Summary
ここで、我々は、マウス肺内皮細胞の単離と培養のためのプロトコルについて説明します。このメソッドは、メカニックと酵素肺組織の解離と同様に抗PECAM - 1とほとんどが微小血管起源の純粋な内皮細胞集団を生成する磁気ビーズへの結合抗ICAM - 2抗体を用いた2ステップ精製プロセスを含む。
Abstract
内皮細胞は血管生物学の多くの分野で有用な研究モデルを提供しています。その最初の単離1日以来、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を入手し、文化に容易、便利であることが示され、したがって、最も広く研究されている内皮細胞であるしている。しかし、血管新生、透過性や他の多くのようなプロセスに焦点を当てた研究のために、微小血管内皮細胞（ECS）は、2を勉強するより生理学的に妥当なモデルです。さらに、ノックアウトマウスから単離されたECは、タンパク質の機能のex vivoでの解析のための有用なツールを提供しています。微小血管は異なる起源のEC分離と文化にいくつかのアプローチが3-7をこれまでに報告したが、純粋なECの一貫性のある分離および培養は、まだ多くの研究室の主要な技術的な問題です。れましたここで、我々は、単離および培養マウス肺内皮細胞（MLECs）の信頼性と比較的簡単な方法をステップバイステップのプロトコルを提供しています。このアプローチでは、6から得られた肺組織 - 8日齢の仔には、最初のコラゲナーゼ/ディスパーゼ（C / D）ソリューションで消化し、単一細胞懸濁液に機械的に分散し、小片に切断される。 MLECSは、磁性粒子のコンセントレータ（MPC）を使用してダイナビーズに結合した抗PECAM - 1抗体を用いてポジティブセレクションを使用して細胞懸濁液から精製されています。彼らがコンフルエントになるまで、そのような精製された細胞は、ゼラチンコート組織培養（TC）皿上で培養されています。その時点で、細胞はさらに抗ICAM - 2抗体に結合ダイナビーズを用いて精製されています。このプロトコルで得られたMLECsは、石畳の表現型を示す位相差光学顕微鏡などによって可視化、およびそれらの内皮表現型は、抗VE -カドヘリン8および抗VEGFR2 9抗体およびVE -カドヘリンの免疫蛍光染色とFACS分析を使用して確認されている。私たちの手で、この二段階の分離手順は、一貫性と信頼性をさらに培養することができるMLECs、の純粋な集団が得られます。このメソッドは、研究者が直接in vivoで観察された血管の表現型の分子機構を明らかにするために役立つため、孤立したMLECs上で実行し、in vitroでの実験の結果をin vivo試験で相関するノックアウトおよびトランスジェニックマウスの成長数の利点を受けることができるようになる。
Protocol
1。抗PECAM - 1抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads）を準備
- BSAが溶解するまでボルテックスを使用して50 mlのPBSで50mgのBSAを混合することにより、PBS中0.1％のBSAを準備します。 0.22μmのシリンジフィルターを通して濾過することにより滅菌する。 4℃で保存します。
- TCのフードでは、1.5mlのエッペンドルフチューブに加え再懸濁し、ヒツジ抗ラットIgGのダイナビーズの200μlを転送し、ビーズを洗浄：マウントチューブをMPCにし、堆積物にビーズを可能にするために約1分間放置します。上清を吸引し、MPCからチューブを取り出して、無菌の0.1％BSA / PBSを1 mlでビーズを再懸濁します。ビーズを再懸濁するために上下にピペッティングし。
- four洗浄の合計のために、さらに3回洗浄繰り返します。
- MPCからチューブを外し、0.1％BSA / PBS500μlにビーズを懸濁します。
- チューブに10μlのラット抗マウスPECAM - 1（CD - 31）抗体を追加。
- 室温で低温室または2時間で4℃で一晩タンブル。
- としてステップ1.2の4倍をで説明されている無菌の0.1％BSA / PBSでビーズを洗浄する。
- MPCからチューブを外し、200μlの0.1％BSA / PBS中でビーズを再懸濁します。ストア抗PECAM - 1抗体コンジュゲート4のダイナビーズ·最大1ヶ月のためのC。
2。新生仔マウスから分離するマウス肺内皮細胞
組織の精製プロトコールに進む前に、手順のIACUC委員の承認が必要です。
- 以下を準備します。
- DMEMで1 mg / mlのC / D溶液15ml。 37にフィルタと暖かい0.22μmのシリンジとフィルター℃に
- 15ミリリットルDMEM、氷の上に店舗を持つ50 mlコニカルチューブ
- DMEM 20％FBSおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを含む分離メディア（IM）
- ゼラチン2％。 4で100ミリリットルのdd水とゼラチンウシ皮膚2gの、オートクレーブで15分、ストアを混ぜる℃に37℃くらいまで温めコーティングTCフラスコの前に液化する。
- ケタミン（100 mg / kg体重）及びキシラジン（10 mg / kg）のIP注射を使用して、3つの六から八日目の子犬を麻酔。一つずつを麻酔の有効性をチェックし、動物を解剖し、次のように：ピンの子犬をボードに、70％エタノールで皮膚を浸して滅菌解剖鋏で胸の部分から皮膚を取り除く。肺を公開する物品胸郭。
- 無菌的に物品の個々の肺葉、気管支及び肺の周辺で目に見える結合組織を分析しないように注意してください。氷冷DMEMで全肺を組み合わせる。子犬を安楽死させる。
- TCのフードでの作業、DMEM、100ミリメートルTC皿の場所から肺の葉を取り除き、過剰なDMEMを吸引除去する。
- 滅菌済みのハサミを使用して、〜100倍をカットして細かく組織をミンチ。酵素消化のために15ミリリットル暖かいC / Dソリューションに転送する。ローテーターで37℃で45分間インキュベートする。
- TCのフードでは、単一の細胞懸濁液中に14グラムカニューレ接続されていると粉薬塊を20 mlの注射器の中に少なくとも12回を消化した組織懸濁液を吸引除去する。
- 70μmのセルストレーナーを通して組織懸濁液を渡すと消化を停止するには、15ミリリットルのIMとストレーナーを洗浄。
- 5分間400 × gで遠心分離によってペレットの細胞懸濁液。
- 3ミリリットル0.1％BSA / PBSで上清を吸引し、ペレットを再懸濁します。
- 5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに細胞懸濁液を移し、22.5μlの抗PECAM - 1抗体コンジュゲートのDynabeadsを加える。 12分間室温でタンブル。
- ゼラチン2 mLの2％ゼラチンおよび吸引過剰とT75フラスココート。プレーティング前の細胞に約30分間、TCのフードの内側に乾燥するためにゼラチンを許可。
- ビーズインキュベーションが完了したら（ステップ2.10）、三エッペンドルフチューブにも同様に細胞懸濁液を分割し、MPCをマウントします。
- ビーズは、MPCを（〜1分）を使用して沈殿したら、上清を収集、MPC上で再マウントして〜1 mlの0.1％BSA / PBSでビーズを洗浄、MPCからチューブを取り外し、と。
- 4回（合計5回洗浄を）洗う繰り返す
- よく混合したチューブあたりEnGS - MV生活要因キットおよび1xペニシリン/ストレプトマイシン（VL）とVascuLife 1ml中に再懸濁しビーズ、。
- プレコートT75フラスコ上プレートとVLで10mlに各フラスコの総容積をもたらす。
- 翌日のメディアを変更する、成長の1つの完全な一日を可能にし、一日おきに培地の半分を変更する。細胞が> 70から80コンフルエント％以上（通常、文化の3〜4日後）である場合、それらは抗ICAM - 2ダイナビーズを並べ替えることができます。
3。抗ICAM - 2抗体コンジュゲートのDynabeadsの準備
- 抗ICAM - 2抗体結合ダイナビーズはさらにコンフルエントになるまで抗PECAM - 1のDynabeads抗体結合し、培養で選択されている細胞を精製するために使用されています。この手順は、これは抗マウスICAM - 2（CD - 102）抗体、抗PECAM - 1抗体の代わりに使用されている場合を除き、抗PECAM - 1抗体結合ダイナビーズ（1、上記）で説明したように実行されます。
- 抗ICAM - 2抗体結合ダイナビーズは、最大で4℃で保存することができます1ヶ月まで。
4。抗ICAM - 2ダイナビーズとマウス肺内皮細胞のソート
- ゼラチン2％のコートT75組織培養フラスコ。
- 細胞をコンフルエントT75フラスコから培地を吸引除去し、8 mlのPBSで洗浄する。
- 吸引PBSは、2 mlの0.05％トリプシン/ EDTAを加えると（約5分）細胞がデタッチできます。切り離しを支援するために軽くフラスコをタップします。
- 細胞がはがれるしたら、残りの接着細胞を分離するためにトリプシンとこすり細胞を抑制するために2mlのIMを追加。 15 mlのチューブに細胞懸濁液を移し、400 × gで5分間スピンダウン
- 2ミリリットル0.1％BSA / PBS中でメディアを再懸濁します細胞ペレットを吸引除去する。
- 5 mlのポリスチレン丸底チューブに移し、10μlの抗- ICAM - 2のDynabeadsを加える。室温で12分間タンブル。
- MPCの2つの1.5mlエッペンドルフチューブとマウントに細胞懸濁液を分割する。
- ビーズを1分間付着した後に上清を吸引除去する。 MPCからチューブを外し、1 mlの0.1％BSA / PBSで各チューブを再懸濁します。 MPCで再マウント。
- 4回（5回洗浄の合計）洗い繰り返します。
- 1 mlのVLで各チューブを再懸濁し、細胞数を実行する。
- T25フラスコおよび/またはT75フラスコあたり750K - 1万個の細胞あたり250 - 350Kの細胞で細胞をプレート。
- T25フラスコに5 mlのVL、およびT75フラスコで10mlに容積をもたらす。
- 一日おきにメディアを変更します。文化は通常2〜3日で、約80％コンフルエントに達したときに細胞が実験に使用することができます。
5。代表的な結果
一般的に、細胞の初期準備から6-7日後に、我々は、約1.2取得 することができます- 3 6〜8日齢の仔から1.5 × 10 6肺内皮細胞は。細胞は光学顕微鏡下で典型的な"敷石"形態を表示し、内皮細胞（図1）の特性であるVE -カドヘリン（CD144）細胞間の接合部において染色を、示す。 FACS分析（図2）により実証されるようにMLECsエクスプレスVE -カドヘリンおよびVEGFR2の大半。通常、我々は最初のMLEC分離後二週間以内に実験のためにそれらを使用してください。
図1。コンフルエントMLECの単層の顕微鏡分析。 （A）光学顕微鏡の画像は、内皮細胞の典型的な培養細胞の石畳の形態を示しています。多くの細胞の核周辺部に位置して均一な円形構造物は、MLEC分離のために使用される磁気ビーズです。 （B）血管内皮特異的VE -カドヘリンは、共焦点顕微鏡を用いて示される細胞間の接合部に局在している。バーは、20μmの代表です。
図2血管内皮に特異的なマーカーに特異的な抗体で標識された培養MLECsのFACS分析：。フィコエリスリン標識二次抗体が続くVE -カドヘリン（CD144）またはVEGFR2、として起訴、、孤立MLECsの内皮IDを確認する。特定の抗IgG - 赤のラインがアイソタイプの特定のコントロールを示し、緑の線は、抗VE -カドヘリンまたは抗VEGFR2を示している。
Discussion
微小血管内皮は、血管生物学の多くの分野で有用なモデルであることが証明されていると、より生理的に広く研究されているHUVECを3以上（例えば、血管新生）勉強に関連すると考えられている。以前に、それは微小血管内皮は腎臓、心臓、皮膚、網膜、脳、神経膠腫、脂肪組織や、肺2、4-7、10、11から得られることが報告されている。しかし、微小血管内皮単離するための一貫性と信頼性の高い方法が依然として必要です。ここに示す手順は、以前に発行されたプロトコルバージョン2の変形例であり、それは子犬ではなく、成熟した動物を使用する点で最も公開された手順とは異なります。若い動物からの細胞は高い増殖能を持ち、彼らの組織由来の培養は、細胞数の増加をもたらす傾向があるので、これはアイソレーションを成功させるために重要です。一週間古い動物が最適であると思われるが、より若いマウス（4日齢）を使用することもできます。私達は1つの子犬からMLECsを単離することに成功しているとしても、仔の上位または下位の数値は、必要に応じて使用することができます。しかし、分離のプロセスをスケールアップまたはダウンしながら、細胞の播種密度は、これがまた、細胞増殖に重要であるとして、変更されないままにしておく必要があります。 2ステップ精製抗PECAM - 1に結合した第一磁気ビーズを使用してMLECsの過程と抗ICAM - 2抗体よりは、前述のシングルステップ精製法よりも純粋なECの文化を得ることをはるかに効率的です。このプロトコルは、非常に手間のかかる手動のテクニック、勾配遠心分離し、繊維芽細胞、血液細胞と平滑筋細胞などの廃棄汚染セルの並べ替えを少なく効率的なFACSを使用する必要がなくなります。結果MLEC人口は血管新生反応、血管透過性及び白血球遊出のin vitroでの解析で 、癒しだけでなく、シグナル伝達経路の生化学的解析を巻かに使用することができます。必要に応じて、MLECsはそのようなトランス内皮抵抗（TER）測定のための免疫蛍光または電極アレイ用のフィブロネクチンまたはゼラチンコートしたカバースリップのような別の表面にめっきすることができる。得られた結果を直接ノックアウトおよびトランスジェニックマウス系統の増加のコンテキスト内で特に重要な生体内で観察された表現型、比較することができます。 in vivoで観察された欠陥の基礎となる細胞メカニズムのin vitroでの解析では、このメソッドの実装を成功させるには、すでに12を提示されている。
Disclosures
動物実験はプロトコルAUA＃00001206下ウィスコンシンIACUC委員会の医科大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
Acknowledgments
この研究は米国心臓協会の助成金0950118G.to MC - Wによって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
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