Le registrazioni fisiologiche NMJs uscita alta e bassa del muscolo estensore gamberi Leg

Summary

Questo articolo viene illustrato come effettuare registrazioni elettrofisiologiche delle risposte sinaptiche sul muscolo estensore della gamba a piedi di un gambero e come le terminazioni nervose sono visualizzati per mostrare le differenze morfologiche lordo di alta e bassa resa terminazioni nervose.

Abstract

Vi spieghiamo in dettaglio come esporre e condurre registrazioni elettrofisiologiche delle risposte sinaptiche per l'alta (fasica) e bassa (tonica) motoneuroni uscita innervano i muscoli estensori della gamba a piedi di un gambero. Chiare differenze sono presenti nella fisiologia e la morfologia delle terminazioni nervose fasica e tonica. L'assone tonico contiene molti più mitocondri, le consente di prendere un vitale macchia più intensamente l'assone fasica. I terminali hanno varicosità tonico, e il terminale fasica è filiforme. I terminali tonico sono bassi in termini di efficacia sinaptica ma mostrano drammatiche risposte facilitato. Al contrario, i terminali fasici sono alti in termini di efficacia quantico ma mostrano la depressione sinaptica con la stimolazione ad alta frequenza. L'uscita quantali viene misurata con un elettrodo macropatch focale posto direttamente sopra il terminazioni nervose visualizzati. Entrambi i terminali fasica e tonica innervano le fibre muscolari stesse, il che suggerisce che le differenze insite nei neuroni, piuttosto che un feedback differenziale retrograda dal muscolo, conto per la differenziazione morfologiche e fisiologiche.

Protocol

1) Introduzione

Motoneuroni comunicare con una fibra muscolare a livello delle sinapsi, che sono indicate collettivamente come una giunzione neuromuscolare (MNJ). NMJs si può accedere facilmente a preparazioni più gamberi muscolare. Molti dei NMJs gamberi dimostrare le potenzialità eccitatori non spiking postsinaptici (EPSP) simile ai segnali elettrici generati classificato in dendriti postsinaptici nel sistema nervoso centrale dei mammiferi o risposte sottosoglia osservato nella NMJs vertebrati (Wiersma & Van Harreveld, 1938; Kuffler & Katz, 1946) . Il NMJs gambero può servire come modello fondamentale sinaptica di fornire uno sguardo generale in trasmissione sinaptica e la differenziazione sinaptica.

In generale, unità motorie regolano gli aspetti del comportamento animale tramite il tipo di comunicazione sinaptica a NMJs e le proprietà dei muscoli. Dal momento che la prima osservazione di "fast" e "lento" contrazioni muscolari in granchi e gamberi di fiume più vicino muscolare (Lucas, 1907, 1917), simile differenziazione muscolare contrattile è stato descritto in altri tipi muscolare gamberi come flessori addominale (Kennedy & Takeda, 1965a , b) ed estensori degli arti (Van Harreveld & Wiersma, 1936). "Fast" contrazioni avviare risposte rapide. Per esempio, il flip coda gambero è un comportamento veloce. "Slow" contrazioni mantenere movimenti lenti e contribuire a mantenere una postura (Bradacs et al., 1997). Corrispondente a "fast" e "lento" contrazioni muscolari ", fasica / ad alto rendimento" e "output tonico / basso" sono ampiamente utilizzati per descrivere i motoneuroni. La differenza di velocità e tempi di contrazione muscolare è in parte riconducibile a differenze nella struttura presinaptica sinaptica e la forza sinaptica (King et al., 1996). Isoforma proteica miofibrillare espressione è importante anche per le differenze contrattile, ma in preparazioni come quello del muscolo estensore della gamba, in cui è innervato una fibra data da entrambi i tipi di neuroni motori, l'attenzione è sulle differenze dei terminali sinaptici, dal momento che i terminali parti la cella di destinazione stesso (Mykles et al., 2002). Un precedente studio ha esaminato i due assoni motori eccitatori del estensori gamba e descritti i fenotipi fasica e tonica (Bradacs et al., 1997). In questo rapporto, si dimostra come eseguire la dissezione e di ottenere le registrazioni in modo che altri possano investigare le proprietà della differenziazione sinaptici di queste terminazioni nervose.

Visto con microscopia elettronica a trasmissione, diverse serie di sezioni ottenute dalla tonica e terminali fasica sul muscolo estensore della gamba gamberi rivelato che i terminali tonico contengono più vescicole RRP di terminali fasica, i mitocondri sono più frequenti nei neuroni tonico, e le sinapsi sui terminali sono fasica più complessi di quelli sulle sinapsi a bassa potenza, in quanto contengono più zone attive con spaziatura varia (Miller et al, 2002; Johnstone et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). La bassa resa terminali tonico sono anche più sensibili a rafforzare la trasmissione sinaptica con il neuromediatore serotonina (5-HT) che sono i terminali fasica (Cooper et al., 2003).

Il fatto che la tonica e fasica NMJ sono presenti sulla stessa fibra muscolare rende più facile valutare le differenze presinaptico su una fibra muscolare dato e di affrontare questioni di affaticamento muscolare, depressione sinaptica e cross talk sinaptica. Diverse questioni rimangono da affrontare in questa preparazione, ad esempio se ci sono differenze nella densità dei recettori post-sinaptici e sottotipi di recettori del glutammato nel obiettivi postsinaptica per il tonico e terminali fasica, ma una migliore comprensione delle differenze fondamentali nella anatomia e la fisiologia di questi due unità motore sarà di aiuto nella costruzione di una base di conoscenza più profonda. La speranza è che i principi fondamentali imparato in questa preparazione sinaptica saranno applicabili a sinapsi altre preparazioni diverse e migliorerà future indagini in questo modello sinaptica del gambero.

2) Metodi

1. Tutti gli esperimenti sono condotti sulle gambe prima o la seconda a piedi di gamberi di medie dimensioni (Procambarus clarkii). Gli animali sono alloggiati individualmente in contenitori di plastica con acqua ossigenato. La temperatura della stanza animale è nel range di 13 ° C-16 ° C. Gli animali vengono nutriti con cibo secco i pesci e l'acqua cambiata su base settimanale.

   
   Figura 1: Schema di una gamba gamberi a piedi e sei segmenti distali.

2. La porzione distale della gamba camminando in un gambero è anatomicamente diviso in sei segmenti (Figura 1). L'estensore della gamba si trova nel meropodite, e il fascio nervoso che sarà isolata è vicino al ischiopodite meropodite comune. L'assone toniche o fasiche possono be selettivamente stimolati richiesto dagli scopi fisiologici dopo che sono stati esposti.
3. Cooper e Cooper (2009) descritto alcuni aspetti della dissezione iniziale, compresi i metodi per smascherare il excitor del motore opener neurone all'interno della regione meropodite, ma la loro descrizione non fornisce la necessaria cura per la protezione del muscolo estensore dai danni, come è stato non è necessario per affrontare la preparazione muscolare opener. Al fine di proteggere l'estensore, la gamba a piedi prima o la seconda viene rimosso dal gambero di fiume, che misura 6-10 cm di lunghezza del corpo (Atchafalaya biologica Supply Co., Raceland, LA), inducendo l'animale per automatizzare l'arto con pizzicare forte distale al piano di frattura nel segmento ischiopodite. La gamba è posto sul piatto con la dissezione laterale (lato esterno) rivolto verso lo spettatore. La gamba è girato fino a quando lo spettatore può essere certo l'esterno (laterale) è rivolto verso l'alto sulla piastra di dissezione, di solito con il lato ad arco verso l'alto (Figura 2). Ponendo la gamba su un pezzo di carta velina è più facile girare la preparazione rendendo questi tagli.

   
   Figura 2: La parte laterale del meropodite, di solito il lato che è ad arco, è rivolto verso l'alto sul piatto dissezione ..

4. Con un interruttore di lama di bisturi e titolare, una lama di rasoio affilato è usato per incidere il cuticola fino a poco attraverso il taglio nel modello mostrato in Figura 3 per il segmento meropodite. Si fa attenzione a non tagliare troppo distale sulla dorsale di tagliare ventrale dal meropodite-carpopodite comune.

   
   Figura 3: Il segmento meropodite con linee come modello suggerito per l'incisione fuori dalla finestra della cuticola.

   Il preparato va messo in soluzione salina. Il piatto dissezione dovrebbe avere un (Dow Corning) Sylgard rivestimento sulla parte inferiore (1 cm di spessore). Il Sylgard è usato in modo che i pin di insetti possono essere bloccati dentro per tenere la preparazione ancora. A questo punto, un pin è bloccato nel bel mezzo del segmento carpopodite e nella parte dorsale del segmento ischiopodite (Figura 4). Preparati sezionato sono immersi in soluzione salina gamberi standard, modificato dalla soluzione Van Harreveld s (1936), che è fatto con 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl _2; 2H ₂ O; 2,45 MgCl _2; 6H ₂ O, 5 HEPES e regolato pH 7.4 (in mm).

   
   Figura 4: Il segmento meropodite con finestra taglio viene sollevato. Notare la posizione dei perni dissezione.

5. La cuticola è leggermente sollevato nella regione distale e le fibre muscolari sono tagliati fuori dalla cuticola rendendo colpi verso la base della gamba. La cuticola può essere sollevato.
6. Il apodeme (tendine) viene tagliata a meropodite-carpopodite comune. Un perno è posto sulla superficie interna del tendine flessore per mostrare dove il taglio deve essere effettuato (Figura 5). Il tendine viene poi schiacciato dove è stato tagliato con le pinzette e il muscolo flessore tirato fuori sollevandola in direzione caudale (Figura 6), esponendo il nervo principale gamba e il muscolo estensore.

   
   Figura 5: Il apodeme del muscolo flessore è evidenziato spostando dal flessore con uno spillo.

   
   Figura 6: Il apodeme del muscolo flessore è tagliato e rimosso con cura per non danneggiare il nervo principale gamba.

7. Il nervo della gamba principale è tagliato alla meropodite-carpopodite comune e con attenzione tirato indietro al muscolo estensore. La superficie mediale del muscolo è usato in tutto questo studio. La separazione del nervo al muscolo estensore del nervo della gamba principale può essere migliorata tirando delicatamente il moncone distale del nervo della gamba principale al fianco della preparazione. Quando il nervo principale peeling gamba posteriore sopra il muscolo estensore, piccoli rami di assone può essere necessario tagliare. Questi sono i rami dal motoneurone inibitorio al muscolo estensore. Il bundle più grandi che si diramano dal nervo della gamba principale verso la fine prossimale del meropodite è il fascio nervo piccolo di interesse.

   
   Figura 7: Il nervo della gamba principale è tagliato e tirato indietro in direzione prossimale.

   Questo bundle nervo può essere visto con colorazione blu di metilene (Figura 8) o con 4-Di-2-ASP macchia fluorescente (Figura 9).

   
   Figura 8: Il muscolo estensore macchiato con blu di metilene. Si noti la ramificazione degli assoni e ladue assoni facilmente visibile all'interno del nervo. Frecce rosse delimitano la pista del nervo.

   
   Figura 9: Gli assoni del nervo motore macchiato con 4-Di-2-ASP. L'assone tonica è più luminosa visibile a causa del maggiore contenuto mitocondriale.

   
   Figura 10A: singoli terminali dei neuroni fasica e tonica colorati con 4-Di-2-ASP. Si noti la varicosità sui terminali tonica e la natura sottile dei terminali fasica.

   
   Figura 10B-Tonic notato

   
   Figura 10C-fasica notato

3) profili fisiologici

1. Per osservare il potenziale eccitatorio postsinaptico (EPSPS) dei neuroni tonica o fasica, uno degli assoni isolate nel bundle nervo è stimolato da un elettrodo di aspirazione (Figura 11) collegato a uno stimolatore Grass mentre potenziale intracellulare nel muscolo vengono monitorati (Johnstone et al., 2008). Stimolazione a 70 Hz viene applicato l'assone tonico al fine di promuovere una risposta agevolata per i NMJs bassa uscita, o un singolo impulso (1 Hz) viene applicato l'assone fasica al fine di ottenere epsps grande del NMJs alto rendimento, come indicato nella figura 12. Il EPSPS sono registrati ad un computer tramite un'interfaccia PowerLab/4s.

   
   Figura 11: Stimolare l'elettrodo posto nel corso di un singolo assone all'interno del fascio nervoso. Si noti la linea verde che delinea i 2 assoni principale.

   
   Figura 12: i potenziali postsinaptici (EPSPS) dei neuroni tonica o fasica come ottenute da registrazioni intracellulari.

2. Indagine nella natura della facilitazione sinaptica e la depressione sinaptica può essere avvicinato da diversi paradigmi sperimentali con il NMJs uscita bassa e alta. Facilitazione del NMJs uscita bassa dipende dalla frequenza, come indicato per gli impulsi di 20 Hz, 40 e 60 di circa 20 stimoli (Figura 13).

   
   Figura 13: EPSPS in risposta ad un treno di impulsi di stimolazione dato a tre differenti frequenze 20, 40 e 60 Hz in soluzione salina normale gamberi.

3. Il tasso di depressione sinaptica alla frequenza di stimolazione è anche legato alla NMJs alto rendimento. La figura 14 mostra una continua stimolazione dei 5 Hz premendo il NMJ oltre 30 min. Con la frequenza di stimolazione più alta, la preparazione si deprimono più rapidamente (Bradacs et al., 1997).

   
   Figura 14: EPSP ampiezza della risposta fasica durante 5 Hz stimolazione per indurre depressione.

4) Le risposte quantico

1. Una procedura simile a quella descritta per il muscolo opener del gambero (Cooper e Cooper, 2009) è usato in questa preparazione. Il EPSPS quantali direttamente sopra le regioni identificabili del terminale nervoso sono registrati ponendo il lume di una macro-patch elettrodo registrazione su varicosità sinaptiche visualizzati con il colorante vitale 4-Di-2-Asp (5 mM, a 5 minuti di trattamento, Cooper et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. Il spontaneo così come evocato risposte quantali possono essere registrate lungo le terminazioni nervose. I potenziali evocati e spontanea sinaptica sono registrati con la macro-patch elettrodo (Dudel, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993). Kimax vetro (diametro esterno: 1,5 mm) è stato tirato e il fuoco-lucido per la produzione di punte di patch con diametro interno da 10 a 20 micron (Figura 15).

   
   Figura 15: Il lume di una macro-patch elettrodo di registrazione ..

   Il lume del l'elettrodo viene riempito con il mezzo bagno. L'amplificatore è la stessa di quella utilizzata per le registrazioni intracellulari di cui sopra. Elettrodi e la resistenza di tenuta può essere determinato facendo passare impulsi di corrente di prova attraverso l'elettrodo. Nei nostri esperimenti, resistenze sigillo variava dal 0,3-1,0 MOhm e la resistenza elettrodo variava dal 0,5-1,0 MOhm. Resistenza sigillo può essere monitorato per tutta la registrazione.

2. Conteggio diretto degli eventi quantali è possibile con basse frequenze di stimolazione. Per ogni risposta evocata, il numero di eventi quantali può essere facilmente determinato per i morsetti di uscita bassa (Figure 16). Questi conteggi diretto può aiutare a stimare il contenuto medio quantal (Del Castillo e Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). Poiché il NMJs evocato ad alto rendimento produrre eventi evocati multi-quantica, l'ampiezza media o area del deviazioni, insieme con l'ampiezza di picco media o l'area degli eventi spontanei, può essere utilizzato per stimare il contenuto medio quantal (Cooper et al. 1995).

   
   Figura 16 tracce registrate da una focale fasica e NMJ tonico.

   
   Figura 17

Discussion

Abbiamo dimostrato in questa relazione come sezionare, registrare e quantificare le risposte sinaptiche in un preparato neuromuscolare gamberi unico in cui entrambi i terminali ad alta e bassa resa innervano la stessa fibra muscolare. I preparativi neuromuscolare nel gamberi offrono numerosi vantaggi rispetto vertebrati giunzioni neuromuscolari, dal momento che solo un paio di neuroni eccitatori motore sono necessari per innervare un muscolo, e dal momento che i neuroni sono identificabili dalla preparazione alla preparazione (Atwood, 1976). Inoltre, il neurotrasmettitore eccitatorio glutammato è, e il potenziale postsinaptico eccitatorio (EPSP) sono classificati, quindi, le proprietà biofisiche di eventi classificati siano analoghi ai dendriti dei neuroni nel sistema nervoso centrale dei vertebrati. Le correnti quantica, tuttavia, può essere monitorato direttamente presso i siti postsinaptico (Cooper et al., 1995).

Ripetitiva 5 Hz stimolazione del nervo fasica dà luogo a grandi EPSPS che diventano molto depresso dopo alcuni minuti. Questo tipo di depressione è comune in artropodi fasica giunzioni neuromuscolari (Atwood e Cooper, 1996). La presenza dei terminali tonico a fianco del terminal fasica permette di valutare se l'obiettivo postsinaptica è notevolmente modificato durante e dopo la depressione del fasica motoneuroni. Inoltre, i terminali di uscita bassa di fornire una preparazione bella per investigare i meccanismi che sono alla base facilitazione sinaptica (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009)

I terminali ad alto rendimento forniscono un parco giochi per indagare la modulazione del tasso di depressione sinaptica e il processo di recupero. Preparati accessibile e vitale dovrebbe aiutare a decifrare i meccanismi alla base della depressione sinaptica. In questa preparazione gamberi estensori della gamba, l'applicazione esogena di serotonina è un altro strumento per indagare il recupero di depressione sinaptica e, potenzialmente, un mezzo per promuovere un'inchiesta sulla mobilitazione dei pool di vescicole sinaptiche. Questa preparazione fornisce diversi vantaggi sperimentale, dal momento che singole fibre muscolari sono innervate da motoneuroni sia fasica e tonica.

Dato che la serotonina aumenta il numero di vescicole che vengono rilasciate con la stimolazione evocato, e dal momento che promuove il recupero durante la depressione, è evidente che vi è una certa modulazione delle piscine vescicola per aumentare la probabilità di fusione con l'attuale serotonina (Johnstone et al., 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. I modelli che spiegherebbe la dinamica delle piscine vescicola all'interno del terminale nervoso presinaptico durante la stimolazione a bassa frequenza, rispetto a uno stato di depressione, anche bisogno di essere considerati tra i vari protocolli sperimentali che sono possibili con questa preparazione.

E 'stato osservato in altri sistemi che circa il 30% del pool vescicola subisce un rapido riciclaggio, mentre il resto delle vescicole riciclato passare attraverso un percorso tradizionale di riciclaggio lento attraverso il reticolo endoplasmatico (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Tali percorsi duale può essere presente anche in questo sistema. ATP se manca la depressione del terminale presinaptico, poi aggancio e sgancio potrebbe non essere in grado di verificarsi, quindi, molte vescicole più scaricati rimarrebbe in superficie sinaptica. Da più vescicole sono rapidamente rilasciati quando i terminali sono esposti a 5 HT, è possibile che più sono contenuti all'interno della piscina facilmente scaricabile (RRV). Tuttavia, nello stato di depressione, con una ridotta ATP, l'attracco e sgancio può essere bloccato anche in presenza di 5 HT, che lascia ancora una volta scaricata vescicole sinaptiche in superficie. Poiché i dati preliminari suggeriscono che più vescicole vengono rilasciate nel tempo con l'esposizione prolungata 5 HT e la stimolazione, la distribuzione della piscina vescicola dai sentieri riciclo veloce e lento può essere inclinata per avere vescicole competente per la re-release (da Johnstone et al. , 2008, vedi su-Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009)

Con le tecniche di registrazioni macropatch focale delle correnti postsynaptic e misure di quanti singolo regioni definite del terminale nervo motore, si possono porre domande per determinare se la depressione sinaptica si verifica come conseguenza di un minor numero di vescicole di essere rilasciato oa causa di alterazioni della funzione dei recettori postsinaptici. E 'stato dimostrato che le vescicole sono più sensibili alla fusione presso il NMJ fasica di questo preparato per un'esposizione di calcio uguale (Miller et al. 2005), che rappresenta probabilmente per il maggiore contenuto medio quantale dei terminali fasica (Msghina et al. , 1998, 1999). Inoltre, le differenze nel frequenin legame con le proteine ​​di calcio (Jeromín et al., 1999) e ultrastruttura (King et al., 1996) contribuire alla efficacia sinaptica differenziale (Cooperet al., 2003).

Alcuni studi precedenti hanno esplorato il fenotipo muscolare delle fibre dei muscoli estensori (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003).. Confrontando la regolazione della differenziazione muscolare per i tipi di fibra puramente tonica e fasica nel gamberi di tipi di fibre miste, come per l'estensore della gamba che è innervato sordamente, potrebbe fornire indizi per l'espressione e la regolazione dei muscoli fenotipo (LaFramboise et al, 2000;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002)..

Molte questioni fondamentali restano da affrontare in neurobiologia, e questa preparazione può aiutare per affrontare alcuni di essi. Alcuni argomenti di interesse in campo oggi, che potrebbe essere affrontato con l'estensore della gamba includono: 1) Determinare i meccanismi cellulari che sono alla base della depressione sinaptica all'interno di alto rendimento terminali (è la depressione a causa di una riduzione del Ca2 + ingresso, la mancanza di una competente facilmente sganciabili vescicola (RRV) piscina, e / o alterata recettività postsinaptici?) 2) Determinazione della funzione meccanicistica della 5-HT, quando applicato dopo l'induzione di depressione sinaptica per favorire un recupero più veloce, e 3) Determinare se le forme delle quantali correnti che derivano dalla stimolazione fasica terminali sono stati alterati durante l'induzione di depressione per affrontare componenti pre-e post-sinaptica di depressione sinaptica.

Questo NMJ è importante per la ricerca in corso e gli investigatori futuro perché ci permette di ottenere informazioni pertinenti che affronta i meccanismi sinaptici subalterno della performance, misurata direttamente presso i siti di rilascio. La ricerca attuale in questo settore è fornire informazioni circa la modulazione della depressione sinaptica da 5-HT e le dinamiche delle piscine vescicola. Tali argomenti riguardano le basi fondamentali della trasmissione sinaptica rilevanti per tutti i sistemi neurali.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.