Summary
यहाँ, हम अलगाव और murine फेफड़े endothelial कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस विधि मैकेनिक और enzymatic फेफड़े के ऊतकों पृथक्करण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक दो कदम शुद्धि विरोधी PECAM-1 और विरोधी ICAM-2 चुंबकीय मोती, जो एक शुद्ध मूल के ज्यादातर microvascular endothelial सेल की आबादी का उत्पादन संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रक्रिया शामिल हैं.
Protocol
1. विरोधी PECAM-1 एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों की तैयारी (Dynabeads)
- 50 मिलीलीटर पीबीएस में 50 मिलीग्राम BSA मिश्रण का उपयोग कर एक भंवर जब तक BSA घुल पीबीएस में 0.1% BSA तैयार करें. 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणुरहित. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
- टीसी हुड में, एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में अच्छी तरह से resuspended भेड़ विरोधी चूहा आईजीजी Dynabeads के 200 μl हस्तांतरण और मोती धो: MPC पर माउंट ट्यूब और तलछट के लिए मोतियों की अनुमति के बारे में 1 मिनट के लिए बैठते हैं. सतह पर तैरनेवाला Aspirate MPC से ट्यूब को हटाने और बाँझ 0.1% BSA / पीबीएस के 1 मिलीलीटर में मोती resuspend. पिपेट और नीचे मोती resuspend.
- दोहराएँ तीन गुना अधिक धो चार washes के एक कुल के लिए.
- MPC से ट्यूब निकालें और 0.1% / BSA पीबीएस के 500 μl में मोती resuspend.
- ट्यूब 10 μl चूहे विरोधी माउस PECAM-1 एंटीबॉडी (सीडी 31) जोड़ें.
- 4 ° C में रात भर ठंडा या कमरे के तापमान पर कमरे 2 बजे हुई.
- बाँझ 0.1% BSA / पीबीएस के साथ मोती के रूप में 1.2 चार बार कदम में वर्णित धो लें.
- MPC से ट्यूब निकालें और 200 μl 0.1% BSA / पीबीएस में मोती resuspend. 4 में स्टोर विरोधी-PECAM-1 एंटीबॉडी संयुग्मित Dynabeads ° सी 1 महीने के लिए.
2. नवजात चूहों से अलग माउस फेफड़े endothelial कोशिकाओं
ऊतक शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले, IACUC समिति अनुमोदन प्रक्रिया की आवश्यकता है.
- निम्न तैयार:
- 1 मिलीग्राम / एमएल DMEM समाधान में / सी और डी के 15 मिलीलीटर. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर और गर्म 37 के लिए सिरिंज के साथ फ़िल्टर डिग्री सेल्सियस
- 50 मिलीलीटर 15 मिलीलीटर DMEM, बर्फ पर दुकान के साथ शंक्वाकार ट्यूब
- अलगाव मीडिया (आईएम) के 20% FBS और 1x पेनिसिलिन / DMEM में स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त
- 2 जिलेटिन%. गोजातीय त्वचा के 2 जी के 100 मिलीलीटर dd पानी, आटोक्लेव 15 मिनट और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस के साथ जेलाटीन मिश्रण 37 तक गर्म डिग्री सेल्सियस कोटिंग टीसी बोतल से पहले दव्र बनाना करने के लिए.
- तीन 6-8 दिन पुरानी Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिग्रा / किग्रा) की एक आईपी इंजेक्शन का उपयोग पिल्ले anesthetize. संज्ञाहरण के प्रभाव के लिए जाँच करें और एक एक करके जानवरों को काटना, इस प्रकार है: बोर्ड के लिए पिन पिल्ले, 70% इथेनॉल के साथ त्वचा लेना और बाँझ विच्छेदन कैंची के साथ त्वचा को हटाने सीने में क्षेत्र से. आबकारी रिब पिंजरे फेफड़ों बेनकाब.
- Aseptically उत्पाद व्यक्तिगत फेफड़ों lobes, सावधान किया जा रहा काटना नहीं ब्रांकाई और फेफड़ों के आसपास किसी भी दृश्य संयोजी ऊतक. ठंडा DMEM में सभी फेफड़ों का मिश्रण. पिल्ले euthanize.
- टीसी हुड में कार्य, DMEM एक 100 मिमी टीसी पकवान में जगह फेफड़ों lobes से हटाने के लिए और अधिक DMEM aspirate.
- बाँझ कैंची का प्रयोग, ऊतक पतले कीमा ~ 100 बार काटने से. Enzymatic पाचन के लिए 15 मिलीलीटर गर्म समाधान / सी और डी के लिए स्थानांतरण. 37 ° C एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर 45 मिनट सेते हैं.
- टीसी हुड में, एक 20 मिलीलीटर सिरिंज में एक एकल कक्ष निलंबन में 14 ग्राम प्रवेशनी संलग्न और triturate clumps, कम से कम 12 बार के साथ पचा ऊतक निलंबन aspirate.
- एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से ऊतक निलंबन पास और 15 मिलीलीटर आईएम के साथ झरनी धोने के लिए पाचन रोक.
- 400x जी पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गोली सेल निलंबन.
- Aspirate सतह पर तैरनेवाला और 3 मिलीलीटर 0.1% BSA / पीबीएस में resuspend गोली.
- 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण और 22.5 μl विरोधी-PECAM-1 एंटीबॉडी संयुग्मित Dynabeads जोड़ें. 12 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हुई.
- 2 एमएल 2% जिलेटिन और aspirate अधिक जिलेटिन के साथ एक फ्लास्क T75 कोट. जिलेटिन चढ़ाना कोशिकाओं से पहले 30 मिनट के बारे में के लिए टीसी हुड के अंदर सूखे की अनुमति दें.
- मनका ऊष्मायन के बाद पूरा हो गया है (2.10 कदम), सेल निलंबन समान रूप से तीन Eppendorf ट्यूबों में और विभाजन MPC पर माउंट.
- जब मोती एमपीसी (~ 1 मिनट) का उपयोग sedimented है, सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा, MPC से ट्यूब को हटाने के साथ मोती धोने ~ 1 मिलीलीटर 0.1% / BSA Pbs, और तब MPC पर गोड़ा.
- चार बार (कुल 5 washes) धो दोहराएँ
- EnGS MV जीवन कारक किट और 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (वीएल) ट्यूब प्रति के साथ VascuLife के 1 मिलीलीटर में Resuspend मोती, अच्छी तरह से मिश्रण.
- एक पूर्व - लेपित T75 फ्लास्क पर प्लेट और वीएल के साथ 10 मिलीलीटर प्रत्येक फ्लास्क में कुल मात्रा लाने.
- मीडिया को अगले दिन बदलो, विकास के एक पूरा दिन की अनुमति है, और फिर हर दूसरे दिन मीडिया के आधा बदलने. जब कोशिकाओं> 70-80% मिला हुआ या अधिक (आमतौर पर संस्कृति के 3-4 दिनों के बाद) कर रहे हैं, वे विरोधी ICAM-2 Dynabeads के साथ हल किया जा सकता है.
3. तैयार विरोधी ICAM-2 एंटीबॉडी संयुग्मित Dynabeads
- विरोधी-ICAM-2 एंटीबॉडी संयुग्मित Dynabeads आगे कोशिकाओं है कि विरोधी PECAM-1 Dynabeads एंटीबॉडी संयुग्मित और मिला हुआ जब तक सभ्य के साथ चुना गया है शुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है. इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है के रूप में विरोधी PECAM-1 एंटीबॉडी संयुग्मित Dynabeads (1, इसके बाद के संस्करण) के लिए में वर्णित है कि विरोधी माउस ICAM-2 (CD-102) एंटीबॉडी विरोधी PECAM-1 एंटीबॉडी के बजाय प्रयोग किया जाता है को छोड़कर,.
- विरोधी-ICAM-2 एंटीबॉडी संयुग्मित Dynabeads 4 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस के लिए1 महीने के लिए.
4. विरोधी ICAM-2 Dynabeads साथ माउस फेफड़ों endothelial कोशिकाओं की छंटनी
- कोट 2% जिलेटिन के साथ T75 ऊतक संस्कृति कुप्पी.
- कोशिकाओं के साथ मिला हुआ T75 कुप्पी से मीडिया Aspirate और 8 मिलीलीटर पीबीएस से धो.
- Aspirate Pbs, 2 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA जोड़ सकते हैं और कोशिकाओं को अलग करने के बारे में 5 मिनट (). बोतल हल्के ठोकर detaching सहायता.
- जब कोशिकाओं को अलग किया है, 2 मिलीलीटर आईएम जोड़ने के लिए trypsin और परिमार्जन कोशिकाओं को बाधित करने के लिए किसी भी शेष पक्षपाती कोशिकाओं को अलग. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और 400x जी पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण
- 2 मिलीलीटर 0.1% BSA / पीबीएस में मीडिया और resuspend सेल गोली Aspirate.
- एक 5 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे ट्यूब पर स्थानांतरण और 10 μl Dynabeads विरोधी ICAM-2 जोड़ने. आरटी पर 12 मिनट के लिए हुई.
- MPC पर दो 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों और माउंट में सेल निलंबन भाजित.
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate बाद मोती एक मिनट के लिए पालन किया है. MPC से ट्यूबों निकालें और एक मिलीलीटर 0.1% BSA / पीबीएस में प्रत्येक ट्यूब resuspend. MPC पर रिमाउंट.
- चार बार (कुल 5 washes के) धो दोहराएँ.
- 1 मिलीलीटर VL के साथ प्रत्येक ट्यूब Resuspend और एक कोशिका गिनती प्रदर्शन.
- T25 फ्लास्क और / या 750K-1 T75 फ्लास्क प्रति मिलियन कोशिकाओं प्रति 250-350K कोशिकाओं पर प्लेट कोशिकाओं.
- T25 बोतल में 5 मिलीलीटर वीएल, और T75 बोतल में 10 मिलीलीटर मात्रा को लाओ.
- मीडिया हर दूसरे दिन बदलें. कक्ष प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है है जब संस्कृति के बारे में 80% आमतौर पर 2-3 दिन में confluency तक पहुँचता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
आमतौर पर, कक्षों की प्रारंभिक तैयारी से 6-7 दिनों के बाद, हम 1.2 के बारे में प्राप्त करने में सक्षम हैं - 1.5 x 10 6 तीन 6-8 दिन पुराने पिल्ले से फेफड़े endothelial कोशिकाओं. कक्ष प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत ठेठ "cobblestone" आकारिकी प्रदर्शन और दिखाने (CD144) सेल सेल जंक्शनों पर धुंधला VE-cadherin, जो endothelial कोशिकाओं (चित्रा 1) के लिए विशेषता है. MLECs व्यक्त VE cadherin और VEGFR2 के अधिकांश के रूप में FACS विश्लेषण (चित्रा 2) द्वारा प्रदर्शन किया. आमतौर पर, हम प्रयोगों के लिए प्रारंभिक MLEC अलगाव के बाद दो सप्ताह के भीतर उन का उपयोग करें.
चित्रा 1 मिला हुआ MLEC monolayer के सूक्ष्म विश्लेषण. (ए) लाइट माइक्रोस्कोपी छवि सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं के लिए विशिष्ट कोशिकाओं के cobblestone आकारिकी दिखाता है. वर्दी दौर कई कोशिकाओं के perinuclear क्षेत्र में स्थित संरचनाओं चुंबकीय MLEC अलगाव के लिए इस्तेमाल किया मोती हैं. (बी) Endothelial विशेष VE-cadherin सेल सेल के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर दिखाया जंक्शनों पर स्थानीयकृत है. बार 20μm की प्रतिनिधि है.
चित्रा 2 सुसंस्कृत endothelial विशिष्ट मार्करों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल MLECs की FACS विश्लेषण: (CD144) VE cadherin या VEGFR2, के रूप में दोषी पाया, phycoerythrin संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया, पृथक MLECs endothelial पहचान की पुष्टि. लाल रेखा निर्धारण विशिष्ट नियंत्रण इंगित करता है, हरे रंग की लाइन से पता चलता है विरोधी VE-cadherin या विरोधी VEGFR2 - विशिष्ट आईजीजी.
Discussion
Microvascular ईसीएस नाड़ी जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में एक उपयोगी मॉडल होना सिद्ध कर दिया है और कर रहे हैं और physiologically अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से अध्ययन HUVECs 3 से प्रासंगिक (जैसे angiogenesis) माना जा रहा है. इससे पहले, यह बताया गया है कि microvascular ईसीएस गुर्दे, हृदय, त्वचा, रेटिना, मस्तिष्क, gliomas, वसा ऊतकों और भी फेफड़ों 2, 4-7, 10, 11 से प्राप्त किया जा सकता है . हालांकि, microvascular ईसीएस के अलगाव के लिए एक सुसंगत और विश्वसनीय विधि अभी भी आवश्यक है. यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया पहले प्रकाशित 2 प्रोटोकॉल के एक संशोधन है, यह सबसे प्रकाशित प्रक्रियाओं में है कि यह वयस्क पशुओं के बजाय पिल्ले का उपयोग करता है से अलग है. यह अलगाव की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में युवा पशुओं से कोशिकाओं एक उच्च प्रसार की क्षमता है और संस्कृतियों के लिए उनके ऊतकों से निकाली गई कोशिकाओं की उच्च संख्या उपज होते हैं. एक सप्ताह पुराने जानवरों के लिए इष्टतम होने लगते हैं, लेकिन युवा चूहों (4 दिन पुरानी) भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, पिल्ले के अधिक या कम संख्या में इस्तेमाल किया जा यदि आवश्यक हो सकता है, के रूप में हम एक पिल्ला से अलग MLECs में सफल रहा है. हालांकि, जबकि ऊपर स्केलिंग या अलगाव की प्रक्रिया नीचे, सेल चढ़ाना घनत्व अपरिवर्तित ही रहेंगे, क्योंकि यह भी सेल प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है चाहिए. दो कदम चुंबकीय संयुग्मित मनकों का उपयोग विरोधी PECAM-1 के लिए पहली बार MLECs और विरोधी ICAM-2 एंटीबॉडी से शुद्धिकरण की प्रक्रिया पहले से वर्णित एक कदम शुद्धीकरण प्रक्रियाओं की तुलना में शुद्ध चुनाव आयोग संस्कृतियों प्राप्त करने में अधिक कुशल है. इस प्रोटोकॉल बहुत श्रमसाध्य पुस्तिका तकनीक, ढाल centrifugation और कम कुशल fibroblasts, रक्त कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं जैसे discarding contaminating कोशिकाओं के लिए छँटाई FACS का उपयोग करने की आवश्यकता eliminates. परिणामस्वरूप MLEC जनसंख्या angiogenic प्रतिक्रियाओं, संवहनी पारगम्यता और ल्युकोसैट स्थानांतरगमन की इन विट्रो विश्लेषण में, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संकेत दे रास्ते के जैव रासायनिक विश्लेषण चिकित्सा घाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि आवश्यक हो, MLECs immunofluorescence या पार endothelial प्रतिरोध माप (TER) के लिए इलेक्ट्रोड arrays के लिए fibronectin या जिलेटिन लेपित coverslips जैसे विभिन्न सतहों पर चढ़ाया जा सकता है. प्राप्त परिणामों सीधे vivo में है, जो पीटा और ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की बढ़ती संख्या के संदर्भ में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है में मनाया phenotypes की तुलना में किया जा सकता है . सेलुलर vivo में मनाया दोष अंतर्निहित तंत्र की इन विट्रो विश्लेषण में के लिए इस पद्धति के सफल कार्यान्वयन, पहले से ही 12 प्रस्तुत किया गया है .
Disclosures
जानवरों पर प्रयोग प्रोटोकॉल AUA # 00001206 के तहत विस्कॉन्सिन IACUC समिति के मेडिकल कॉलेज द्वारा उल्लिखित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस शोध में भाग अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 0950118G.to एम सी डब्ल्यू द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
References
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