Физиологические Записи высокого и низкого NMJs Выход на Экстензорных мышцы ног раков

Summary

В этой статье показано, как проводить электрофизиологические записи синаптических ответов на разгибателей мышц в ходьбе нога раков и как нервные окончания визуализируются, чтобы показать валовые морфологические различия высокого и низкого выхода нервных окончаний.

Abstract

Мы подробно объяснить, как представить и проведения электрофизиологических записей синаптических ответов на высоких (фазовый) и низкого (тонизирующий) нейронов мощность двигателя иннервирующих разгибателей мышц в ходьбе нога раков. Отдельные различия присутствуют в физиологии и морфологии фазической и тонической нервных окончаний. Тоник аксона содержит намного больше митохондрий, что позволяет ему принимать жизненно важные пятна более интенсивно, чем фазовый аксона. Тоник терминалы варикоз, и фазовый терминал нитевидные. Тоник терминалы низкой в ​​синаптической эффективности, но показать драматические способствовало ответов. В противоположность этому, фазовый терминалов с высоким содержанием квантовой эффективности, но показать синаптической депрессии с высокой частотой стимуляции. Квантового выхода измеряется с фокусным электрода macropatch размещаются непосредственно над визуализированы нервных окончаний. Оба фазической и тонической терминалы иннервируют же мышечных волокон, что позволяет предположить, что врожденные различия в нейронах, а не дифференциальной ретроградной обратную связь от мышц, составляют морфологические и физиологические дифференциации.

Protocol

1) Введение

Моторных нейронов общаться с мышечных волокон в синапсах, которые совместно именуемые нервно-мышечном соединении (NMJ). NMJs может быть легко доступен в большинстве подготовки раков мышцы. Многие из раков NMJs продемонстрировать не-пики возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП), аналогичные градуированных электрических сигналов, генерируемых в постсинаптических дендритов в ЦНС млекопитающих или подпороговых ответов отмечено в NMJs позвоночных (Вирсма и Ван Harreveld, 1938; Кац и Kuffler, 1946) . Раков NMJs может служить фундаментальным синаптических модели обеспечения общей взглянуть на синаптическую передачу и синаптической дифференцировки.

Как правило, моторных единиц регулируют аспекты поведения животных с помощью типа синаптической связи на NMJs и свойства мышц. Так как первое наблюдение "быстрых" и "медленные" мышечные сокращения в крабов и раков ближе мышц (Lucas, 1907, 1917), подобно мышечной сократительной дифференциация была описана в других раков мышц типов, таких как брюшной сгибатели (Kennedy & Такеда, 1965 , б) и разгибателей конечностей (Van Harreveld и Вирсма, 1936). "Быстрые" сокращения инициировать быстрые ответы. Например, флип раков хвост быстро поведения. "Медленный" сокращений поддерживать медленные движения и помогают поддерживать позу (Bradacs и соавт., 1997). В соответствии с "быстрыми" и "медленные" мышечные сокращения, "фазовый / высокая производительность» и «тоник / низкий выход" широко используется для описания моторных нейронов. Разница в скорости и времени мышечного сокращения в части, связанной с пресинаптической различия в синаптические структуры и синаптической силы (King и соавт., 1996). Миофибриллярных белка изоформы выражение также имеет важное значение в сократительной различия, но в препаратах как и мышцы ног разгибателей, в котором дано волокна иннервируются обоими типами моторных нейронов, акцент делается на синаптическую различий терминалов, так как доля терминалов же клетки-мишени (Mykles и соавт., 2002). В более раннем исследовании рассмотрены два возбуждающих аксонов двигатель ногу разгибателей и описал фазической и тонической фенотипы (Bradacs и соавт., 1997). В этом отчете мы показываем, как выполнить рассечение и получить записи, чтобы другие могли продолжить изучение свойств синаптической дифференциации этих нервных окончаний.

Просмотров с просвечивающей электронной микроскопии, различные ряда секций, полученных из тонизирующее и фазовый терминалов на раков мышц разгибателей ног, показало, что тоник терминалы содержат больше RRP пузырьки, чем фазовый терминалов; митохондрий более распространены в тонических нейронов и синапсов на фазовый терминалы более сложные, чем те, на низкой выходной синапсов, так как они содержат множество активных зон с различным интервалом (Миллер и др., 2002; Джонстон и др., 2008;. Король и др., 1996;.. Bradacs и др., 1997). Низким выходным клеммам тоник также более восприимчивы к повышению синаптической передачи с серотонином нейромодулятора (5-HT), чем фазовый терминалов (Cooper и соавт., 2003).

Тот факт, что тоника и фазической NMJ присутствуют на тех же мышечных волокон облегчает оценку пресинаптических разногласия по данной мышечных волокон и для решения вопросов мышечной усталости, депрессии и синаптических синаптических говорить крест. Различные вопросы еще предстоит решить в этой подготовке, например, является ли Существуют различия в постсинаптической плотности рецепторов и подтипов глутаматных рецепторов в постсинаптической цели тонизирующее и фазовый терминалов, но лучше понять фундаментальные различия в анатомии и физиологии этих два моторных единиц поможет в создании более глубоких знаний. Надеюсь, что основополагающие принципы узнал в этом синаптические препарат будет применима и к другим синапсов в различных препаратов и увеличит будущие исследования в этой модели синаптической раков.

2) методы

1. Все эксперименты проводятся на первом или втором ходьбе ноги среднего раков (Procambarus clarkii). Животные индивидуально размещаются в пластиковых контейнерах с обогащенную кислородом воду. Температура животных комнате находится в диапазоне от 13 ° C-16 ° C. Животных кормят сухим кормом рыбы и воды изменился на еженедельной основе.
   
   
   Рисунок 1: Схема раков ходьбе ноги и шесть дистальных сегментов.
2. Дистального аспект ходьбе ногу в раков анатомически разделен на шесть сегментов (рис. 1). Разгибателей ног находится в meropodite и нервов пакет, который будет изолирован близка к meropodite ischiopodite сустава. Тоником или фазовый аксонов могут быть выборочно стимулировать как нeeded для физиологических целей после того как они подвергаются.
3. Купер и Купер (2009) описаны некоторые аспекты начальной рассечение, включая методы для раскрытия excitor из нож двигательных нейронов в meropodite регионе, но их описание не дает забота, необходимые для защиты разгибателей мышц от повреждений, как это было не, необходимых для решения подготовке нож мышцы. В целях защиты разгибателей, первый или второй ходьбе нога будет удален из раков, измерения 6-10 см в длине тела (Атчафалайя Биологические питания Ко, Raceland, LA), вызывая животный автоматизировать конечности с силовой щипать дистальнее плоскость перелома в ischiopodite сегменте. Нога находится на вскрытии пластины с боковыми (внешняя сторона), стоящие перед зрителем. Нога повернулась вокруг, пока зритель может быть уверен, снаружи (боковые стороны) вверх на вскрытии пластины, как правило, с арочными стороной вверх (рис. 2). Размещение ногой на папиросную бумагу легче превратить подготовку, делая эти сокращения.
   
   
   Рисунок 2: боковой meropodite, как правило, сторона, которая является изогнутая, вверх на вскрытии пластины.
4. С скальпель выключателя лезвия и держатель, острое лезвие бритвы используют для травления кутикулы пока только прорезая в картине показано на рисунке 3 meropodite сегменте. Уход берется не зайти слишком далеко дистальных на спины к брюху сокращены на meropodite-карпоподит сустава.
   
   
   Рисунок 3: meropodite сегменте с линиями, как предложил шаблон для травления из окна кутикулы.
   
   
   Подготовка находится в физиологическом растворе. Рассечение блюдо должно иметь Sylgard (Dow Corning) покрытие на нижней (1 см толщиной). Sylgard используется так, чтобы насекомое контакты могут застрять в ней на проведение подготовки до сих пор. На данный момент, контактный застрял в середине карпоподит сегменте и в спинной части сегмента ischiopodite (рис. 4). Расчлененный препараты купались в стандартном солевом раков, модифицированный из раствора с Ван Harreveld (1936), который сделан с 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl _2, 2H ₂ O; 2,45 MgCl _2; 6H ₂ O, 5 HEPES и доводили до рН 7,4 (в мм).
   
   
   
   Рисунок 4: meropodite сегменте с вырезом окна быть снят. Обратите внимание на расположение контактов рассечение.
5. Кутикула аккуратно снят в дистальной области и мышечные волокна отрезать от кутикулы, делая ударов к основанию ноги. Кутикула может быть снят.
6. Аподема (сухожилия) режется на meropodite-карпоподит сустава. Контактный помещается на внутренней поверхности сухожилия сгибателей чтобы показать, где сокращение должно быть сделано (рис. 5). Сухожилия то ущипнул, где она была сокращена с пинцетом и сгибателей мышц снял, подняв его в каудальном направлении (рис. 6), подвергая главный нерв ноги и разгибателей мышц.
   
   
   Рисунок 5: аподема мышц сгибателей выделен путем вытеснения его из сгибателя с булавкой.
   
   
   
   Рисунок 6: аподема мышц сгибателей разрезается и удаляется с осторожностью, чтобы не повредить главный нерв нога.
7. Главный нерв нога режется на meropodite-карпоподит сустава и осторожно вытащил обратно на разгибателей мышц. Медиальной поверхности мышцы, используемые в настоящем исследовании. Разделение нерв разгибателей мышц от главного нерва нога может быть повышена, осторожно потянув дистальной культи главный нерв нога в сторону подготовки. Когда пилинг главный нерв нога назад на разгибателей мышц, мелких ветвей аксона, возможно, придется сократить. Эти ветви от тормозных нейронов двигателя разгибателей мышц. Чем больше пакет отходящие от основной нерв нога у проксимального конца meropodite является небольшой пучок нервов, представляющих интерес.
   
   
   Рисунок 7: главный нерв нога вырезать и убрала в проксимальном направлении.
   
   
   Этот нерв пучок можно увидеть метиленового синего окрашивания (рис. 8) или с 4-Ди-2-ASP флуоресцентные пятна (рис. 9).
   
   
   
   Рисунок 8: разгибателей мышц окрашенных метиленовым синим. Обратите внимание, аксон ветвление и два хорошо видна аксонов в нерв. Красные стрелки Демарк нерва трек.
   
   
   
   Рисунок 9: аксоны окрашенных двигательного нерва с 4-Ди-2-ASP. Тоник аксона ярче видимое в связи с увеличением митохондриальной содержания.
   
   
   Рис 10А: Индивидуальные терминалы фазической и тонические нейроны окрашивали 4-Ди-2-ASP. Обратите внимание, варикоз на тоник терминалов и тонкий характер фазовый терминалов.
   
   
   
   Рис 10В-Тоник отметил
   
   
   
   Рис 10C-Фазовые отметил

3) Физиологические профили

1. Для наблюдения возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) из тоником или фазовый нейронов, один из изолированных аксонов в нервных расслоение стимулируется всасывания электрод (рис. 11), подключенных к Трава стимулятор в то время как внутриклеточные потенциалы в мышцах отслеживаются (Джонстон и соавт., 2008). Стимуляция при 70 Гц подается на тоник аксонов в целях содействия способствовало ответ на низкие NMJs выход, или одиночный импульс (1 Гц) применяется к фазовый аксонов, чтобы получить большие ВПСП высокой выходной NMJs как показано на рисунке на рисунке 12. ВПСП записываются на компьютер через интерфейс PowerLab/4s.
   
   
   Рисунок 11: Стимулирование электродом, лежащим в течение одного аксона в нерв расслоения. Обратите внимание на зеленую линию изложением 2 основных аксонов.
   
   
   
   Рисунок 12: постсинаптических потенциалов (ВПСП) из тоником или фазовый нейроны, полученные от внутриклеточных записей.
2. Исследование в природе синаптических содействия и синаптической депрессии можно подойти различными экспериментальных парадигм с низким и высоким NMJs выход. Содействие низкой NMJs производительность зависит от частоты, как показано на 20, 40 и 60 Гц импульсов около 20 раздражителей (рис. 13).
   
   
   Рисунок 13: ВПСП в ответ на поезде стимуляции импульсами дано на трех разных частотах 20, 40 и 60 Гц в физиологическом растворе раков.
3. Скорость синаптической депрессии к частоте стимуляции также связана с высокой NMJs выход. На рисунке 14 показано непрерывное 5 Гц стимуляции удручает NMJ более 30 мин. При более высоких частот стимуляции, препарат будет подавлять более быстро (Bradacs и соавт., 1997).
   
   
   Рисунок 14: ВПСП амплитудой фазовой ответ в течение 5 Гц стимуляцию, чтобы вызвать депрессию.

4) квантильного Ответы

1. Процедура аналогична описанной для нож мышц раков (Cooper и Cooper, 2009) используется в данном препарате. Квантовой ВПСП прямо над идентифицировать регионы нервного окончания фиксируются путем размещения просвет макро-патч записи электрода на синаптическую варикозов визуализированы с жизненными красителя 4-Ди-2-Asp (5 мкМ, 5-мин лечение, Cooper и др. др., 1995;. Magrassi и др., 1987).. Спонтанное, а также вызвала квантовой ответы могут быть записаны вместе нервных окончаний. Вызывали и спонтанные синаптические потенциалы, записанные с макро-патч электрода (Dudel, 1981; Wojtowicz и др., 1991;. Mallart, 1993). Kimax стекла (наружный диаметр: 1,5 мм) была разобрана и огневой полировкой, чтобы произвести патч советы с внутренним диаметром от 10 до 20 мкм (рис. 15).
   
   
   Рисунок 15: просвет макро-патч записи электрода.
   
   
   Просвет электрод наполнен купания среды. Усилитель же, что и для внутриклеточных записей, упомянутых выше. Электрод и печатью сопротивления может быть определен путем пропускания тест импульсов тока через электрод. В наших экспериментах, печать сопротивления колебались от 0,3 до 1,0 МОм и сопротивления электродов в диапазоне от 0,5 до 1,0 МОм. Печать сопротивление может быть контролируется в течение записи.
2. Прямой подсчет квантовых событий возможно при низких частотах стимуляции. Для каждого вызвала отклик, число квантовых событий могут быть легко определены для низких выходных клемм (рис. 16). Эти прямого счета может помочь оценить среднее содержание квантовой (Del Castillo & Katz, 1954;. Cooper и др., 1995). С вызвала высокий NMJs выход производят несколько квантовых вызвали события, средняя амплитуда или области отклонений, а также средней амплитудой или области спонтанных событий, могут быть использованы для соответствуюximate означает квантовой содержания (Cooper и соавт., 1995).
   
   
   Рисунок 16 Фокусное следы записан с фазической и NMJ тоником.
   
   
   Рисунок 17

Discussion

Мы показали в этом докладе, как анализировать, записывать и количественно синаптических ответов в уникальной раков нервно-мышечной подготовки, в которых оба высоких и низких выходных клемм иннервируют же мышечных волокон. Нервно-мышечные препараты в раков имеют много преимуществ по сравнению с позвоночными переходы нервно-мышечной, так как только несколько возбуждающих моторные нейроны необходимы для иннервируют мышцы, и так как нейроны могут быть идентифицированы с подготовкой к подготовке (Этвуд, 1976). Кроме того, возбуждающих нейротрансмиттеров является глутамат и возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) оцениваются, таким образом, биофизических свойств градуированных события аналогичны дендриты нейронов в ЦНС позвоночных. Квантовых токов, однако, можно наблюдать непосредственно на постсинаптические участки (Cooper и соавт., 1995).

Повторяющиеся 5 Гц стимуляции нерва фазовый приводит к большим ВПСП, которые становятся значительно подавлен в течение нескольких минут. Этот тип депрессия распространена в членистоногих фазовый нервно-мышечного соединения (Этвуд и Купер, 1996). Наличие тоник терминалов наряду фазовый терминалов позволяет оценить, является ли или нет постсинаптических целевых значительно изменяться во время и после депрессии фазовый двигательных нейронов. Кроме того, низкая выходных клемм обеспечивают хорошую подготовку для расследования механизмы, лежащие в основе синаптической процедур (Десаи-Шах и др., 2008;. Десаи-шаха и Купер, 2009)

Высокие выходные клеммы обеспечивают игровую площадку для исследования модуляции скорость синаптической депрессии и процесс восстановления. Доступное и жизнеспособной препараты должны помочь в расшифровке механизмы, лежащие в синаптической депрессии. В этом разгибателей подготовки ногу раков, экзогенные применения серотонина является еще одним инструментом для расследования восстановления синаптической депрессии и, возможно, из средств содействия расследованию мобилизации синаптических пузырьков бассейнов. Этот препарат содержит несколько экспериментальных преимущества, поскольку отдельные мышечные волокна иннервируются как фазической и тонической моторных нейронов.

Так как серотонин повышает количество пузырьков, которые высвобождаются с вызывали раздражение, и, поскольку она способствует восстановлению в период депрессии, совершенно очевидно, что есть некоторая модуляция пузырь бассейны для повышения вероятности слияния с серотонином настоящее время (Джонстон и соавт., 2008 ; Логсдон и др., 2006;. Sparks и др., 2004).. Модели, которые могло бы объяснить динамику пузырька пулах в пределах пресинаптического нерва терминал во время низких частот стимуляции, в отличие от депрессивного состояния, также должны быть рассмотрены среди различных экспериментальных протоколов, которые можно с этого препарата.

Было отмечено, в других системах, что около 30% от пузырьков бассейн подвергается быстрой утилизации, в то время как остальные переработаны пузырьки проходят традиционные медленный путь переработки через эндоплазматический ретикулум (Harata и др., 2001;. Цяня и др.. , 2001). Такое двойное пути могут также присутствовать в этой системе. Если АТФ не хватает в подавленном состоянии из пресинаптических терминал, то стыковки и расстыковки не могли бы произойти, таким образом, еще много выгружены везикулы останется на уровне синаптической поверхности. Так как больше пузырьков быстро высвобождается, когда терминалы подвержены 5 HT, это возможно, что более содержатся в легко разборных бассейн (RRV). Однако, в подавленном состоянии, с пониженной АТФ, стыковки и расстыковки, могут быть заблокированы даже в присутствии 5 HT, который снова выходит выгружены везикулы в синаптическую поверхность. Поскольку предварительные данные свидетельствуют о том, что все больше пузырьков высвобождаются с течением времени при длительном 5 HT воздействия и стимулирования, распределение пузырьков бассейн с быстрыми и медленными пути переработки могут быть искажены, чтобы компетентные пузырьки для переиздания (от Джонстон и соавт. , 2008; см. обзоры-Десаи-Шах и др., 2008;. Десаи-шаха и Купер, 2009)

С техникой координационного записи macropatch постсинаптических токов и меры одном квантов от определенных регионах терминал двигательного нерва, можно задавать вопросы, чтобы определить синаптической депрессии, возникающих в результате уменьшения числа пузырьков освобождения или из-за изменения функции постсинаптических рецепторов. Было показано, что пузырьки более чувствительны к слиянию на фазовый NMJ этого препарата для равного воздействия кальция (Miller и соавт. 2005), который, вероятно, объясняется более высокое среднее содержание квантовой фазовый терминалов (Msghina и соавт. , 1998, 1999). Кроме того, различия в кальция обязательной frequenin белка (Jeromin и соавт., 1999) и ультраструктуры (King и соавт., 1996) способствуют дифференциальной синаптической эффективности (Cooperи соавт., 2003).

Некоторые предыдущие исследования исследовали фенотип мышц разгибателей мышечных волокон (Bradacs и др., 1997;. Cooper и др., 2003.). Сравнение регуляции мышечного дифференциации по чисто тонизирующий и фазовый типов волокон в раков, чтобы смешанные типы волокна, как и для ног разгибатель, который тупо иннервируются, может дать ключ к мышечной выражение фенотипа и регулирования (Лафрамбойс и др., 2000;. Sohn и др. др., 2000;. Гриффис и др., 2001;. Mykles и др., 2002)..

Многие фундаментальные вопросы еще предстоит решить в области нейробиологии, и этот препарат может помочь в решении некоторых из них. Несколько вопросов, представляющих интерес в области сегодня, что можно было бы подойти с ног разгибателей относятся: 1) Определение клеточные механизмы, лежащие в основе синаптической депрессии в высоких выходных клемм (Is депрессии из-за сокращения Са2 + запись, отсутствие компетентных легко разборных пузырек (RRV) бассейн, и / или изменены постсинаптических восприимчивость?) 2) Определение механистической роль 5-HT, когда применяется после индукции синаптической депрессии способствовать более быстрому восстановлению, и 3) Определение наличия формы квантовой токи, которые возникают от стимулирования фазовый терминалов в настоящее время изменен во время индукции депрессии для решения пред-и пост-синаптические компоненты синаптической депрессии.

Это NMJ важно текущих исследований и будущих исследователей, поскольку он позволяет получить необходимую информацию, что адреса подчиненного механизмах синаптической производительность, как измеряется непосредственно при выпуске сайтов. Современные исследования в этой области является предоставление информации о модуляции синаптической депрессии, 5-НТ и динамики пузырьков бассейнов. Такие темы, относящиеся к фундаментальным основам синаптической передачи актуальны для всех нейронных систем.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.