Neuroscience

크레이 레그 신근 근육에 높은 및 낮은 출력 NMJs의 생리 레코딩

Published: November 17, 2010 doi: 10.3791/2319

¹Department of Biology, University of Kentucky

* These authors contributed equally

Summary

이 문서에서는 왕새우 걸을 수있는 다리의 신근 근육에 신경 반응의 electrophysiological 녹음을 실시 방법과 신경 단말기가 높은 및 낮은 출력 신경 단말기 총 형태학의 차이를 보여 시각 아르하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

우리는 높은 (phasic)와 낮은 (토닉) 출력 모터 뉴런은 왕새우 걸을 수있는 다리의 신근 근육 innervating위한 시냅스 응답 electrophysiological 녹음을 폭로하고 수행하는 방법을 자세히 설명합니다. 뚜렷한 차이 phasic와 토닉 신경 터미널의 생리와 형태에 존재한다. 토닉의 축삭은 매우 중요한 더 강하게 phasic 축삭보다 얼룩 걸릴 수 있도록, 많은 사람들이 더 mitochondria가 포함되어 있습니다. 토닉 터미널 varicosities 있고, phasic 터미널 사상이다. 토닉 터미널은 시냅스 효능이 적은 있지만 극적으로 촉진 반응을 보여줍니다. 반면, phasic 터미널 quantal 효능 높은 있지만 고주파 자극과 신경 우울증을 보여줍니다. quantal 출력은 시각 신경 터미널을 통해 직접 배치 초점 macropatch 전극과 측정됩니다. phasic와 토닉 두 터미널은 형태학의와 생리 차별 화를위한 그 뉴런의 고유한 차이보다는 근육에서 차등 역행 피드백, 계정을 제안 같은 근육 섬유를 신경을 분포시키다.

Protocol

1) 소개

모터 뉴런은 집합 신경근육학 교차로 (NMJ)이라고합니다 시냅스에서 근육 섬유와 통신합니다. NMJs 대부분의 크레이 근육 준비에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 크레이 피쉬 NMJs의 대부분은 척추의 NMJs에 명시된 포유 동물 CNS 또는 subthreshold 응답 시간 postsynaptic dendrites에서 생성된 등급 전기적 신호와 유사한 비 급상승 흥분성의 postsynaptic 잠재력 (EPSP)를 입증 (Wiersma & 반 Harreveld, 1938; 캐츠 & Kuffler, 1946) . 크레이 피쉬 NMJs는 시냅스 시냅스 전달과 분화에 일반적인 통찰력을 제공하는 기본적인 시냅스 모델로 검색할 수 있습니다.

일반적으로, 모터 단위는 근육의 NMJs 및 특성에 시냅스 커뮤니케이 션의 유형을 통해 동물의 행동의 측면을 통제. 게하고 크레이 피쉬 가까이 근육 (루카스 1907 1917)에서 "빠른"와 "느린"근육의 수축의 첫 번째 관찰 이래, 유사한 근육 수축성 차별은 같은 복부 박혀 (케네디 & 다케다, 1965a와 같은 다른 크레이 근육 유형에 설명되어있다 , B)와 사지 extensors (반 Harreveld & Wiersma, 1936). "빠른"수축이 빠른 응답을 시작합니다. 예를 들어, 크레이 피쉬 꼬리 플립은 빠른 동작입니다. "느린"수축 속도가 느린 움직임을 유지하고 자세를 (Bradacs 외., 1997) 유지할 수 있도록 도와주십시오. "빠른"와 "느린"근육의 수축에 대응하는 "하이 / phasic 출력"과 "토닉 / 낮은 출력은"널리 모터 뉴런을 설명하는 데 사용됩니다. 근육 수축의 속도와 타이밍의 차이는 시냅스 구조와 시냅스 강도 presynaptic 차이 (킹 외., 1996)와 관련된 부분이다. Myofibrillar 단백질 이소형 표현은 수축성의 차이도 중요하지만 특정 섬유 모터 뉴런의 두 가지 유형에 의해 innervated되는 다리의 신근 근육의 그런 준비에 초점이 터미널의 시냅스 차이에있는 단말기가 공유 이후 동일한 대상 셀 (Mykles 외., 2002). 이전 연구는 다리 신근의 두 흥분성의 모터 axons 검사를하고 phasic와 토닉 phenotypes을 (Bradacs 외., 1997) 설명했다. 이 보고서에서는, 우리는 다른 사람들이 더 신경이 터미널의 시냅스 분화의 속성을 조사할 수 있도록 절개를 수행하고 녹음을 얻는 방법을 보여줍니다.

보입니다 전송 전자 현미경, 크레이 피쉬 다리 신근 근육에있는 토닉과 phasic 터미널에서 얻은 섹션의 다양한 시리즈 토닉 단말기가 phasic 터미널보다 RRP의 vesicles를 포함하는 것으로 나타났습니다, mitochondria는 토닉 뉴런에 더 유행하고 있으며, phasic 터미널에있는 시냅스 있습니다 더 낮은 출력 시냅스에서보다 복잡한, 그들은 다양한 간격 (밀러 외, 2002; 존스톤 외, 2008;. 킹 외, 1996;.. Bradacs 외, 1997) 여러 활성 영역을 포함하고 있기 때문입니다. 낮은 출력 토닉 단자도 phasic 터미널 (쿠퍼 외., 2003)보다 neuromodulator의 세로토닌과 시냅스 강화 전송 (5 - HT)에 더 취약합니다.

토닉과 phasic NMJ 같은 근육 섬유에 존재하는 사실은 쉽게 특정 근육 섬유에 presynaptic 차이를 평가하고 근육 피로, 신경 우울증과 시냅스 크로스 토크의 질문을 해결하기 위해 수 있습니다. 각종 질문은 토닉과 phasic 터미널 postsynaptic 대상에서 postsynaptic 수용체의 밀도와 글루 탐 산염 수용체 subtypes의 차이가 있는지 여부,이 준비에서 해결될 수 남아 있지만, 이들의 해부 및 생리학의 근본적인 차이에 대한 이해 이 모터 단위보다 깊은 지식 기반을 구축에 도움이됩니다. 희망이 시냅스 준비에서 배운 기본 원리는 다양한 준비의 다른 시냅스 적용되며 왕새우이 시냅스 모델의 향후 조사를 강화 것입니다.

2) 방법

모든 실험은 중견 왕새우 (Procambarus clarkii)의 첫 번째 또는 두 번째 도보 다리에 실시하고 있습니다. 동물 개별적으로 oxygenized 물로 플라스틱 용기에 보관되어 있습니다. 동물 실의 온도는 13 ° C - 16 ° C.의 범위에 동물은 주간 단위로 변경 건조 물고기 음식과 물을 공급하고 있습니다.

그림 1 : 왕새우 걸을 수있는 다리와 여섯 말초 세그먼트의 도식.
크레이 피쉬에서 걸을 수있는 다리의 말초 측면은 해부학적인 몸의 구조 여섯 세그먼트 (그림 1)으로 나뉘어져 있습니다. 다리 신근는 meropodite에 위치하고 있으며, 격리 될 신경 번들 meropodite ischiopodite 공동 가까운입니다. 토닉이나 phasic 축삭은 선택 N으로 자극될 수그들이 노출된 후 생리 목적 eeded.
일이 그렇게되면서, 쿠퍼와 쿠퍼 (2009) meropodite 지역 내에서 따개 모터 신경 세포의 excitor를 노출위한 메소드를 포함하여 초기 절개의 일부 측면을 설명하지만, 그들의 설명은 손상에서 신근 근육을 보호하는 데 필요한 치료를 제공하지 않습니다 따개 근육 준비를 해결하기 위해 필요하지 않습니다. 신근를 보호하기 위해, 첫 번째 또는 두 번째 도보로 다리를 강제 곤란으로 다리를 automize하는 동물을 유도하여 신체 길이 6-10센티미터 (아차 팔 라야 생물학 공급 주식 레이스 랜드, LA)를 측정, 왕새우에서 제거 ischiopodite 세그먼트의 파괴 비행기로 말초. 다리는 측면 (바깥 쪽) 뷰어 직면하고있는 해부 접시에 배치됩니다. 뷰어 밖에 (측면 사이드) (그림 2) 일반적으로 아치형 측면과 함께, 해부 접시에까지 직면하고 있는지 수있을 때까지 다리를 주위에 켜집니다. 조직 종이에 다리를 놓는 것은 이러한 상처를 제작하면서 쉽게 준비를 돌려 수 있습니다.

그림 2 : 일반적으로 meropodite의 측면쪽으로 아치되는 측면은 해부 접시에 직면하고있다.
메스 블레이드 차단기 및 홀더로 날카로운 면도날 방금 meropodite 세그먼트에 대한 그림 3에 표시된 패턴을 통해 절단까지 에칭 표피하는 데 사용됩니다. 케어는 meropodite - carpopodite 공동으로 복부 잘라 지느러미에 너무 멀리 말초를 잘라하지 않도록합니다.

그림 3 : 표피의 창 밖으로 에칭을위한 제안 패턴으로 라인 meropodite 세그먼트.

준비는 호수에 배치됩니다. 해부 접시는 바닥에 Sylgard (다우 코닝) 코팅 (1cm 두께)가됩니다. Sylgard는 곤충 핀이 아직 준비를 쥐고 그 안에 갇혀 수 있도록하는 데 사용됩니다. 이 시점에서, 핀은 carpopodite 세그먼트의 중간과 ischiopodite 부문 (그림 4)의 지느러미 부분에 붙어있다. 해부 준비는 표준 크레이 피쉬 호수에서 목욕을 205 NaCl로 만든 반 Harreveld의 솔루션 (1936)에서 수정, 5.3KCl, 13.5 CaCl _2; 2 시간 ₂ O, 2.45 MgCl _2; 6H ₂ O, 5 HEPES 및 조정 산도 7.4 (MM)입니다.

그림 4 : 컷 창문 meropodite 세그먼트에서 해제되고. 해부 핀의 위치를 적어 둡니다.
표피는 부드럽게 말초 지역에서 해제되고 근육 섬유는 다리의 기본 방향으로 스트로크를하여 표피부터 버려야합니다. 표피는 떠낸 수 있습니다.
apodeme (힘줄)은 meropodite - carpopodite 관절을 절단합니다. PIN은 상처가 (그림 5) 만들 수있는 곳을 표시하기 위해 flexor의 힘줄의 내부 표면에 위치합니다. 그것이 핀셋과 flexor 근육, 꼬리 방향으로 (그림 6)에 올려서 주요 다리 신경 및 신근 근육을 노출하여 뽑아가 얽혀있는 어디에 있었 힘줄 다음 슬쩍입니다.

그림 5 : flexor 근육의 apodeme가 핀과 flexor에서 생기죠으로 강조 표시됩니다.

그림 6 : 기본 다리 신경을 손상하지로 flexor 근육의 apodeme는 절단 신경을 써서 제거됩니다.
주요 다리 신경은 meropodite - carpopodite 관절을 잘라 조심스럽게 신근 근육을 통해 다시 가져온 것입니다. 근육의 내측 표면은 본 연구 전반에 걸쳐 사용됩니다. 주요 다리 신경에서 신근 근육에 신경의 분리는 부드럽게 준비의 측면으로 기본 다리 신경의 말초 그루터기를 당겨 강화 수 있습니다. 신근 근육을 통해 다시 기본 다리 신경을 필링 때, 축삭의 작은 가지는 절단해야 할 수도 있습니다. 이들은 억제 모터 신경 세포에서 신근 근육에 지점이 있습니다. meropodite의 근위 끝 근처의 주요 다리 신경에서 출발 분기 큰 번들 관심의 작은 신경 다발이다.

그림 7 : 주요 다리 신경이 절단 및 근위 방향으로 끌고 있습니다.

이 신경 다발은 메틸렌 블루 염색법 (그림 8) 또는 함께 볼 수있는 4 - 디 - 2 - ASP 형광 얼룩 (그림 9).

그림 8 : 메틸렌 블루있는 신근 근육 얼룩. 축삭 분기 및 신경 내에서 두 쉽게 볼 수 axons를 적어 둡니다. 빨간색 화살표 demark 신경 추적합니다.

그림 9 : 4 - 디 - 2 - ASP와 모터 신경 자국의 axons. 토닉의 축삭 인해 증가 mitochondrial 콘텐츠를 더 밝게 볼 수 있습니다.

그림 10A : 4 - 디 - 2 - ASP 물들일 phasic와 토닉 뉴런의 개인 단말기. 토닉 터미널 및 phasic 터미널의 얇은 성격에 varicosities을 확인합니다.

그림 10B - 토닉 지적

그림 10C - Phasic 지적

3) 생리 프로필

근육의 세포 잠재력을 모니터링하는 동안 토닉이나 phasic 뉴런의 흥분성의 postsynaptic 잠재력 (EPSPs)를 관찰, 신경 번들의 고립 axons 중 하나 (존스톤 그라스 자극기에 연결된 흡입 전극 (그림 11)에 의해 자극됩니다 외., 2008). 70 Hz에서에서 자극이 낮은 출력 NMJs에 대한 촉진 응답을 촉진하기 위해 토닉의 축삭에 적용하거나, 하나의 펄스가 (1 Hz에서) 높은 출력의 큰 EPSPs을 얻기 위해 phasic 축삭에 적용으로 표시 NMJs 그림 12인치 EPSPs는 PowerLab/4s 인터페이스를 통해 컴퓨터에 기록됩니다.

그림 11 : 신경 번들 내에서 하나의 축삭을 통해 배치 자극 전극. 2 주 axons을 요약 녹색 라인을합니다.

그림 12 : 레코딩 얻은 세포로 토닉이나 phasic 뉴런의 Postsynaptic 가능성 (EPSPs).
시냅스 촉진과 시냅스 우울증의 성격에 조사가 낮은 높은 출력 NMJs 다양한 실험 패러다임으로 접근하실 수 있습니다. 낮은 출력 NMJs의 촉진은 약 20 자극 (그림 13)의 20, 40 및 60 Hz에서 펄스에 대한 표시, 주파수에 따라 달라집니다.

그림 13 : 세 가지 주파수 20, 40 일반 크레이 피쉬 호수에서 60 Hz에서에서 주어진 자극 펄스의 기차에 대응 EPSPs.
자극의 주파수로 시냅스 우울증의 비율도 높은 출력 NMJs 관련되어 있습니다. 그림 14은 30 분 이상 NMJ을 누르 자극의 연속 5 Hz에서를 보여줍니다. 높은 자극 주파수로 준비 (Bradacs 외., 1997)보다 신속하게 우울하게합니다.

그림 14 : 우울증 유발하는 5 Hz에서 자극 동안 phasic 응답의 EPSP 진폭.

4) Quantal 응답

크레이 피쉬 (쿠퍼와 쿠퍼, 2009)의 따개 근육에 대해 설명한 것과 유사한 절차는이 준비하는 데 사용됩니다. 직접 신경 단말기의 식별 지역 이상 quantal EPSPs은 중요한 염료 4 디 - 2 - ASP (5 μm의, 5 분 치료, 쿠퍼 동부 표준시와 시각 신경 varicosities에 매크로 패치 기록 전극의 루멘을 배치하여 기록됩니다 알, 1995;. Magrassi 외, 1987).. 자연뿐만 아니라 evoked quantal 반응은 신경 단말기 함께 기록할 수 있습니다. evoked과 자발적인 시냅스 잠재력은 매크로 패치 전극 (Dudel, 1981; Wojtowicz 외, 1991;. Mallart, 1993)로 기록됩니다. Kimax 유리 (외경 : 1.5 mm)이 가져온 10에서 20 μm의 (그림 15)에 이르기까지 내부 직경과 패치 조언을 생산하는 화재 - 연마했다.

그림 15 : 매크로 패치 기록 전극의 루멘.

전극의 루멘은 목욕 매체로 가득 차 있습니다. 앰프는 위에서 언급한 세포 레코딩에 사용되는 것과 동일합니다. 전극과 인감 저항은 전극을 통해 시험 전류 펄스를 전달하여 결정하실 수 있습니다. 우리의 실험에서, 씰 resistances는 0.3에서 1.0 MOhm로 원거리 및 전극 저항은 0.5에서 1.0 MOhm로 원거리. 시일 저항은 녹화 내내 모니터링할 수 있습니다.
quantal 사건의 직접 계산이 낮은 자극 주파수 가능합니다. 각 evoked 회신을 원하시면 quantal 이벤트의 수를 쉽게 낮은 출력 단자 (그림 16)에 대한 결정하실 수 있습니다. 이러한 직접적인 계산은 의미 quantal 콘텐츠 (.; 쿠퍼 외, 1995 델 카스 틸로 & 캐츠 1954)을 예측할 수 있습니다. evoked 높은 출력 NMJs 멀티 quantal evoked 행사 자발적인 사건의 평균 최대 진폭 또는 지역과 함께 deflections의 평균 진폭이나 지역, 생산 이후 appro하는 데 사용할 수 있습니다평균 quantal 콘텐츠 (쿠퍼 외., 1995) ximate.

그림 16 초점 흔적이 phasic와 토닉 NMJ에서 기록했다.

그림 17

Discussion

우리는 해부하다하는 방법, 기록 및 모두 높은 낮은 출력 단자가 동일한 근육 섬유를 신경을 분포시키다있는 독특한 왕새우 신경근육학 준비 신경 반응을 계량이 보고서에서 증명하고있다. 크레이 피쉬의 신경근육학 준비는 몇 흥분성의 모터 뉴런은 근육 신경을 분포시키다하는 데 필요한 있기 때문에, 척추 신경근육학의 분기점 이상의 많은 장점을 제공하고, 뉴런은 준비에서 준비 (앳우드, 1976)로 식별되기 때문입니다. 또한, 흥분성의 신경 전달 물질이 글루 탐 산염이고, 흥분성의 postsynaptic 잠재력 (EPSP)이 등급되며 따라서 등급 사건의 biophysical 특성은 척추 동물의 CNS 내의 뉴런의 dendrites 유사합니다. quantal 조류 그러나, postsynaptic 사이트 (쿠퍼 외., 1995)에 직접 모니터링할 수 있습니다.

phasic 신경의 반복 5 Hz에서 자극은 크게 몇 분 후에 우울이 될 큰 EPSPs에 상승을 제공합니다. 우울증의이 유형은 arthropod phasic 신경근육학 분기점 (라이언과 쿠퍼, 1996)에 일반적입니다. phasic 단말기와 함께 토닉 단말기의 존재는 하나가 postsynaptic 대상이 크게 phasic 모터 신경 세포의 대공황 도중 및 이후 수정 여부를 평가할 수 있습니다. (; 데자 - 샤와 쿠퍼, 2009. 데자 - 샤 외, 2008) 또한, 낮은 출력 단자는 시냅스 촉진을 기초 메커니즘을 조사하기 좋은 준비를 제공합니다

높은 출력 단자는 시냅스 우울증과 복구 프로세스의 속도에 변조를 조사하기 위해 플레이 그라운드를 제공합니다. 접근 및 가능한 준비가 시냅스 우울증 뒤에 메커니즘을 해독에 도움이 될 것입니다. 이 크레이 피쉬 다리 신근 준비에서 세로토닌의 외인성 응용 프로그램이 시냅스 시냅스 소포 우울증과 풀의 동원에 대한 조사를 발전시키는 잠재적인 수단의 복구를 조사하는 또 다른 도구입니다. 각 근육 섬유 phasic와 토닉 모두 모터 뉴런에 의해 innervated되므로이 준비, 몇 가지 실험 이점을 제공합니다.

세로토닌은 evoked 자극과 함께 출시되는 vesicles의 수를 증가하고 우울증 동안 회복을 촉진 때문에, 그것은 세로토닌의 현재와 융합의 가능성을 향상을위한 소포의 수영장 중 일부 변조가있다는 것을 분명하기 때문에 (존스톤 외., 2008 ; 록스든 외, 2006;. 스파크 외, 2004).. 로 우울한 상태로 반대 저주파 자극, 동안 presynaptic 신경 터미널 내에있는 소포의 수영장의 역학을 설명할 것입니다 모델은 또한 준비 가능 다양한 실험 프로토콜 중 고려해야합니다.

. Tsien 외, 그것은 재활용 vesicles의 나머지 endoplasmic reticulum (하라타 외, 2001을 통해 전통적인 느린 재활용 경로를 통해 이동 반면 소포 수영장의 약 30 %가, 빠른 재활용을 거쳐 다른 시스템에서 언급되었습니다. , 2001). 이러한 이중 경로 또한이 시스템에 나타날 수 있습니다. ATP는 다음 presynaptic 터미널의 우울 상태에서 부족한 도킹 및 undocking 경우가 발생되지 않을 수도 있습니다, 따라서, 더 많은 하역 vesicles은 시냅스 표면에 남아있는 것입니다. 터미널이 5 HT에 노출된 경우보다 vesicles이 빠르게 출시 이후, 그것은 더이 쉽게 releasable 수영장 (RRV) 내에 포함되는 가능합니다. 그러나, 우울 상태, 감소 ATP와 도킹 및 undocking가도 다시 시냅스 표면에서 언로 드 vesicles을 떠난 다섯 HT의 존재에 차단될 수 있습니다. 예비 데이터는 더 많은 vesicles이 연장 5 HT 노출과 자극, 다시 릴리스 능력 vesicles을 (존스톤 외에서 할 괴상한 수있는 빠르고 느린 재활용 경로에서 소포 수영장의 분포로 시간의 경과에 릴리스하는 것이 좋습니다 때문에. 2008;. 리뷰 - 데자 - 샤 외, 2008 참조; 데자 - 샤와 쿠퍼 2009)

postsynaptic 전류와 모터 신경 단말기의 정의 지역에서 하나의 콴타 조치의 초점 macropatch 레코딩의 기술로, 하나는 시냅스 우울증이 출시되고 적게 vesicles의 결과 또는 때문에 기능의 변경의 발생 여부를 확인하는 질문을 할 수 postsynaptic 수용체의. 그것은 vesicles가 동등한 칼슘 노출이 준비 phasic NMJ에서 융합으로 더 민감한 것을 표시되었습니다 (밀러 외. 2005 년), 높은에 대한 가능성이 계정 phasic 터미널 (Msghina 외의 quantal 내용을 의미하는. , 1998, 1999). 또한, 칼슘 결합 단백질 frequenin의 차이 (Jeromin 외., 1999)와 ultrastructure (킹 외., 1996) 차동 시냅스 효능 (쿠퍼에 기여외., 2003).

(.; 쿠퍼 외, 2003. Bradacs 외, 1997) 일부 이전 연구 신근 근육 섬유의 근육 표현형을 살펴 보았다. 혼합 섬유 종류에 왕새우의 순수 토닉 및 phasic 섬유 종류의 근육 분화의 규정을 비교, 듈리 innervated있는 다리 신근에 대한 같은 근육 표현형 발현 및 조절 (라프 램 보이즈 외, 2000 실마리를 제공할 수;. 손 동부 표준시 알, 2000;. 그리피스 외, 2001;. Mykles 외, 2002)..

많은 근본적인 질문 신경 생물학에서 해결될 수 남아이 준비 그들 중 일부를 태클에 도움이됩니다. 다리의 신근을 가지고 접근할 수도 분야에 관심이 오늘날의 몇 가지 주제는 다음과 같습니다 : 1) (우울증 Ca2의 감소로 인해 높은 출력 단자 사이 시냅스 우울증 기초 세포 메커니즘을 결정 + 항목, 유능한 부족 쉽게 releasable 소포 (RRV) 수영장, 및 / 또는 변경 postsynaptic 감수성?) 2) 빠른 복구, 3을 홍보하기 시냅스 우울증의 유도 후 적용하면 5 - HT의 기계론의 역할을 결정)은 결정 여부 quantal의 모양 자극 phasic 터미널에서 발생하는 전류는 시냅스 우울증의 사전 및 사후 시냅스 구성 요소를 해결하기 위해 우울증의 유도 기간 동안 변경되고 있습니다.

이 릴리스 사이트에서 직접 측정으로 시냅스의 성능 부하의 메커니즘을 주소 관련 정보를 얻기 위해 우리를 수 있기 때문에이 NMJ는 지속적인 연구와 미래를 수사하는 것이 중요합니다. 이 분야의 현재 연구는 5 - HT 및 소포의 수영장의 역학에 의해 시냅스 우울증 변조에 대한 정보를 제공하고 있습니다. 모든 신경 시스템에 관련된 시냅스 전달의 근본 기초와 관련이 그러한 주제.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 사설 도움 씨 크레이그 D. 슬레 이븐 (영어학과, 켄터키 대학) 감사합니다. 켄터키 대학, 생물 학부, 학부 연구과 예술 & 과학 대학 사무실에서 지원됩니다.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
Standard crayfish saline:
- Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl₂2H₂O; 2.45 MgCl₂6H₂O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4
Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode.
Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
Chemicals:
- We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.