuk sivrisinek yok rezervuar kaçış ve kaldırmak, böylece meme takın. Soğuk havalarda sivrisinek anestezisi bu yana, bir kova buz rezervuar gömmek ve hareket durdurmak için sivrisinekler için 5-10 dakika bekleyin. Anesthetization da soğuk bir oda ya da buzdolabında rezervuara koyarak ya da CO 2 kullanılarak elde edilebilir. Bu 5-10 dakika boyunca, bir sonraki adıma geçin.
- Çalışma alanınızı hazırlamak düz bir yüzeye soğuk blok 2 ° C ve üzerine bir bardak slayt yerleştirmek. Bu onlara enjekte olarak sivrisinek geri kalanı nerede. Mikroenjektör üzerine bir cam iğne takınız ve iğne ucu istenilen genişlikte kırmak için forseps kullanabilir. Genişliği için yeterli sıvı oda makul bir hızda akmasına izin verecek kadar büyük ama enjeksiyon sırasında en az bir yara indirebilmek kadar dar olduğunu önemlidir. İyi bir iğne ucu hafifçe bükülerek dar ama kırılmaz. Istenen çıkış hacmi (RNAi için, biz 69 nL) enjeksiyon ekipmanı ayarlayın. Batmak örnek içine iğne ucu ve iğne üreticinin talimatlarına kullanarak içine sıvı numune. DsRNA çözüm, bakteriyel süspansiyon, ya da diğer sıvı örnek olabilir; enjeksiyon işlemi herkes için aynıdır. Buz kovası bir cam Petri çanak çanak alt tamamen buz iletişime şekilde gömün. Enjekte etmek için hazır olana kadar sivrisinek koyacağız.
- Sivrisinek hazırlayın Transfer 50-100 sivrisinek rezervuar cam Petri kabı. Onları anestezi tutmak için çanak soğuk alt temas emin olun, bunları tek bir katmanda inceltmek için forseps kullanın. Kullanılmadığı zaman kapağı çanak bu sivrisinekler örtün. Sivrisinekler geri kalanı anestezi tutmak için buz kovası rezervuar dönün.
- Sivrisinekler soğuk blok üzerine monte edin. Sivrisinek bir çanak ışık mikroskobu altında, soğuk bir blok üzerine monte edilmiş cam slayt için bir anda transfer etmek için ince uçlu forseps kullanın. Tercihen bacaklar hafifçe vurur taşıyınız. Hat slaytta 30 olarak sivrisinek gibi birçok yan yana mikroenjektör her biri olsun ve her biri soğuk slayt ile temas edinceye emin olun emin olun. Sivrisinek gibi geçinmek ve enjekte henüz hangi biliyorum ki düzenli dizilmiş emin olun. Soğutulmuş Petri kabındaki kapsamındaki diğer sivrisinekler bırakın.
- İlk grup sivrisinek enjekte edilir. Bir elinde ince uçlu uçlu forseps tutun ve bir kalem gibi diğer yandan mikroenjektör tutun. Forseps sivrisinek taşımak için (bacaklar yaralanmayı önlemek için onları idare) ve sivrisinek enjekte olarak sabit tutmak için kullanın. Diğer taraftan enjekte olarak sivrisinek bir tarafı desteklemek için forseps kullanabilir Bu iyi çalışır. Sivrisineğin toraks içine dikkatlice sadece iğne ucu takın. Yaralanmaları en aza indirmek için manikür gergin ama ince bir parçası haline enjekte etmek en iyisidir. Ayrıca, çok derinden enjekte önlemek; toraks içinde sadece ucu istiyorum; derin enjeksiyonlar, hayatta kalma uzlaşma olacak büyük yaralar neden olur. İğnenin ucu konumda, basın ve dsRNA önceden ayarlanan ses getireceği mikroenjektör cihazların ayak pedalı bırakın. Bir veya iki saniye bekleyin ve sivrisinek iğneyi çıkarın. Sıvı yara sitesi dışında bir damla belirirse, bu yaranın içine absorbe edilmesi için birkaç saniye bekleyin. Birkaç saniye içinde absorbe değilse, o sivrisinek atmak ve tekrar deneyin. Cam slayt tüm sivrisinekler için enjeksiyon işlemi devam edin.
- Sivrisinekler Mağaza Bitirdiğinizde, etiketlenmiş, uygun kaplar içine enjekte sivrisinek (1 pint kapsadığı balmumu kaplı karton bardak tercihMesh) netleştirme ve lastik bantlar ve bir karton kapak ile güvenli.
- Tamamlanana kadar enjeksiyonlar devam edin. Slaytta sivrisinek yerleştirmek için devam edin ve sizin arzu örneklem büyüklüğü kadar enjekte bardak transfer . Hesap bazı ölümlerin yeni başlayanlar için çok sivrisinek enjeksiyon travma ölmektedir. Sivrisineklerin neredeyse% 100 enjeksiyon hayatta kadar bu uygulama ile artıracaktır.
- Tamamlandığında, bir gıda kaynağı ile birlikte, fincan katlanmış, ıslak kağıt havlu yerleştirin ve bardak, plastik ambalaj malzemesi ile veya, plastik bir Petri kapak gibi nemi korumak için bir şey kapsayacak. Enjekte sivrisinekler, ıslak havlu ve plastik tarafından tutulan nem bu önlemeye yardımcı olur, böylece kuruma eğilimli.
- Çevre kontrollü bir kuluçka odasında sivrisinek yerleştirin.
Not: Verimlilik gen susturulması son derece değişken ve hücreler ve organlar tarafından transkript ve protein ciro oranları ve dsRNA alımı verimliliği de dahil olmak üzere bir takım faktörlere bağlıdır. Biz susturulması, 1 gün sonrası enjeksiyon şeklinde gibi erken başlar bulduk ve 6 gün yazılan enjeksiyon kadar sürebilir. Susturulması doğrulamak için blot gibi kantitatif PCR ve Batı olarak transkript ve protein algılama yöntemleri kullanın.
Not: sivrisinek enjeksiyon ve RNAi aracılı gen susturma tekniği birkaç adım çeşitli varyasyonları vardır. Bazı varyasyonlar tarafından açıklanmıştır: Boisson ve ark (2006) ve Blandin ve ark (2002)...
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen susturma Verim çok değişkendir ve hücreler ve organlar tarafından transkript ve protein ciro oranları ve dsRNA alımı verimliliği de dahil olmak üzere bir takım faktörlere bağlıdır. Biz susturulması gibi erken 1 gün yazılan enjeksiyon başlar ve en fazla 6 gün enjeksiyonu sürebilir bulduk. Susturulması doğrulamak için blot gibi kantitatif PCR ve Batı olarak transkript ve protein algılama yöntemleri kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Megascript | kit | Ambion | for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction | |
| RNeasy | Qiagen | For dsRNA purification | ||
| dsRNA | should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water | |||
| fine-tipped forceps | ||||
| glass slide | ||||
| glass microcapillary needles | ||||
| microinjector | Drummond Scientific | Nanoject II | ||
| light microscope | mounted above a cold block | |||
| Petri dish | covered, glass | |||
| paper towels | ||||
| 10% sucrose | food | |||
| A. gambiae | Animal | mosquitos |
References
- Boisson,, et al. , (2006).
- Blandin,, et al. , (2002).
