Summary
Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.
Abstract
Endotel hücreleri, damar biyoloji birçok alanda yararlı bir araştırma modeli sağlar. Ilk izolasyon 1 yılından bu yana, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVECs) en çok araştırılan endotel hücreleri, böylece kolay elde etmek ve kültürüne uygun görüldüğü gibi, ve. Ancak, anjiyogenez, geçirgenlik ya da diğerleri gibi süreçler üzerinde odaklanan araştırma, mikrovasküler endotel hücreleri (EC) 2. çalışma çok daha önemli fizyolojik model . Ayrıca, nakavt fareler izole edilen EC protein fonksiyon ex vivo analizi için yararlı bir araç sağlar . Çeşitli yaklaşımlar izole etmek ve kültür mikrovasküler farklı kökenli EC tarihten 3-7 bildirilen, ancak saf EC tutarlı izolasyonu ve kültürü hala birçok laboratuvarda büyük bir teknik sorun var. Burada, biz bir adım-adım protokol yalıtma ve kültür fare akciğer endotel hücreleri (MLECs) güvenilir ve nispeten basit bir yöntem sağlar. Bu yaklaşımda, akciğer dokusu 6 elde edilen 8 gün eski yavrular ilk kollajenaz / dispase (C / D) çözümü ile sindirilmiş, parçalar halinde kesilir ve tek hücre süspansiyonu içine mekanik dağınık. MLECS Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı (PPK) kullanarak Dynabeads konjuge anti-PECAM-1 antikoru ile pozitif seçim kullanarak hücre süspansiyonu arınmış. Konfluent olana kadar saflaştırılmış Böyle hücreleri (TC) yemekleri, jelatin kaplı doku kültürü kültüre. Bu noktada, hücrelerin daha fazla anti-ICAM-2 antikoru ile birleştiğinde Dynabeads kullanarak saflaştırılmış. Bu protokol ile elde MLECs bir arnavut kaldırımlı fenotip, sergi, faz-kontrast ışık mikroskobu olarak görünür ve kendi endotel fenotipi anti-VE-kaderin 8 ve anti-VEGFR2 9 antikorlar ve immunofluorescent VE kaderin boyama FACS analizi kullanılarak teyit edilmiştir. Bizim ellerde, bu iki adımlı bir izolasyon prosedürü, tutarlı ve güvenilir MLECs saf bir nüfus, daha kültürlü olabilir verir. Bu yöntem, araştırmacılar, eleme ve izole MLECs üzerinde gerçekleştirilen in vitro deneylerde sonuçları in vivo çalışmalar doğrudan ilişkilendirmek için transgenik fareler sayıları giderek artan yararlanmak ve bu nedenle in vivo gözlenen vasküler fenotipleri moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardım sağlayacaktır.
Protocol
1. , Anti-PECAM-1 antikor konjuge manyetik boncuk hazırlanması (Dynabeads)
- PBS içinde% 0,1 BSA BSA eriyene kadar bir vorteks kullanarak 50 ml PBS içinde 50 mg BSA karıştırma hazırlayın. 0.22 mikron şırınga filtre ile filtreleme ile sterilize edin. 4 ° C saklayınız
- TC kaput, 1.5 ml Eppendorf tüp içine yeniden süspanse koyun anti-fare IgG Dynabeads 200 ul transferi ve boncuklar yıkamak: Dağı tüp MPC ve tortu boncuk izin vermek için yaklaşık 1 dakika bekletin. Süpernatant aspire, MPC tüp kaldırmak ve 1 ml steril% 0,1 BSA / PBS boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. Boncuklar tekrar süspansiyon pipet ve aşağı yukarı.
- Toplam dört yıkama, yıkama üç kez daha tekrarlayın.
- MPC'den tüpünü çıkarın ve% 0,1 BSA / PBS 500 ul boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin.
- Tüpüne 10 ul sıçan anti-fare PECAM-1 (CD-31) antikor ekleyin.
- Soğuk oda veya oda sıcaklığında 2 saat 4 ° C'de gece Tumble.
- Adım 1.2 dört kez açıklandığı gibi steril% 0,1 BSA / PBS ile boncuk yıkayın.
- MPC'den tüpünü çıkarın ve 200 ul% 0,1 BSA / PBS boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. Mağaza, anti-PECAM-1 antikor konjuge Dynabeads 4 ° C 1 aya kadar.
2. Yenidoğan farelerin Yalıtımlı fare pulmoner endotel hücreleri
Doku arıtma protokol geçmeden önce, işlemin IACUC Komitesi onayı gereklidir.
- Aşağıdakileri hazırlayın:
- DMEM 1 mg / ml 'C / D çözümü, 15 ml. 37 filtre ve sıcak 0.22 mikron şırınga ile Filtre ° C
- 50 ml konik tüp 15 ml DMEM, buz üzerinde mağaza ile
- DMEM% 20 FBS ve 1x penisilin / streptomisin içeren İzolasyon Media (IM)
- Jelatin 2%. 100 ml, 4 gg su, otoklav 15 dakika ve mağaza ° C 2 g sığır cilt jelatin karıştırın Sıcak - 37 ° C kaplama TC şişeler önce sıvılaştığını.
- Ketamin (100 mg / kg) ve xylazine (10 mg / kg) bir IP enjeksiyon kullanarak üç 6-8 günlük yavrular anestezisi. Aşağıdaki gibi anestezi etkinliğini kontrol edin ve hayvanların tek tek teşrih: kuruluna Pin yavrular, steril diseksiyon makas ile göğüs bölgesinde cilt,% 70 Etanol ile deri emmek ve kaldırmak. Akciğerler maruz Vergi göğüs kafesi.
- Aseptik tüketim bireysel akciğer lobları, dikkatli olmak, bronşlar ve akciğerlerin etrafında görünür bir bağ dokusu incelemek. Buz DMEM tüm akciğerler birleştirin. Yavrular Euthanize.
- TC kaput, 100 mm TC çanak yer DMEM akciğer lobları kaldırmak ve aşırı DMEM aspire.
- Steril makas kullanarak, ~ 100 kere keserek ince doku kıyma. Enzimatik sindirim için 15 ml sıcak C / D çözümü transfer. Rotator 37 ° C'de 45 dakika inkübe edin.
- TC kaput, tek bir hücre süspansiyonu içine 14 gr kanül bağlı ve çiğnemek kümeleri, en az 12 kere, 20 ml şırınganın içine sindirilmiş doku süspansiyon aspire.
- 70 mikron hücre süzgecinden doku süspansiyonu Pass ve süzgeç sindirim durdurmak için 15 ml IM ile yıkayın.
- Pelet 400x g de 5 dakika santrifüj hücre süspansiyonu.
- 3 ml% 0,1 BSA / PBS aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet.
- Hücre süspansiyonu 5 ml yuvarlak alt polistiren tüp transferi ve 22.5 ul anti-PECAM-1 antikor konjuge Dynabeads ekleyin. 12 dakika oda sıcaklığında Tumble.
- Kat 2 ml% 2 jelatin ve aspirat fazla jelatin ile T75 şişesi. TC kaput kaplama öncesi hücreleri yaklaşık 30 dakika içinde kuru jelatin izin ver.
- (Adım 2.10), boncuk inkübasyon tamamlandıktan sonra üç Eppendorf tüpleri içine eşit hücre süspansiyonu bölünmüş ve MPC monte.
- Boncuklar, MPC (~ 1 dak.) Kullanarak tortulaşmış olduğunda, supernatant toplamak MPC'den tüp kaldırmak, boncuk yıkayın ~ 1 ml% 0,1 BSA / PBS, MPC ve sonra yeniden bağlayın.
- Dört kez (toplam 5 yıkar) yıkamak tekrarlayın.
- VascuLife 1 ml EnGS-Mv Yaşam Faktörler Kit ve tüp başına 1x penisilin / streptomisin (VL) ile yeniden süspanse boncuk, iyi karıştırma.
- Bir ön-T75 balon kaplı Plaka ve her bir cam şişe içinde toplam hacim 10 ml VL getirmek.
- Büyüme, 1 tam gün izin medya ertesi gün değiştirin ve sonra her gün medyanın yarısını değiştirmek. Hücreleri (genellikle 3-4 gün sonra kültür)>% 70-80 konfluent veya daha fazla zaman, anti-ICAM-2 Dynabeads sıralanabilir.
3. Hazırlanması, anti-ICAM-2 antikor konjuge Dynabeads
- Anti-ICAM-2 antikor konjuge Dynabeads konfluent kadar anti-PECAM-1 Dynabeads antikor konjuge ve kültür ile seçilmiş olan hücreler daha fazla saflaştırmak için kullanılır. Bu prosedür, bu anti-fare ICAM-2 (CD-102) antikor, anti-PECAM-1 antikor yerine kullanılır dışında, anti-PECAM-1 antikor konjuge Dynabeads (1, yukarıda) anlatıldığı gibi yapılır.
- Anti-ICAM-2 antikor konjuge Dynabeads ° C için 4 saklanabilir1 aya kadar.
4. Anti-ICAM-2 Dynabeads Fare Akciğer Endotel Hücreleri Sıralama
- % 2 jelatin ile Coat T75 doku kültürü şişesi.
- Hücreleri ile balon konfluent T75 medya aspire ve 8 ml PBS ile yıkayın.
- Aspire PBS, 2 ml% 0.05 tripsin / EDTA (yaklaşık 5 dakika) hücreleri ayırmak. Ayrılmakta yardım şişeler hafifçe dokunun.
- Hücreleri müstakil, tripsin ve kazıma hücrelerini inhibe kalan yapışık hücreleri ayırmak için 2 ml IM ekleyin. 15 ml tüp Transfer hücre süspansiyonu ve 400x g. az 5 dakika aşağı doğru döndürün
- 2 ml% 0,1 BSA / PBS medya ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire edin.
- 5 ml polistiren yuvarlak alt tüp transferi ve 10 ul anti-ICAM-2 Dynabeads ekleyin. RT 12 dakika Tumble.
- MPC üzerinde iki adet 1,5 ml Eppendorf tüpleri ve montaj Split hücre süspansiyonu.
- Boncuklar bir dakika süreyle uyulması sonra süpernatant aspire edin. MPC'den tüpler çıkarın ve 1 ml% 0,1 BSA / PBS her tüp tekrar süspansiyon haline getirin. PPK üzerinde tekrar bağlayın.
- Dört kez (toplam 5 yıkar) yıkayın tekrarlayın.
- Her tüpe 1 ml VL ile yeniden süspanse edin ve bir hücre sayımı gerçekleştirmek.
- , T25, termos ve / veya T75 şişesi ortalama 750 bin-1 milyon hücre başına 250-350K hücreleri Plaka hücreleri.
- T25 şişelerde 5 ml, VL ve T75 şişeler 10 ml hacim kazandırın.
- Her gün medya değiştirin. Kültür genellikle 2-3 gün, yaklaşık 80% confluency ulaştığında Hücreler deneyler için kullanılabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Tipik olarak, 6-7 gün sonra hücrelerin ilk hazırlık, yaklaşık 1,2 elde edebilmek üç 6-8 gün eski yavrular 1.5 x 10 6 pulmoner endotel hücreleri. Hücreler ışık mikroskobu altında tipik "arnavut kaldırımı" morfolojisi ekran ve endotel hücreleri (Şekil 1) için karakteristik olan VE-cadherin (CD144) hücre-hücre kavşaklarda boyama, göstermek. MLECs ifade VE cadherin ve VEGFR2 çoğunluğu FACS analizi (Şekil 2) göstermiştir. Genellikle, ilk MLEC izolasyon sonra iki hafta içinde deneyler için bunları kullanmak.
Şekil 1 konfluent MLEC tek tabaka mikroskobik analizi. (A) Işık mikroskobu görüntü endotel hücreleri için tipik kültür hücrelerinin arnavut kaldırımlı morfolojisi gösterir. Birçok hücre perinükleer alanda bulunan Tekdüzen yuvarlak yapılar MLEC izolasyonu için kullanılan manyetik boncuk. (B) Endotel özel VE-kaderin konfokal mikroskobi kullanarak gösterildiği gibi hücre-hücre kavşaklarda lokalize olur. Bar 20μm bir temsilcisidir.
Şekil 2, endotel-spesifik belirteçler için spesifik antikorların etiketli kültürlü MLECs FACS analizi: fikoeritrin-konjuge sekonder antikor takip VE kaderin (CD144) veya VEGFR2 olarak suçlanan, izole MLECs endotel kimliğini doğruluyor . Kırmızı çizgi izotip özel kontrol gösterir, yeşil hat gösterir anti-VE-kaderin ya da anti-VEGFR2 özgü IgG.
Discussion
Mikrovasküler EC vasküler biyoloji birçok alanda yararlı bir model olduğu kanıtlanmış ve yaygın olarak incelenmiştir HUVECs 3 'ünden (örneğin anjiyogenez) incelemek için daha fazla fizyolojik ilgili olduğu düşünülmektedir . Daha önce, bu mikrovasküler EC böbrek, kalp, deri, retina, beyin, gliomlar, yağ dokusu ve aynı zamanda akciğer 2, 4-7, 10, 11 elde edilebilir olduğu bildirilmiştir. Ancak, tutarlı ve güvenilir bir yöntemdir mikrovasküler EC izolasyonu için hala gereklidir. Burada sunulan yöntemle, daha önce yayınlanmış bir protokol 2 bir değişiklik; yavrular yerine yetişkin hayvanların kullandığı en yayınlanan prosedürleri farklıdır. Genç hayvanlardan elde edilen hücrelerin çoğalması potansiyeli yüksek ve dokulardan elde edilen kültürler, hücrelerin daha fazla sayıda verim eğilimi olarak bu izolasyon başarısı için çok önemlidir. Bir hafta eski hayvanların en iyi gibi görünüyor, ancak genç farelerde (4 gün eski) de kullanılabilir. Ayrıca, yavruların daha yüksek veya daha düşük sayıda bir yavru MLECs izole başarılı olduğu gibi, gerektiğinde kullanılan olabilir. Ancak, izolasyon işlemini ölçekleme veya aşağı iken, hücre kaplama yoğunluğu bu da hücre çoğalması için kritik olarak değişmeden kalmalıdır. Ilk anti-PECAM-1 konjuge manyetik boncuklar kullanarak MLECs ve anti-ICAM-2 antikorları daha 2 adım arınma süreci çok daha verimli, daha önce açıklanan tek bir adım arıtma işlemleri daha saf EC kültürler elde. Bu protokol, çok zahmetli bir el teknikleri, degrade santrifüj ve fibroblastlar, kan hücreleri ve düz kas hücreleri gibi atarak kirlenmesine neden olan hücreler için sıralama daha az verimli FACS kullanma ihtiyacı ortadan kaldırır. Anjiyogenik yanıtları, damar geçirgenliği ve lökosit göçüne in vitro analizi, iyileşme yanı sıra sinyal yolları biyokimyasal analiz yara sonucu MLEC nüfus kullanılabilir. Gerekirse, MLECs trans-endotelyal direnci (TER) ölçümleri için immünofloresan veya elektrod fibronektin veya jelatin kaplı lamelleri gibi farklı yüzeylerde kaplama olabilir. Elde edilen sonuçlar, giderek artan sayıda nakavt ve transgenik fare hatları bağlamında özellikle önemlidir in vivo gözlenen fenotipleri doğrudan mukayese edilebilir . In vitro analizi, in vivo gözlenen hatalarının altında yatan hücresel mekanizmaları için bu yöntemi başarılı bir şekilde uygulanması, zaten 12 sunulmuştur .
Disclosures
Protokolü AUA # 00001206 altında Wisconsin IACUC Komitesi Tıp Fakültesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bu araştırma, Amerikan Kalp Birliği hibe 0950118G.to MC-W tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Maruyama, Y. The human endothelial cell in tissue culture. Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).
- Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circ Res. 100, 158-173 (2007).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).
- Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).
- Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).
- Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues. J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).
- Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).
- Zachary, I., Gliki, G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).
- Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization. Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).
- Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice. Blood. 111, 2647-2656 (2008).
