Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Membraan Potentials, Synaptic Responses, neuronale circuits, Neuromodulatie en Muscle Histologie Met behulp van de rivierkreeftjes: Student Laboratorium Oefeningen

Published: January 18, 2011 doi: 10.3791/2322
Automatic Translation
*1, *1, *2, *1
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

De experimenten tonen aan een eenvoudige benadering voor studenten om ervaring op te doen bij de behandeling van spier-structuur, de synaptische reacties, de effecten van de ion gradiënten en permeabiliteit op membraan mogelijkheden. Ook is een zintuiglijke-CNS-motor-spier circuit voorgelegd aan een middel om effecten van de verbindingen op een neuronale circuit test tonen.

Abstract

Het doel van dit rapport is om een ​​inzicht in de effecten veroorzaakt door ion gradiënten een biologisch membraan te ontwikkelen. Twee aspecten die een cel membraan mogelijke invloed en die wij te pakken in deze experimenten zijn: (1) Ion concentratie van K + aan de buitenkant van het membraan, en (2) de permeabiliteit van het membraan voor specifieke ionen. De rivierkreeft buik extensor spieren zijn in groepen waarbij sommige tonic (langzaam) en anderen fasisch (snel) in hun biochemische en fysiologische fenotypes, alsook in hun structuur, de motorische neuronen die deze spieren innerveren zijn navenant verschillend in functionele kenmerken. We maken gebruik van deze spieren als de oppervlakkige, tonic buik flexor spier om eigenschappen aan te tonen in de synaptische transmissie. Daarnaast introduceren we een zintuiglijk-CNS-motorneuron-spier circuit om het effect van cuticulair zintuiglijke stimulatie, alsook de invloed van de neuromodulatoren te tonen inzake bepaalde aspecten van het circuit. Met de technieken verkregen in deze oefening, kan men beginnen met vele vragen die nog in andere experimentele preparaten en in fysiologische toepassingen in verband met geneeskunde en gezondheid te beantwoorden. We hebben aangetoond dat het nut van het model ongewervelde voorbereidingen om fundamentele vragen die relevant zijn voor alle dieren te pakken.

Protocol

1. Introductie

Het doel van deze praktische oefeningen worden om de eigenschappen van prikkelbaar membranen, de ionische basis van de rust membraanpotentiaal, en methoden te begrijpen aan het membraan potentieel te meten. Daarnaast is beitsen en histologie van de spier gepresenteerd, die gebruikt kan worden om spierstructuur onderwijzen. Ook zijn twee verschillende soorten ontleed preparaten, gebruikt om de eigenschappen van de synaptische transmissie aan te tonen in de verschillende spiergroepen. Een complete zintuiglijke-centrale zenuwstelsel (CZS)-motor neuron-spier circuit in de rivierkreeft buik wordt ook gebruikt om een ​​bereiding presenteren aan zintuiglijke stimulatie en de invloed van neromodulators en neurotransmitters op aspecten van een circuit te onderzoeken.

Het eerste deel van dit rapport presenteert de benaderingen gebruikt om de rust membraanpotentiaal en de invloed van extracellulaire K + op membraan potentieel te meten. We zullen ook introduceren spier structuur. In het tweede deel van deze oefening, presenteren we verschillende manieren van meten van synaptische reacties van verschillende soorten neuromusculaire verbindingen (NMJs). De eerste oefening maakt gebruik van de rivierkreeft buik extensor spieren en de tweede maakt gebruik van de buikspieren oppervlakkige flexoren. Daarnaast presenteren we een neuraal circuit (de ventrale zenuw snoer van de rivierkreeft met sensorische input en motorische output), dat is gemakkelijk te onderhouden, en die kunnen worden gebruikt voor het onderwijs als voor onderzoek in verschillende aspecten van een zintuiglijke-CNS -motor neuron-spier circuit. Na het voltooien van de uitleg van de eerste oefeningen, presenteren we de fysiologie van NMJs en CNS circuit.

Het ion gradiënt over een biologisch membraan kan resulteren in een potentiaalverschil. Voor een cel in rust is, is dit verschil in elektrische lading over het celmembraan bekend staat als rustplaats van de cel membraan potentieel. Er zijn twee belangrijke factoren die we zullen die van invloed zijn adres van een cel membraan potentieel. De eerste is de ion concentratie aan beide zijden van het membraan. De tweede is de ionische doorlaatbaarheid van het membraan. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat er in een levende cel zijn er een aantal verschillende ionen met verschillende concentraties binnen en buiten de cel. De belangrijkste ionen zullen wij het ​​adres zijn natrium (Na +), kalium (K +) en chloride (Cl-). De hoeveelheden en de bewegingen van deze ionen door een spier membraan bepaalt de membraanpotentiaal. Vanuit deze basis kunnen we het adres elektrische potentialen waargenomen tijdens elektrische excitatie en inhibitie van een membraan van de synaptische reacties en onderzoekt de effecten van farmacologische middelen. We kunnen ook bouwen biofysische modellen om deze processen te vertegenwoordigen experimentele test concepten (Robinson et al.., 2010).

Het gebruik van glazen capillaire micro-elektroden maakt het opnemen van membraan mogelijkheden. De elektrode kan worden ingebracht door het celmembraan zonder schade, het verstrekken van de tip is klein genoeg en een nauwkeurige meting van de transmembraan potentieel kan worden verkregen. De techniek is in het bijzonder van toepassing op grote cellen, die minder snel beschadigd worden door het inbrengen van de intracellulaire elektrode. Dit is een van de essentiële technieken in de fysiologie.

Het saldo van Na + en K + over het membraan wordt onderhouden door de Na-K-ATPase pomp onder fysiologische omstandigheden. Onder normale omstandigheden is de pomp beweegt, gemiddeld drie Na + uit de cel en twee K + in de cel. Als een terzijde, was een Nobelprijs voor scheikunde toegekend in 1997 voor deze ontdekking weer gemaakt in de late jaren 1950. De fundamenten van de ontdekking werden verkregen uit onderzoek met behulp van axonen van een krab (Skou, 1965, 1998).

Deze pomp wordt ook beschouwd elektrogene omdat het een groter vermogen op te pompen als het membraan is gedepolariseerd (Skou, 1989a, b). In veel cellen, de pomp versnelt wanneer een cel elektrisch wordt geactiveerd door depolarisatie.

Kalium kan ook verplaatsen door middel van kalium "lekken" kanalen, terwijl een cel is in een rusttoestand. Door deze lekken kalium kanalen, het celmembraan in rust is meer doorlaatbaar voor kalium dan aan andere ionen. Zo, de cel rust membraanpotentiaal dichter bij het evenwicht potentieel voor kalium dan voor natrium. De rust membraanpotentiaal kan dan worden onderzocht om te zien of het hangt af van het kalium evenwicht potentieel.

1) Muscle variabiliteit

Schaaldieren spiervezels vertonen een grotere variabiliteit van de structurele kenmerken, membraan elektrische eigenschappen en contractiele eigenschappen dan doen gewervelde spiervezels. Fasisch spiervezels in schaaldieren zijn aangepast voor twitch-type contracties. Ze worden gekenmerkt door korte sarcomeer lengte (2-4 micron), dun, recht Z-lijnen, een lage verhouding van dun naar dik myofilamenten, en goed ontwikkelde systemen van T-tubuli en sarcoplasmatischreticulum. Fasisch spiervezelmembranen kunnen genereren gesorteerd of alles-of-niets actie potentialen. Tonic spiervezels, aan de andere kant, zijn aangepast voor langdurig onderhoud van de spanning. Ze hebben vaak sarcomeer lengte van 10 tot 15 micron, dik, golvend Z-lijnen, een hoge verhouding van dun naar dik myofilamenten, en minder goed ontwikkelde systemen van T-tubuli en sarcoplasmatisch reticulum. Tonic spiervezelmembranen zijn vaak elektrisch inexcitable, of ze kunnen produceren gegradeerd elektrische reacties ("gegradeerde spikes"). Een breed scala van tussenliggende soorten vezels is te vinden in schaaldieren spieren.

2) vergelijkingen

Vergelijkingen, die algemeen worden gebruikt voor het evenwicht potentieel van een ion en rust membraanpotentiaal bepalen zijn de Nernst-vergelijking en de Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) vergelijking respectievelijk. Een belangrijk onderscheid tussen de twee vergelijkingen is dat de Nernst vergelijking alleen wordt gebruikt voor een specifiek ion het evenwicht potentieel voor dat ion te bepalen, terwijl de GHK vergelijking wordt gebruikt om de rustpotentiaal te bepalen door te kijken naar de permeabiliteit van meerdere ionen en hun gradiënten een celmembraan (Nernst, 1888, 1889, Goldman, 1943; Hodgkin en Huxley, 1952; Hodgkin et al., 1952;. Hodgkin en Katz, 1949, zie Hille, 1992).

De Nernst-vergelijking is over het algemeen in aanmerking voor ionen door een membraan het genereren van een elektromotorische kracht zoals gewoonlijk weergegeven als:

V = (RT / ZF) ln ([X] uit / [X] in)

X = ion van belang
V = evenwicht spanning voor de X-ion over het membraan
R = gasconstante [8,314 J / (mol • K)]
T = absolute temperatuur [Kelvin]
Z = valentie van het ion
F = van Faraday constante [9.649 x 10 4 C / mol]

Voor de K + ion bij 20 ° C en de transformatie van Ln op 10 Log samen met het invullen van de constanten, komt men uit op:

Potentiële = 58 log ([K in] / [K out]), uitgedrukt in mV

Laten we aannemen dat alleen K + is permeant door diffusie. [K in] is de K + concentratie op de binnenkant van de cel en [K uit] is de K + concentratie op de buitenkant van de cel.

Als een oefening schatting [K in]. ______________

Nemen voor deze berekening, membraanpotentiaal is alleen afhankelijk van de K + evenwicht potentieel.

Gelet op de [K out] = voor de gebruikte zoutoplossing 5,4 mM. Ook nemen membraanpotentiaal is-70mV.

Potentiële = 58 log ([K in] / 5,4).

In het experiment zullen we meten een cel rust membraanpotentiaal en bepalen hoe deze wordt beïnvloed door het veranderen van [K uit]. De helling van de hypothetische lijn met betrekking membraanpotentiaal en [K uit] is 58. Na het verzamelen van gegevens over de rust membraanpotentiaal op verschillende [K out] (bereik van 5,4 mm tot 100 mm) zullen we plot van de vastgestelde waarden om te bepalen of er een match is met de hypothetische lijn. We zullen gebruik maken van de gemiddelde rust membraanpotentiaal verkregen bij 5,4 mM [K uit] voor de inleiding van de hypothetische en waargenomen lijnen voor vergelijking.

Gezien het feit dat een membraan kan doorlaatbaar voor meer dan een ion in rust, evenals op diverse gedepolariseerd staten, een maakt gebruik van de GHK vergelijking rekening te houden met de doordringbaarheid (P in de vergelijking) voor de verschillende ionen. De GHK vergelijking zal verminderen om de Nernst-vergelijking als een membraan doorlaatbaar voor slechts een ion.

Hier is een algemene GHK vergelijking voor Na +, K + en Cl - ionen:

Vergelijking

Sinds Cl - heeft een negatieve lading, is de concentratie term omgekeerd in deze vergelijking voor de binnen en buiten. Hierdoor kan de Z (ion betaling) te worden gestopt.

3) Doel van deze oefening

In dit experiment zullen we het meten van de membraanpotentiaal van een rivierkreeft spiercel en toepassen van de principes hierboven besproken aan te pakken:

  1. Hoe maak je een celmembraan potentieel met de juiste instrumenten en techniek te meten.
  2. Ion permeabiliteit van de spier celmembraan en hoe het bijdraagt ​​aan het membraan potentieel.

    Daarnaast maken we een voorstudie van de spier structuur:
  3. Gebruik vlekken aan de anatomie van de spieren in het dorsale aspect van de rivierkreeft buik, die wordt gebruikt voor de uitvoering van deze elektrofysiologische experimenten te markeren.
  4. Onderzoek de histologie van de verschillende soorten spiervezels.

In dit laboratorium uit te oefenen, zullen we gebruik maken van de rivierkreeft buikspieren extensor spieren. Dit preparaat is in het verleden gebruikt om deze principes in de fysiologie te leren eend anatomie (Atwood en Parnas, 1968). We hebben gebruikt veel van de procedures uit deze bron en gewijzigd anderen de huidige instrumentatie vangen en om de doelen te voltooien in een 3 uur student laboratorium periode. Deze oefeningen zijn een basis voor andere experimenten die in de Animal Physiology cursus in het departement Biologie aan de Universiteit van Kentucky (Instructeur dr. RL Cooper, 2010).

4) Waarom dit model dier

Er zijn verschillende goede redenen voor het gebruik van de rivierkreeft buikspieren extensor spieren in dit experiment:

  1. Rivierkreeft zijn algemeen verkrijgbaar en zijn relatief goedkoop en gemakkelijk te onderhouden in het laboratorium omstandigheden.
  2. De dissectie is relatief eenvoudig voor studenten leren dissectie technieken voor live preparaten.
  3. De spier is stabiel gedurende enkele uren in een minimale fysiologische zoutoplossing die goed dient voor de studenten te leren elektrofysiologische technieken. De spier voorbereiding is vrij robuust wanneer externe [K +] is aangepast te worden voor korte perioden.
  4. Verschillende synaptische reacties gemakkelijk kunnen worden verkregen door het stimuleren van motorische neuronen.
  5. De anatomische plaatsing van de strekspieren is gemakkelijk te onderscheiden, en door hun grote omvang is het relatief eenvoudig om een ​​stabiele intracellulaire opnames te verkrijgen.
  6. De spieren en de innervatie patroon kan gemakkelijk worden waargenomen met methyleenblauw kleuring. Bovendien kunnen bepaalde soorten spiervezels gemakkelijk worden verwerkt voor histologie aan de sarcomeer structuur te observeren.
  7. Geen enkel dier protocollen zijn nodig in deze tijd voor de ongewervelde dieren preparaten in het laboratorium experimenten in veel instellingen binnen de Verenigde Staten.

2. Methoden

1) Materialen

  • Schaar (1)
  • Pincet (1)
  • Zilver Draad voor aardingsdraad (1)
  • Microscoop (1)
  • Electrode Probe (1)
  • Petrischaal met Sylgard op de bodem (1)
  • Zoutoplossing (1)
  • Kalium Solutions: 5,4 (fysiologische zoutoplossing), 10, 20, 40, 80, 100 mM
  • Bleach (klein bedrag, te gebruiken voor de top van de zilveren draad naar Ag-Cl te bouwen)
  • Glazen pipet (1), te verwijderen en toe te voegen oplossingen
  • Spuit (1)
  • Versterker / Acquisitie Systeem (1)
  • Kooi van Faraday (1)
  • Desktop / Laptop (1)
  • Dissectie pinnen (4)
  • Rivierkreeft

2) Methods

2.1) Voorbereiding / Dissection:

  1. Een rivierkreeft ongeveer 6-10 cm in lengte moet worden verkregen (of een beheersbare omvang). Houd de rivierkreeft aan de achterkant van het hoofd of ongeveer een centimeter aan de achterkant van de ogen. Zorg ervoor dat de klauwen van de rivierkreeftjes of zijn mond niet kan de individuele behandeling van de rivierkreeft te bereiken. (De rivierkreeft kan worden geplaatst in gemalen ijs gedurende 5 minuten voorafgaand verdoven het aan het afsnijden van de kop.)
  2. Gebruik de grote schaar om snel te verwijderen het hoofd. Maak een schoon en snel snijden van achter de ogen van de rivierkreeft. Beschikken over de kop en appendages.
    Figuur 1
    Figuur 1. Afbeelding toont plaatsing van de snede aan het hoofd van de rivierkreeft te verwijderen.
  3. De poten en scharen van de kreeft kan worden verwijderd op dit punt om verwondingen te voorkomen. Stiletten op mannen en swimmerets op zowel mannen als vrouwen kunnen ook worden verwijderd (figuur 2). Vervolgens scheiden de buik van de thorax. Maak een snede langs het articuleren membraan dat de buik en thorax (figuur 3) sluit zich aan. Sla de buik gedeelte van de rivierkreeft en gooi van de thorax.
    Figuur 2
    Figuur 2. De schaar is het snijden van de stiletten. Deze kunnen worden verwijderd uit de rivierkreeft.
    Figuur 3
    Figuur 3. Beeld toont de plaatsing van de snede om de borstkas te verwijderen uit de buik.
    Figuur 4
    Figuur 4. Verwijdering van de thorax van de buik. De snede moet worden gemaakt in circulaire manier langs de lijn in het samenvoegen van de segmenten.
    Figuur 5
    Figuur 5. De bovenste afbeelding toont de buik met swimmeret aanhangsels. Onderste afbeelding toont de buik zonder de swimmeret aanhangsels.
  4. Met de buik, moet een verlaging van worden gemaakt in de schaal langs de onderste, laterale rand van elke zijde van de buik. Zorg ervoor dat u niet te diep gesneden in de rivierkreeft. Om u te helpen in het proces van het snijden van de schaal, moet de snede worden gemaakt met de schaar wijst verwaarlozing omlaag naar de ventrale zijde en onder een hoek. Volg de natuurlijke shell patroon van lijnen van de rivierkreeft dat de lengte van elk segment (figuur 6) uit te voeren.
    Figuur 6
    Figuur 6. Schaar worden geplaatst onder een hoek en volgt de natuurlijke afstemming van de schelp. Niet gesneden te diep en te vernietigen de bereiding. De pijlpunten wijzen op de natuurlijke lijn langs elk segment die moeten worden gevolgd voor de bezuinigingen.
  5. Verwijder het ventrale deel van het reservoir. Zorg ervoor dat u de buikspieren te vernietigen. Een tang om het ventrale gedeelte te verwijderen. Wanneer het ventrale deel van het reservoir is verwijderd, kan een witte massa van weefsel te zien op de top van de diepe flexoren. Dit weefsel kan voorzichtig worden verwijderd met een pincet.
    Figuur 7
    Figuur 7. Verwijderen van de ventrale deel van het reservoir met een tang. Trek Lara omhoog en terug op het ventrale gedeelte te verwijderen. Niet vernietigen spieren onder de ventrale shell.
    Figuur 8
    Figuur 8. Trekken terug op het ventrale deel van het reservoir dat moet worden weggegooid.
    Figuur 9
    Figuur 9. Snijd het ventrale gedeelte van het preparaat met een schaar en gooi deze weg.
  6. Het maagdarmkanaal, een buisje langs de middellijn van het diepe flexoren, kunnen worden verwijderd uit de rivierkreeft. Knijp de bovenkant van het contract met de pincet en weg te trekken van de buik. Snijd de onderkant van de luchtwegen - aan het einde van de staart. Spoel de dissectie met een zoutoplossing om ervoor te zorgen de fecale afval niet interfereert met de voorbereiding.
    Figuur 10
    Figuur 10. Afbeelding toont het verwijderen van het spijsverteringskanaal van de voorbereiding.
  7. Gebruik dissectie pinnen aan de voorbereiding vast aan de petrischaal. De bovenste en onderste hoeken van het preparaat moet worden vastgepind aan het gerecht. Zoutoplossing oplossing dient te worden gegoten in de petrischaal en volledig betrekking op de voorbereiding tot de intracellulaire opnames worden uitgevoerd.
    Deze dissectie gerecht moet een Sylgard (Dow Corning) coating aan de onderkant (1 cm dik), zodat insecten pinnen kunnen worden geplakt in.
    Ontleed voorbereidingen badend in standaard rivierkreeft zoutoplossing, gewijzigd uit de oplossing van Van Harreveld's (1936), die is gemaakt met 205 NaCl, 5.3KCl; 13,5 CaCl 2; 2H 2 O; 2,45 MgCl 2; 6H 2 O, 5 HEPES en ingesteld op een pH 7,4 (in mm).

2.2) Intracellulaire opnemen

Figuur 11
Figuur 11. In het algemeen opzet van het controleapparaat.

  1. De petrischaal met de voorbereiding moeten worden geplaatst onder de microscoop en vastgezet met was op de bodem van de schaal om beweging te voorkomen.
    Figuur 12
    Figuur 12. De plaatsing van het preparaat onder de microscoop. Gebruik wax om de petrischaal en voorbereiding veilig te stellen.
  2. Twee draden elk met een korte lengte van zilveren draad aan het ene uiteinde moet worden verkregen. De zilveren draad moet worden ondergedompeld in een kleine hoeveelheid bleekmiddel voor ongeveer 20 minuten om een ​​Ag-Cl laag te verkrijgen. Was de draad met water voor gebruik. Een glazen intracellulaire pipet moet worden verkregen en zorgvuldig opgevuld met een lange naald bevestigd aan een injectiespuit gevuld met een 3M KCl oplossing. De pipet moet worden afgewezen (met de opening naar de grond) en gevuld met een oplossing. Dit zal ervoor zorgen dat een eventueel overschot KCl zal druppelt uit de achterkant van de elektrode. Zorg ervoor dat er geen KCl loopt langs de glazen pipet dat de zoute bad zal gaan. Zet de pipet rechtop wanneer u klaar bent het vullen met kaliumchloride-oplossing. De zilveren draad kan dan worden geplaatst in de pipet. Het andere uiteinde is verbonden met de + (positief) pool van de versterker hoofd podium. De pipet wordt dan beveiligd op de elektrode sonde. Zorg dient te worden gedaan om de elektrode te breken. Een derde draad verbonden met de kooi van Faraday moet worden geplaatst in de groene paal van het hoofd podium. Ten slotte de Ag draad van de resterende lood moet worden geplaatst in het bad en het andere uiteinde aan de - (negatief) pool hieronder weergegeven. Een draad moet ook worden geplaatst de kooi van Faraday op de grond deel van de AD converter Powerlab. Het hoofd podium is aangesloten op de 'input-probe' op acquisitie / versterker (Powerlab).
    Figuur 13
    Figuur 13. Head fase configuratie. De draad is aangesloten op de groene ingang van het hoofd podium geaard is om de versterker of kooi van Faraday. De draad is aangesloten op de rode ingang is verbonden met de elektrode draad. De zwarte ingang wordt gebruikt om verbinding te maken van de baden oplossing.
    Figuur 14
    Figuur 14. "Test toggle 'is in de onderste rij om te testen elektrode resistance.The" grof "knop is ook gevondenonder DC offset zouden moeten worden gebundeld tegen de klok. Gain is ingesteld op 50, welke signalen versterkt met een factor vijftig. De grond draad van het hoofd podium is geplaatst in de "GND" pin jack opening.
  3. De LabChart software moet worden geopend op de desktop of laptop. Pas de grafiek om slechts een kanaal weer te geven door te klikken op "Setup" en vervolgens op "Channel instellingen." Onder "Channel-instellingen" wijzigen aantal kanalen op een. Klik op "OK". Op de top van de grafiek, linker hoek, moet cycli per seconde worden 2K. Set volt (y-as) tot ongeveer 200mV tot 500mV. Klik op "Channel 1" aan de rechterkant van het scherm. Klik op "Input versterker." Zorg ervoor dat het differentieel is aangevinkt.

    De versterker uitgang moet worden in kanaal een. De volgende instellingen moeten worden gebruikt met de versterker:
    • High Pass-DC
    • Notch Filter-OFF
    • Low Pass-20kHz
    • Capaciteit Comp .- tegen de klok
    • DC Offset Fijn en Cursus knop-tegen de klok
    • DC Offset (+ OFF-) - OFF
    • Gain knop-50
    • Ingang (DIFF MONO GND) - DIFF
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
  4. Als maat voor de elektrode weerstand, moet de spanning worden gedeeld door de huidige, die 2,0 nA (dat wil zeggen, R = V / I, of de wet van Ohm). De resulterende waarde is de weerstand van het glas elektrode. De weerstand moet 20 tot 60 MegaOhms. Lagere (<20) en een hoge resistentie (> 100) zijn niet aanvaardbaar. Zodra de weerstand is bepaald, kan intracellulaire opnames beginnen. Plaats het uiteinde van de glazen elektrode in het zoute bad. Zorg ervoor dat een aardingskabel is ook in de zoute bad.
    Om de opname te starten, druk op start aan de onderkant van het scherm. Zorg ervoor dat de winst is ingesteld op 5 V / div. Gebruik de koers knop op de versterker om de lijn bewegen op de LabChart op nul voordat u de elektrode. De toggle knop moet worden ingeschakeld en vervolgens uit een paar keer om de elektrode weerstand test. Vervolgens moet de amplitude van de resulterende waarden worden gemeten. Plaats een marker op de stabiele basislijn en vervolgens op de tweede plaats op de piek-tot de elektrode weerstand te verkrijgen.
  5. Gebruik de elektrode sonde en microscoop om de elektrode te voegen in de longitudinale spieren (DEM of DEL1 of DEL2) van de voorbereiding (zie figuur 16). De elektrode moet nauwelijks worden opgenomen in de spier. Niet dringen door middel van de spier. Gebruik microscoop en probe-instellingen in om de longitudinale spieren te vinden en de elektroden te voegen in de spier. De hoge intensiteit van verlichting moet worden aangepast om duidelijk te zien de spier als de elektrode wordt geplaatst. Bij het prikken spiervezels in dit preparaat kan men vaak tegenkomen ruimten en kloven in de spier. Dit is de reden waarom de membraanpotentiaal kan verschijnen, dan verdwijnen, dan weer verschijnen.
    Figuur 15
    Figuur 15. Inbrengen van de elektrode in de spier.
  6. Voor het meten van het membraan potentieel, gebruik maken van de grove knop op de versterker om de lijn bewegen op de LabChart op nul voordat u de elektrode. Poke een spiervezel. Vervolgens meten van de amplitude van de resulterende waarden. Plaats een marker op de stabiele basislijn en noteer de waarde.
    Het verschil in de marker en de actieve cursor wordt weergegeven op de rechterkant van het scherm. De waarde is geeft de spanning. De opgenomen spanning zou moeten worden gedeeld door de hoeveelheid van de versterking wordt gebruikt op de versterker (dat wil zeggen 10x of 100x versterking). De spanning moet worden omgezet van volt naar millivolt (1 V = 1000 mV) als de waarden gerapporteerd over de software als volt.
  7. Zorgvuldig gebruik van de microscoop en manipulators om de elektrode te verwijderen uit de spier. Poke een andere spier vezels en noteer de rust membraanpotentiaal. Men moet enkele opnames en comfortabel zijn met maatregelen als de leiding van de intercellulaire elektrode in de spier vezels van belang.
    De elektrode zal waarschijnlijk niet blijven in een spier vezel bij de wisseling van de verschillende veranderd [K +] uit oplossingen. Het beste is om intrekking van de elektrode, dan is de oplossing te veranderen, dan weer door te dringen tot beschadiging van de spier. Het beste is om drie metingen per oplossing te verkrijgen van afzonderlijke spiervezels en een gemiddeld gebruik aan een valse metingen te voorkomen.
  8. Gebruik een spuit te verwijderen en de zoutoplossing gooi van de petrischaal. De petrischaal moet gevuld worden met de eerstvolgende hogere concentratie van kaliumchloride zoutoplossing, voor het voorbereiden volledig. Hetzelfde proces moet worden herhaald met elke kalium oplossing en de veranderingen in spanning / potentiële dient te worden opgemerkt en geregistreerd. De serie van de [K +] uit rivierkreeft zoutoplossingen die we gebruiken zijn: 5,4, 20, 40, 60, 80, 100 mM.

2.3) Anatomie

Nu de fysiologie is voltooid, kunnen we onderzoeken de bijbehorendeanatomie van de spiervezels en innervatie patroon. Breng de voorbereiding op de vlekken schotel en voeg de methyleenblauw (1 gram methyleenblauw gemengd met 100 ml van de rivierkreeft zoutoplossing). Laat de zoute baden de voorbereidingen voor 5 minuten en verwijder en voeg verse kreeften zout, zonder de vlek. De anatomie van deze spieren is in detail beschreven door de jaren heen (Huxley, 1880, Pilgrim en Wiersma, 1963). Pas recent hebben een aantal van de spieren zijn anatomisch beschreven, fysiologisch en biochemisch (Cooper et al., 1998;. Griffis et al., 2000;. Sohn et al., 2000.).

De algemene anatomische indeling van de spieren is afgebeeld in figuur 16 (rechterzijde van figuur voor dit doel). Kijk voor de belangrijkste zenuw die in de eerste plaats innerveert de spieren binnen een segment. Schets van de innervatie patroon van de SEM, DEL2, DEL1 en DEM spieren in een segment. De buik moet gestrekt volledig door pinning de voorbereiding in de schotel stevig vast. Volgende verwijder de zoutoplossing en voeg de fixeermiddel oplossing. De fix oplossing is een Bouin's oplossing (bereid met verzadigde picrinezuur, formaldehyde en azijnzuur, Sigma-Aldrich Co).

LET OP. Laat je niet deze oplossing op uw huid of in je ogen. Vermijd de dampen van de oplossing door te werken onder de zuurkast. Als uw ogen beginnen te branden je ogen uitwassen onmiddellijk in het oog te wassen station.

Laat de Bouin's oplossing blijven op de voorbereiding voor ongeveer 10 minuten en dan gebruik maken van een pipet en uitwisseling van de oplossing voor zout. Knip een dun stuk DEL1 of DEL2 spier uit en leg ze op een glasplaatje. Het etiket van de glijbaan. Herhaal de procedure voor de SEM spier. Bekijk de sarcomeer banding patroon in beide weefsels preparaten. U kunt gebruik maken van de samengestelde microscoop en aanpassen van de doelstellingen om de streepvorming patronen te zien. Indien mogelijk een digitale foto te nemen door het oculair van de microscoop (let op: sommige mobiele telefoon camera's werken goed voor deze procedure).

Figuur 16
Figuur 16. Schematische tekening van een ventrale uitzicht op het dorsale deel van de rivierkreeft buik met de extensoren musculatuur van elk segment. De dorsale membraan buik spieren (DMA) en de oppervlakkige extensor accessoire spier hoofd (SEAcc) voorkomen in de segmenten 1 tot en met 5 van de buik met een andere oriëntatie van elk segment. Met uitzondering van segment 1, deze spieren hebben hun gehechtheid sites op hun voorste einde aan de verkalkte tergite en aan het achterste einde in de articulaire membraan. In segment 1, de homologe spieren hebben hun voorste bevestiging sites om de articulaire membraan gelegen tussen de borstkas en buik. De illustratie is gebaseerd op fotografische montages van methyleenblauw gekleurde preparaten. Aan de linkerkant van de figuur al de diepe extensor spieren zijn verwijderd om de dorsale extensor oppervlakkige spieren te tonen. Schaal = 2,35 mm. (Genomen uit Sohn et al.. 2000).

3. Resultaten

De volgende vragen en verwerking van gegevens illustreren de belangrijkste beginselen en doelstellingen voor dit laboratorium procedure.

  1. Plot de maatregelen verkregen voor de rust membraan potentialen bij elk [K +] buiten gebruikt worden. Kijk of de waargenomen en hypothetische lijnen zijn op elkaar afgestemd in hun helling. Om plot van de waarden gebruik maken van een semi-log plot met de x-as van gevarieerde [K +] als een log en de y-as van het membraan potentials (zoals hieronder afgebeeld; Figuur 17). (Download gratis grafiek papier indien nodig http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ )
    Figuur 17
    Figuur 17. Grafiek papier
    Gebruik van de gemiddelde rust membraanpotentiaal verkregen bij 5,4 mM [K +] uit voor de inleiding van de hypothetische en waargenomen lijnen voor vergelijking.
    Als de lijnen niet overeenkomen bespreken waarom dit zou kunnen zijn.
  2. Als u veranderde de externe niveau van de Na +-ionen, zou je verwachten dat het dezelfde soort veranderingen zoals waargenomen voor het wijzigen van de K + concentratie?
  3. Hoe goed heeft methyleenblauw vlekken op de spieren in vergelijking met de zenuwen? Waarom zou er verschillen? Wordt methyleenblauw vandaag de dag gebruikt voor de identificatie van weefsel of het contrast in levende menselijke cellen? Welke relatie is er met Sigmund Freud en vlekken worden gebruikt in de rivierkreeft?
  4. Let op eventuele verschillen in de sarcomeer patronen tussen de DEL en SEM spieren. Zo ja, wat zou de reden? Hebben alle spieren hebben dezelfde rust sarcomeer afstanden? Teken de spier strepen patroon dat u waargenomen met de microscoop en label zo veel van de figuur als mogelijk (in verband met bekende sarcomeer spier anatomie).

4. Het meten van Synaptic Responses

1) INLEIDING

De abdominale extensor spieren voorbereiding gebruikt worden om de rust membraanpotentiaal aan te tonen is ook ideaal voor het aantonen van de inductie van synaptische reacties op de NMJs van de verschillende spieren. Sommige spieren in schaaldieren worden selectief geïnnerveerd door ofwel een driefase of een tonic motor neuron, hoewel sommige single vezels kunnen worden geïnnerveerd door zowel fasische en tonische prikkelende motorneuronen, zoals extensor spieren in de benen lopen rivierkreeft (Atwood, 2008, zie Jupiter productie-id # 2319-Wu en Cooper, 2010) en de meeste andere ledematen spieren (Wiersma, 1961a). Door het selectief stimuleren fasische en tonische motorische neuronen, kan fysiologische verschillen in de EPSPS worden gemeten. Driefase motor neuronen produceren snel trillen van de spiervezels en roepen EPSPS in de orde van 10-40 mV. De fasische respons kan snel druk met 5-10-Hz treinen van de stimulatie. De tonica motorneuronen aanleiding geven tot kleinere EPSPS die kan worden bevorderd in de aanwezigheid van een hogere frequentie (10-50 Hz) van de stimulatie. Structureel, de presynaptische fasische en tonische terminals op de NMJs zijn verschillend (Atwood en Cooper, 1996; Bradacs et al., 1997;.. Cooper et al., 1998).

Verrassend is dat de fenotype van de driefase fysiologische reacties kan ondergaan een transformatie naar een tonisch-achtige toestand door elektrisch conditioneren fasisch neuronen voor een paar uur per dag gedurende 7 dagen (Cooper et al., 1998;. Mercier en Atwood, 1989). Ook de gevoeligheid voor neuromodulatie van de getransformeerde NMJs priem is voor het onderzoeken van de regulering van de receptor expressie (Griffis et al.., 2000).

In deze relatief robuuste voorbereiding (rivierkreeft buikspieren), zijn zowel tonische en fasische respons makkelijk opgenomen en onderzocht op facilitering en / of depressie van de synaptische reacties met gevarieerde stimulatie paradigma's. Met deze voorbereidingen, zullen de studenten in staat zijn om algemeenheden van de fasische en tonische synaptische reacties te herkennen door het stimuleren van een zenuw bundel.

Een extra gepresenteerd NMJ voorbereiding wordt gebruikt voor het bewaken intrinsieke motorische activiteit en sensorische stimulus geïnduceerde motorische activiteit van het centraal zenuwstelsel. Dit is de oppervlakkige flexor spier aan de ventrale zijde van de rivierkreeft buik. Deze voorbereiding zal ook worden gebruikt om de sensorische CNS-motor-spier-circuit te controleren en de effecten van neuromodulatoren (Strawn et al.., 2000).

In elk van de abdominale segment (behalve de laatste) zijn er drie functionele groepen van spieren: (1) die de controle pleopod (swimmerets) beweging, (2) drie extensor spieren en (3) drie flexor spieren. De flexoren en extensoren zijn antagonistische spiergroepen die leiden tot zowel buik flexie of extensie door het veroorzaken van rotatie rond de intersegmentele scharnieren. De fasische musculatuur neemt het grootste deel van het volume van de buik, terwijl de tonica spieren bestaan ​​uit dunne vellen van vezels die de dorsale (extensoren) en ventrale (flexoren) aspect van elk abdominale segment span.

In rivierkreeft, zijn de tonica buik flexoren van de rivierkreeft geïnnerveerd in elk half segment door vijf motoneuronen en door een perifere remmende neuron. De prikkelende motoneuronen te gebruiken glutamaat als neurotransmitter. Glutamaat depolariseert de spiervezels door het veroorzaken van een toename van de permeabiliteit vooral om natrium-ionen. De remmende neuronen versie gamma-aminoboterzuur (GABA), die meestal de spiervezels hyperpolarizes door het veroorzaken van een toename van de permeabiliteit voor chloride-ionen. In sommige schaaldieren spieren (vooral in de ledematen), de perifere remmende neuronen maken synaptische contacten met motor neuron terminals alsmede ten aanzien van de spiervezels en het verminderen van de hoeveelheid van de zender vrijgegeven door de motor neuron (presynaptische remming) (Dudel en Kuffler, 1961 ). Dit fenomeen is niet in de tonic flexor spieren van rivierkreeft.

Het ventrale zenuw koord van rivierkreeft is een bilateraal symmetrische structuur over de gehele lengte van het dier. Er is een ganglion per lichaam segment. In de buik (6 segmenten), die elk ganglion bevat enkele honderden neuronen, en elk van de twee connectieven bestaat uit een paar duizend axonen. De zenuw cellichamen vormen een laag aantal cellichamen dik op het ventrale oppervlak van elke ganglion. Direct boven het cellichaam laag is een fijne meshwork van neuronale processen, de neuropile. Alle synaptische interacties plaatsvinden hier, de cellichamen zijn verstoken van synapsen.

Elke buik ganglion (behalve de laatste) heeft drie wortels aan elke kant. De eerste wortel bevat axonen van neuronen innerveren de pleopod spieren en sensorische axonen, de tweede wortel bevat axonen innerveren fasische en tonische extensoren musculatuur en sensorische axonen, en de derde wortel, die de zenuw snoer enkele millimeters caudaal van het ganglion bladeren, bevat axonen innervating driefase-tonic flexoren musculatuur. Er zijn twee takken van de derde wortel. De diepe tak (IIIa) innerveert alleen fasisch flexor spieren. De oppervlakkige tak van de derde wortel (IIIb) in elk half-segment bevat zes axonen, die de tonica flexor spieren innerveren.

De neuronen innerveren de tonica flexor zijn spontaan actief, in tegenstelling tot de driefase efferente neuronen, en in een goede voorbereiding, zij zullen blijven vuur voor vele uren na de buik is verwijderd uit het dier. Voor een overzicht van het historische karakter van de ontdekkingen die in deze buik-preparaten, zie Atwood (2008). De cel lichamen van vier van de motor neuronen en van de perifere remmende neuron innerveert tonic flexor spier in een half segment bevinden zich in het ganglion van dat segment. De cel lichaam van de resterende motor neuron bevindt zich in de komende caudale ganglion. Deze neuronen kunnen betrouwbaar worden van elkaar onderscheiden op basis van de extracelluarly opgenomen spike amplitudes. Als de tonic flexor spier van een half segment wordt verwijderd samen met de twee ganglia met de neuronen innerveren deze spier, vijf neuronen vertonen gewoonlijk een zekere mate van spontane activiteit. Deze neuronen zijn genummerd op basis van de relatieve extracellulaire spike amplitude, in oplopende volgorde. f1 tot f4 zijn motoneuronen en f5, de grootste spontaan actief neuron, is de perifere flexor remmer. f6, de grootste motor neuron, is een excitatoire motor neuron, die zelden spontaan actief is.

Het spontane karakter van tonisch motorische neuron activiteit kan gemoduleerd worden door exogene toepassing van de verbindingen of door middel van een zintuiglijke prikkel om de cuticula binnen hetzelfde segment dat wordt gecontroleerd op motorische activiteit van de nervus.

2) Dissection

Voor het verkrijgen van de abdominale extensor voorbereiding dezelfde procedure als hierboven beschreven voor de behandeling van de rust membraan potentieel met betrekking tot extracellulaire kalium. Het verschil is te zorgen voor de segmentale zenuw bundel die loopt langs de kant van de schaal. Deze zenuw wordt getrokken in een zuig-elektrode, die zal dienen als de stimulerende elektrode. Te stimuleren op 1 Hz voor monitoring fasisch reacties. Stimuleren met korte uitbarstingen van pulsen 10Hz voor 10 tot 20 stimuli, terwijl het toezicht op de tonic reacties.

De experimentele procedures voor het onderhoud van experimenten op de rivierkreeft tonica flexoren zijn verschillend en men moet vertrekken van de ventrale zenuw koord intact. Een preparaat dat bestaat uit verschillende segmenten buik wordt gemaakt. Dit wordt als volgt verkregen:

  1. Een rivierkreeft ongeveer 6-10 cm in lengte moet worden verkregen (of een beheersbare omvang). Het verkrijgen van de kreeften door vast te houden uit de achterkant van het hoofd of ongeveer 2 of 3 centimeter aan de achterkant van de ogen. Zorg ervoor dat de klauwen van de rivierkreeft of de mond niet kan de experimentator te bereiken bij het hanteren van de rivierkreeft. Beschikken over de kop en appendages nadat u ze.
  2. Gebruik de schaar om snel te verwijderen het hoofd. Maak een schoon en snel snijden van achter de ogen van de rivierkreeft.
    Figuur 18
    Figuur 18. Afbeelding toont plaatsing van de snede aan het hoofd van de rivierkreeft te verwijderen.
    De poten en scharen van de kreeft kan worden verwijderd op dit punt om verwondingen te voorkomen. Stiletten op mannen en swimmerets op zowel mannen als vrouwen kunnen ook verwijderd worden (Figuur 19 en 20). Vervolgens scheiden de buik van de thorax. Maak een snede langs het articuleren membraan dat de buik en thorax (figuur 20) sluit zich aan.
  3. Sla de buik gedeelte van de rivierkreeft en gooi van de thorax.
    Figuur 19
    Figuur 19. Afbeelding toont de plaatsing van de stiletten die kan worden verwijderd uit de rivierkreeft.
    Figuur 20
    Figuur 20. Beeld toont de plaatsing van de snede om de borstkas te verwijderen uit de buik.
    Figuur 21
    Figuur 21. Verwijdering van de thorax van de buik. De snede moet worden gemaakt in circulaire manier langs de lijn van het samenvoegen van de segmenten.
    Figuur 22
    Figuur 22. De bovenste afbeelding toont de buik met aanhangsels. Onderste afbeelding toont het verwijderen van de abdominale appendages.
  4. Plaats het geïsoleerde staart voorbereiding in zoutoplossing in een grote petrischaal. Pin naar beneden de staart en het bovenste gedeelte van de voorbereiding op de schotel. Zorg ervoor dat de voorbereiding goed is. Gebruik een scalpel een vierkant deel van de ventrale zijde van de voorbereiding tussen de ribben te verwijderen.
    Figuur 23
    Figuur 23.Laat zien waar de snede moet worden gedaan om het ventrale drankje van het preparaat te verwijderen.
  5. Een kleine snede moet worden gemaakt (kan ook gedaan worden met een schaar). Een flap moet worden gesneden en omhoog getild. De klep kan dan worden verwijderd met een schaar, waardoor de diepe flexoren. De microscoop moet worden gebruikt tijdens dit proces om te zorgen voor precisie in het verwijderen van het ventrale deel van de voorbereiding.
    Figuur 24
    Figuur 24. Snijden voorbereiding met een schaar om de spieren bloot te leggen.
    Figuur 25
    Figuur 25. Bovenste afbeelding toont het grijpen van de klep met een tang. Onderste afbeelding toont het verwijderen van de klep van de voorbereiding met behulp van de microscoop.
    Figuur 26
    Figuur 26. Blootstelling van de oppervlakkige flexoren.

3) Intracellulaire opname:

Figuur 27
Figuur 27. Algemene opzet van het controleapparaat.

  1. De petrischaal met de voorbereiding moeten worden geplaatst onder de microscoop en vastgezet met was op de bodem van de schaal om beweging te voorkomen.
    Figuur 28
    Figuur 28. Toont de plaatsing van het preparaat onder de microscoop. Gebruik wax om de petrischaal en voorbereiding veilig te stellen.
  2. Twee draden met korte lengte van de zilveren draad aan het ene uiteinde moet worden verkregen. De zilveren draad moet worden ondergedompeld in een kleine hoeveelheid bleekmiddel voor ongeveer 20 minuten om een ​​Ag-Cl laag te verkrijgen. Was de draad met water voor gebruik. Een glazen intracellulaire pipet moet worden verkregen en zorgvuldig gevuld met een KCl (3 M)-oplossing. De pipet moet worden afgewezen (met de opening naar de grond) en gevuld met een oplossing. De laatste zal ervoor zorgen dat een eventueel overschot KCl zal druppelt uit de achterkant van de elektrode. Zorg ervoor dat er geen KCl loopt langs de glazen pipet die treedt in het zoute bad. Zet de pipet rechtop wanneer u klaar bent het vullen met kaliumchloride-oplossing. De zilveren draad kan dan worden geplaatst in de pipet. Het andere uiteinde is verbonden met de + (positief) pool op het hoofd podium. De pipet wordt dan beveiligd op de elektrode sonde. Zorg dient te worden gedaan aan de elektrode pipet te breken. Een derde draad verbonden met de kooi van Faraday moet worden geplaatst in de groene paal van het hoofd podium. Ten slotte de Ag draad van de resterende lood moet worden geplaatst in het bad en het andere uiteinde aan de - (negatief) pool hieronder weergegeven. Een draad moet ook worden geplaatst de kooi van Faraday op de grond deel van de AD converter Powerlab. Het hoofd podium is aangesloten op de "input-probe 'op aankoop / versterker (Powerlab).
    Figuur 29
    Figuur 29. Head fase configuratie. De draad is aangesloten op het groene gedeelte van het hoofd podium geaard is om de versterker of kooi van Faraday. De draad is aangesloten op het rode gedeelte is verbonden met de elektrode draad. De zwarte gedeelte wordt gebruikt om verbinding te maken met de badende oplossing.
    Figuur 30
    Figuur 30. "Test toggle 'is in de onderste rij elektrode weerstand te testen. De "grove" knop is ook te vinden onder DC-offset zouden moeten worden gebundeld tegen de klok. Gain is ingesteld op 50, welke signalen versterkt met een factor vijftig. De grond draad van het hoofd podium is geplaatst in de "GND" pin jack opening.
  3. De LabChart software moet worden geopend op de desktop of laptop. Pas de grafiek om slechts een kanaal door te klikken op "Setup", dan display "Channel-instellingen." Onder "Channel-instellingen" wijzigen aantal kanalen op een. Klik op "OK". Op de top van de grafiek, linker hoek, moet cycli per seconde worden 2K. Set volt (y-as) tot ongeveer 200mV tot 500mV. Klik op "Channel 1" aan de rechterkant van het scherm. Klik op "Input versterker." Zorg ervoor dat het differentieel is aangevinkt.

    De versterker uitgang moet worden in kanaal een. De volgende instellingen moeten worden gebruikt met de versterker:
    • High Pass-DC
    • Notch Filter-OFF
    • Low Pass-20kHz
    • Capaciteit Comp .- tegen de klok
    • DC Offset Fijn en Cursus knop-tegen de klok
    • DC Offset (+ OFF-) - OFF
    • Gain knop-50
    • Ingang (DIFF MONO GND) - DIFF
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
  4. Voor het meten van de elektrode weerstand, moet de spanning worden gedeeld door de huidige, dat is 2,0 nA. De resulterende waarde is de weerstand van het glas elektrode. De weerstand moet 20 tot 60 MegaOhms. Zodra de weerstand is bepaald, kan intracellulaire opnames beginnen. Plaats het uiteinde van de glazen elektrode in de zoute bad. Zorg ervoor dat een aardingskabel is ook in de zoute bad.
    Om de opname te starten, drukt u op "start" aan de onderkant van het scherm. Zorg ervoor dat de winst is ingesteld op 5 V / div. Gebruik de koers knop op de versterker om de lijn bewegen op de LabChart op nul voordat u de elektrode. De toggle knop moet worden ingeschakeld en vervolgens uit een paar keer om de elektrode weerstand test. Vervolgens moet de amplitude van de resulterende waarden worden gemeten. Plaats een maker de gestage basislijn en vervolgens op de tweede plaats op de piek-tot de elektrode weerstand te verkrijgen.
  5. Gebruik de elektrode sonde en microscoop om de elektrode te voegen in de spier. Niet dringen door middel van de spier. Gebruik microscoop en probe-instellingen in om de dunne laag van de spiervezel te vinden en de elektroden te voegen in de vezels. De hoge intensiteit verlichting kan gebruikt worden als een lichtbron bij het betreden van de spier.
    Figuur 31
    Figuur 31. Inbrengen van de elektrode in de spier.
  6. Zorg moet worden genomen om te voorkomen beschadiging van de zenuwwortels van de oppervlakkige spieren.
    Het is raadzaam om de zoute baden de voorbereidingen koel (10-15 graden Celsius) en goed zuurstofrijk bij de uitvoering van de experimentele procedures. Als koelunits niet beschikbaar zijn vervangen door de zoutoplossing met verse, gekoelde zout regelmatig. Zuurstof, of op zijn minst de lucht, moet worden geleid door de zoutoplossing.
  7. Noteer de spontane activiteit van de EPSPS. Let op de verschillende afmetingen van de EPSPS en als IPSPs aanwezig zijn.
  8. Heel voorzichtig neem een ​​klein verf struik en met de hand te stimuleren langs de nagelriem rand binnen hetzelfde segment dat men de spontane activiteit monitoring. Let op een verandering in de frequentie van de reacties en als verschillende grootte EPSPS blijken dat er niet voorafgaand aan het stimuleren van de cuticula.
    Figuur 32
    Figuur 32. Voorbereiding met het stimuleren van borstel en zenuwwortels. (Gemodificeerd van Strawn et al.., 2000)
  9. De stimulatie kan worden herhaald na een zorgvuldige uitwisseling van het zoute bad met een met een neuromodulator zoals serotonine (een microm) of zoutoplossing borrelen met CO 2. Let op het effect op de activiteit profiel voor een bepaalde stimulus. Let ook op wanneer de vervanging van het zout terug naar verse zout geeft de activiteit in zijn oorspronkelijke toestand.
  10. Vervolgens kan men neurale activiteit te controleren binnen de sensorisch-CNS-Motor neuron circuit op verschillende manieren. We kunnen gebruik maken van een zuig-elektrode in plaats van een intracellulaire elektrode (figuur 33) om toezicht te houden motor neuron activiteit. Aan het uiteinde van de glazen zuig elektrode, wordt plastic buizen geplaatst die heeft een opening van de juiste maat om de zenuw te trekken in de tip. De opening mag niet te groot, omdat de zenuw zou vallen, of te klein, omdat de zenuw zou worden beschadigd door de druk van de elektrode. De kunststof buis wordt getrokken boven een vlam en getrimd terug naar de benodigde grootte.
    Figuur 33
    Figuur 33. Set met zuig-elektrode opname regeling.
    Plaats de micromanipulator in een positie waar de zuig-elektrode heeft een gemakkelijke toegang tot de zoute bad. Zuig-up zout totdat het in contact komt met de zilveren draad binnen in de aanzuig-elektrode. Schik de andere draad op de cut-kant van de zuigkracht elektrode dicht bij de punt van de elektrode, zodat beide draden in contact zal komen met het zoute bad.
    Wat betreft de elektrische controle op de AC / DC differentiële versterker (versterker) naar de Power Lab 26T. Doe dit door het verbinden van de juiste snoer van Ingang 1 op de PowerLab 26T naar de uitgang van de versterker.
    • De versterker instrument controles moeten worden ingesteld om de volgende instellingen:
      • High Pass-DC
      • Notch Filter-OFF
      • Low Pass-20kHz
      • Capaciteit Comp .- tegen de klok
      • DC Offset Fijn en Cursus knop-tegen de klok
      • DC Offset (+ OFF-) - OFF
      • Gain knop-50
      • Ingang (DIFF MONO GND) - DIFF
      • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
      • ΩTEST-OFF
    Sluit het hoofd podium om de 'input-probe' op de versterker.
    Sluit de elektrische draden van de zuig-elektrode op het hoofd podium. De draden moeten worden aangesloten met de rode (positieve) links bovenaan, groen (grond) in het midden, zwart (negatief aan de onderzijde. Dit wordt aangegeven in Figuur 34. De begane draad kan gewoon worden geplaatst in het zoute bad.
    Figuur 34
    Figuur 34. Head fase configuratie
  11. Sluit nu de USB-kabel van de PowerLab 26T aan de laptop. Zorg ervoor dat zowel de versterker en PowerLab26T zijn aangesloten en ingeschakeld voordat het openen van LabChart7 op de computer.
  12. Open LabChart7.
    • De LabChart Welcome Center box zal verschijnen geopend. Sluiten. </ Li>
    • Klik op Setup
    • Klik op kanaal instellingen. Verander het aantal kanalen op 1 (links onder in box) druk op OK.
    • Op de linkerbovenhoek van de grafiek die de cycli per seconde tot ongeveer 2k. Stel de volt (y-as) tot ongeveer 500 of 200 mV.
    • Klik op Channel 1 aan de rechterkant van de grafiek. Klik op Input versterker. Zorg ervoor dat de instellingen: single-ended, ac gekoppeld, en omgekeerd (keert het signaal indien nodig), en anti-alias, worden gecontroleerd.
    • Om de opname te druk op start te beginnen.
    We kunnen opnemen van de tak van de 3 e wortel die de oppervlakkige flexor spier (tak IIIb) innerveert om toezicht te houden omvang van de actie potentialen met extracellulaire. De extracellulaire zenuwimpulsen worden aangeduid als 'spikes'. Herinneren dat er vijf Excitor motorneuronen en een inhibitor motor neuron in deze root (Kennedy en Takeda, 1965; Velez en Wyman, 1978). Stimulatie van de nagelriem met een borstel of de blootstelling van neuromodulatoren kunnen worden gebruikt (figuur 35). De verfkwast kan worden gebruikt met de hand of voor een consistente stimulatie kon worden gemonteerd op een micromanipulator om de hoeveelheid druk en beweging te controleren.
    Figuur 35
    Figuur 35. Activiteit van de 3 de wortel voor en tijdens cuticulair stimulatie in een zoutoplossing (boven) en in 100 nM 5-HT (onder). De tijd tijdens de cuticula stimulatie is aangegeven door de bar. Let op de verhoogde activiteit voor en na stimulatie bij de bereiding wordt badend in 5-HT (gewijzigd van Strawn et al.., 2000).
    We kunnen opnemen vanaf de 1 e of 2 e wortels door het maken van een en passant opname van de zenuw, of we kunnen de wortel weg transect van de VNC en opnemen pure zintuiglijke input die voortvloeien uit de periferie die signalen sturen naar de VNC. Zo zou u opneemt vanaf de doorsneden wortel die leidt tot de periferie van zintuiglijke activiteit.
    De 2 e wortel bevat zeer grote primaire afferente axonen van de spier-receptor organen (MRO) en kleinere axonen van afferenten naar extensor motorneuronen (Fields en Kennedy, 1965). Er zijn veel sensorische axonen in de 1 ste en 2 de wortels.
    De mechanosensorische neuronen hebben directe verbindingen, door middel van elektrische synapsen met de laterale gigantische axonen (LG) (Krasne 1969; Zucker 1972). Ook zijn mechanosensorische neuronen bekend dat interneuronen te wekken via chemische synapsen.
    Om te onderzoeken hoe de zintuiglijke input kunnen motorische neuron activiteit beïnvloeden, door middel van een sensorisch-CNS-motorneuron circuit, kunnen we registreren de synaptische reacties in een spier. Verschillende aspecten van het circuit zullen we gebruik kan worden onderzocht. We bijvoorbeeld kunt opnemen van de zintuiglijke zenuwwortel alleen of de motor wortel, met of zonder intacte zintuiglijke input in de VNC Om de piek frequentie opnames te analyseren, kan men rekenen over een periode de tijd in verschillende omstandigheden. De maatregelen kunnen worden voorafgaand aan stimulatie en tijdens de borstel stimulatie voor een bepaalde hoeveelheid tijd (figuur 35) borstel. Men kan herhalen de voorwaarden 5 keer en het verkrijgen van de gemiddelde procentuele verandering in frequentie als een maatregel om vergelijkingen te maken.
    Men kan ook van toepassing zijn exogene stoffen zoals serotonine (Strawn et al.., 2000) of acetylcholine (Ach), nicotine of glutamaat. Verschillende gedrags-acties zijn beschreven voor nicotine in ongewervelde dieren. Dit zou suggereren de aanwezigheid van nicotine receptoren (Tsunoyama en Gojobori, 1998). Glutamaat is een belangrijke excitatoire neurotransmitter in de meeste ongewervelde dieren bij de NMJ en Ach is de belangrijkste excitatoire neurotransmitter in het centraal zenuwstelsel (Monoghan et al., 1989;. Watkins, et al., 1990).
    Men kan proberen heptanol of CO 2 borrelen fysiologische zoutoplossing, aangezien het de rivierkreeft septate (of de gap) kruispunten los te koppelen in het circuit als Dr Sonya M. Bierbower (University of Kentucky) toonde in haar promotieonderzoek. Deze actie kan verantwoordelijk zijn voor het gedrag van dieren veranderde hele wanneer ze worden blootgesteld aan hoge CO 2 in de omgeving (Bierbower en Cooper, 2010). Wanneer u de cuticula te stimuleren met een borstel en rijden zintuiglijke input en het opnemen van een reactie in de motorneuronen, Opmerking Als er een verschil in de activiteit voor en tijdens de heptanol of CO 2 blootstelling. Dit kan of kan niet zeggen gap junctions om een ​​rol in de sensorische-CNS-motorneuron circuit.

Discussion

Membraanpotentiaal

Al in 1902, was Bernstein het omgaan met de problematiek van een rustpotentiaal in het axon van een inktvis. Het is intrigerend om te overwegen hoe deze vroege ideeën en observaties van Berstein (1902) en Nernst (1888) later onderzoek beïnvloed membraan fysiologie. (Zie beoordeling door Malmivuo en Plonsey, 1995; ook beschikbaar op het www http://www.bem.fi/book/ ). Er zijn nog steeds, tot op de dag, doorbraken worden gemaakt over ionkanaalfunctie en de eigenschappen van biologische membranen die zeer belangrijk bij het begrijpen van de cellulaire fysiologie dat betrekking heeft op de functie van weefsels, organen en systemen.

De vergelijking van de experimentele en theoretisch afgeleide effecten van externe [K +] op de rust membraanpotentiaal geeft aan dat de invloed van ionen op het membraan potentieel. Aanvullende experimenten met dezelfde voorbereiding moeten nog worden uitgevoerd om fundamentele fysiologische vragen te beantwoorden. Sommigen kwamen naar voren in 1968 door Atwood en Parnas en moeten nog volledig worden aangepakt. Met de technieken verkregen in deze oefening, kan men overgaan tot vele vragen die nog in andere experimentele preparaten en in fysiologische toepassingen in verband met geneeskunde en gezondheid te beantwoorden. We hebben aangetoond dat het nut van een model ongewervelde voorbereiding op de fundamentele vragen die relevant zijn voor alle dieren te pakken.

Met de kennis opgedaan over de elektrochemische gradiënten van ionen in deze bovenstaande oefening, kunt u nu gaan naar de prikkelbaarheid van de membranen door het onderzoeken van synaptische transmissie bij neuromusculaire bereidingen in de rivierkreeft.

Het meten van Synaptic Reacties

De gegevens die voor het eerste deel van dit laboratorium, en de bijbehorende film, hebben belangrijke stappen voor het opnemen van membraanpotentialen en het onderzoeken van spier structuur. In het tweede deel van dit laboratorium, de demonstratie van dissectie en opnemen van synaptische transmissie op de NMJs van fasische en tonische motor units die een blootstelling aan de fundamentele concepten in de fysiologie. De blootstelling aan een neuraal circuit, dat kan voor een deel kan worden gebruikt om geassocieerd gedrag, in het intacte dier uit te leggen heeft niet alleen mogelijkheden voor studenten om verschillende open vragen te onderzoeken in hun laboratorium uit te oefenen, maar ook voor toekomstig onderzoek op de neuronale circuits in een goed gevestigd ongewervelde voorbereiding (Kennedy et al., 1969;. Antonsen en Edwards, 2003)

Deze preparaten kunnen ook worden gebruikt om synaptische faciliteren, depressie en de lange termijn plasticiteit (niet onderzocht in dit laboratorium onderzoek) te onderzoeken. Zelfs binnen sommige soorten rivierkreeft, neuronale plasticiteit hangt af van de experimentele condities stimulatie (Mercier en Atwood, 1989;. Cooper et al., 1998) evenals hun natuurlijke omgeving. In welke mate de mogelijkheid om synaptische doeltreffendheid en de spieren dynamiek te veranderen dient het dier nog moet worden onderzocht. Sinds rivierkreeft doen veranderen hun gedrag in relatie tot seizoensgebonden variatie en de rui-cyclus, zijn er relatief lange termijn activiteit verschillen in hun neuromusculaire systemen. Het is aangetoond dat de driefase motor zenuwuiteinden van de klauw dichter spieren van de klassieke fasisch morfologie vertonen tijdens de winter, maar zwellen en meer spataderen over de lengte van de terminal in de zomer maanden (Lnenicka 1993; Lnenicka en Zhao, 1991).

Enkele vroege studies uitgevoerd bij rivierkreeft laterale reus (LG) interneuronen in het ventrale zenuw koord hebben de aanwezigheid van gap junctions (Johnson, 1924; Watanabe en Grundfest, 1961). Het is bekend dat CO 2 een effect op de elektrische communicatie door ontkoppeling gap junctions (Arellano et al., 1990) heeft. Het werd onlangs aangetoond dat de zenuw snoer en communicatie binnen de zintuiglijke-CNS-motor-spier circuit, zoals beschreven in dit rapport, ook gevoelig is voor CO 2 blootstelling, waaruit de aanwezigheid van gap junctions (Bierbower, 2010; Bierbower en Cooper, 2010)

De spontane activiteit van de 3 e motor wortel is een onderwerp sinds de jaren 1960, toen Eckert (1961) onderzocht of de tonica afvuren statische spierreceptoren orgel (MRO) binnen dezelfde of aangrenzende segment zou kunnen zijn voor de spontane aandrijving. In deze eerdere onderzoeken bleek dat de activiteit werd gedreven in het ventrale zenuw kabel (VNC) eventueel uit hogere centra (Eckert, 1961; Kennedy en Takeda, 1965a, b;. Strawn et al., 2000). Aangezien de aanwezigheid van CO 2 stopte de spontane activiteit, kan men aannemen ergens in de rit naar de motorneuronen er misschien gap junctions of glutamaat prikkelende rijden. De NMJs worden geblokkeerd of vertonen verminderde gevoeligheid voor glutamaat in de aanwezigheid van CO 2, en zij kunnen bloken KED binnen de CNS (Bierbower, 2010; Bierbower en Cooper, 2010, zie ook Badre et al., 2005.).

De werking van diverse neuromodulatoren is ook goed gestudeerd aan de verschillende soorten NMJs (Cooper en Cooper, 2009; Griffis et al., 2000;. Southard et al., 2000;.. Strawn et al., 2000). Daarnaast worden verschillende invloeden uitgeoefend door neuromodulatoren op het centrale zenuwstelsel circuit. Er is gesuggereerd dat de 5-HT en octopaminergic neuronen kan als 'gain-setters' functie in het veranderen van de output van neuronale circuits (Ma et al., 1992;. Schneider et al., 1996;. Hörner et al., 1997;. Edwards et al.., 2002). Nog veel werk te doen voordat we kunnen begrijpen van de effecten van neuromodulatoren op individuele doelcellen. Gezien het feit dat verschillende neuromodulatoren kan in overleg met elkaar, de analyse van hun gemengde actie is een gebied voor toekomstig onderzoek (Djokaj et al., 2001).. Daarnaast zijn enkele studies, met name in de gewervelde dieren, de gevolgen van de neuromodulatoren op hele trajecten die een bepaald gedrag kunnen reguleren. In deze zintuiglijke-CNS-motor unit voorbereiding kan men onderzoekt de invloed van zowel zintuiglijke input en neuromodulatoren op de activiteit van de motorische neuronen (Kennedy et al.., 1969).

Want het is gepostuleerd dat 5-HT een rol speelt in het reguleren van het gedrag staat van rivierkreeft, kreeften, krabben en (Livingstone et al., 1980;.. Sneddon et al., 2000) zijn er verschillende pogingen gedaan om de concentratie ervan te bepalen in de VNC, de hemolymfe, en in geïsoleerde ganglia van de kreeften (Livingstone et al., 1980;. Harris-Warrick en Kravitz 1984;. Fadool et al., 1988). Toch is er sprake van een aanzienlijke variatie in de opgenomen metingen, zich verzet tegen specifieke dosis-respons relatie die zou kunnen zijn voor gedrags-acties.

Een rivierkreeft met de klauwen hield in een verhoogde positie en met de staart verscholen onder haar buik werd gedacht aan een dominante houding vertonen (Livingstone et al.., 1980). De staat van abdominale flexie in rivierkreeft lijkt niet de houding zijn dat dominant rivierkreeft, binnen een paar vertonen tijdens de sociale interacties of met behoud van een dominante hiërarchische status (Listerman et al.., 2000). Onderdanige rivierkreeft zelfs smullen hun buik onder zichzelf als ze zich terugtrekken van een tegenstander. Dergelijke staart tucking wordt ook gezien als een van verdediging (Listerman et al.., 2000). Deze gedragingen zijn gemakkelijk waargenomen in het veld en in het laboratorium instellingen (Bovbjerg, 1953, 1956, Bruski en Dunham, 1987; Li et al., 2000;.. Listerman et al., 2000). Interessant is dat de gedrags-houdingen vermeld in kreeften (Livingstone et al.., 1980) zijn omgedraaid voor 5-HT en octopamine injecties in de Australische rivierkreeft, Cherax destructor (McRae, 1996). Mogelijk zou heel verschillende reacties worden waargenomen in de oppervlakkige flexoren voorbereiding in de Australische rivierkreeft. Bovendien, omdat dominantie is over het algemeen grootte heeft onder rivierkreeft, zou men verwachten dat een zeer plastisch response systeem voor het snel veranderde sociale omstandigheden (Strawn et al.., 2000). De plasticiteit in reageren op neuromodulatoren in ongewervelden is een open gebied van onderzoek.

Wyttenbach, Johnson en Hoy (1999) hebben geproduceerd digitale media en een laboratorium handleiding voor diverse rivierkreeft experimenten waarbij dezelfde spieren in dit verslag in aanvulling op andere rivierkreeft preparaten. Dit is een uitstekende bron voor student oefeningen.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Ondersteund door de Universiteit van Kentucky, Departement Biologie, Bureau van Undergraduate Studies en College of Arts & Sciences.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld’s solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. Bouin’s fixative solution was used directly and methylene blue is made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139).
  4. Sylgard-bottomed glass dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Model 3000 AC/DC amplifier for intracellular as well as extracellular recordings can be used.
  8. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
  9. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. Intracellular electrodes were filled with 3 M KCl.
  10. A suction electrode is used to record extracellular signals.
  11. Faraday cage.
  12. High Intensity Illuminator (light source).
  13. Micromanipulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antonsen, B. L., Edwards, D. H. Differential dye coupling reveals lateral giant escape circuit in crayfish. J. Comp. Neurol. 466, 1-13 (2003).
  2. Arellano, R. O., Rivera, A., Ramón, F. Protein phosphorylation and hydrogen ions modulate calcium-induced closure of gap junction channels. Biophys. J. 57, 363-367 (1990).
  3. Atwood, H. L. γ -aminobutyric acid and crab muscle fibres. Experientia (Basel). 20, 161-163 (1964).
  4. Atwood, H. L. Variation in physiological properties of crustacean motor synapses. Nature. 215, 57-58 (1967).
  5. Atwood, H. L. Peripheral inhibition in crustacean muscle. Experimentia. 24, 753-763 (1968).
  6. Atwood, H. L. An attempt to account for the diversity of crustacean muscles. Am. Zool. 13, 357-378 (1973).
  7. Atwood, H. L. Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems. Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).
  8. Atwood, H. L. Synapses and neurotransmitters. The Biology of Crustacea. Sandeman, D. C., Atwood, H. L. 3, Academic Press, Inc. New York. 105-150 (1982).
  9. Atwood, H. L. Parallel 'phasic' and 'tonic' motor systems in the crayfish abdomen. J. Exp. Biol. 211, 2193-2195 (2008).
  10. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Functional and structural parallels in crustaceans and Drosophila neuromuscular systems. Am. Zool. 35 (6), 556-565 (1995).
  11. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Assessing ultrastructure of crustacean and insect neuromuscular junctions. J. Neurosci. Meth. 69, 51-58 (1996).
  12. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions. Invertebrate Neurosci. 1, 291-307 (1996).
  13. Atwood, H. L., Parnas, I. Recording from the crayfish abdominal extensor muscle preparation with microelectrodes. In: Experiments in physiology and biochemistry. Kerkut, G. A. , Academic. London. 307-330 (1968).
  14. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila larvae. Comparative Biochemistry and Physiology A. 140, 363-376 (2005).
  15. Bernstein, J. Untersuchungen zur Thermodynamik der bioelektrischen Ströme. Pflüger Arch. ges. Physiol. 9, 521-562 (1902).
  16. Bernstein, J. Elektrobiologie. , Viewag. Braunschweig. 215 (1912).
  17. Bierbower, S. M. Environmental effects on behavior and physiology in crayfish. , Department of Biology, University of Kentucky. (2010).
  18. Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The effects of acute carbon dioxide on behavior and physiology in Procambarus clarkii. J. Exp. Zool. , In press (2010).
  19. Boistel, J., Fatt, P. Membrane permeability change during inhibitory transmitter action in crustacean muscle. J. Physiol. (Lond.). 144, 176-191 (1958).
  20. Bovbjerg, R. V. Dominance order in the crayfish Orconectes 6irilis (Hagen). Physiol. Zool. 26, 173-178 (1953).
  21. Bovbjerg, R. V. Some factors affecting aggressive behavior in crayfish. Physiol. Zool. 29, 127-136 (1956).
  22. Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle. J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).
  23. Bruski, C. A., Dunham, D. W. The importance of vision in agonistic communication of the crayfish Orconectes rusticus, I. an analysis of bout dynamics. Behaviour. 63, 83-107 (1987).
  24. Burke, W., Ginsborg, B. L. The electrical properties of the slow muscle fibre membrane. J. Physiol. 132, 586-598 (1956).
  25. Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595 (2009).
  26. Cooper, R. L., Warren, W. M., Ashby, H. E. Activity of phasic motor neurons partially transforms the neuronal and muscle phenotype to a tonic-like state. Muscle & Nerve. 21, 921-931 (1998).
  27. Djokaj, S., Cooper, R. L., Rathmayer, W. Effects of octopamine, serotonin, and cocktails of the two modulators on synaptic transmission at crustacean neuromuscular junctions. J. Comp. Physiol. A. 187 (2), 145-154 (2001).
  28. Dudel, J., Kuffler, S. W. Mechanism of facilitation at the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (Lond.). 155, 540-542 (1961).
  29. Eckert, R. O. Reflex relationships of the abdominal stretch receptors of the crayfish. J. Cell. Comp. Physiol. 57, 149-162 (1961).
  30. Edwards, D. H., Yeh, S. R., Musolf, B. E., Antonsen, B. L., Krasne, F. B. Metamodulation of the crayfish escape circuit. Brain Behav Evol. 60 (6), 360-369 (2002).
  31. Fadool, D. A., Cobb, S. J., Kass-Simon, G., Brown, P. R. Liquid chromatographic procedures for the analysis of compounds in the serotonergic and octopamine pathways of lobster hemolymph. J. Chromatogr. 452, 491-501 (1988).
  32. Fatt, P., Katz, B. The electrical properties of crustacean muscle fibers. J. Physiol. 120, 171-204 (1953).
  33. Fields, H. L., Kennedy, D. Functional role of muscle receptor organs in crayfish. Nature. 206 (990), 1235-1237 (1965).
  34. Fisher, L., Florey, E. Modulation of synaptic transmission and excitation-contraction coupling in the opener muscle of the crayfish, Astacus leptodactylus, by 5-hydroxytryptamine and octopamine. J. Exp. Biol.. 102, 187-198 (1983).
  35. Freud, S. Über den Bau der Nervenfasern und Nervenzellen beim Flußkrebs. Anzeiger Akad. 18, Math.-Naturwiss. Kl. Wiss. Wien. 275 (1881).
  36. Freud, S. Über den Bau der Nervenfasern und Nervenzellen beim Flußkrebs. Sitzungsber. Akad. 85, Math.-Naturwiss. Kl. Wiss. Wien. 9-46 (1881).
  37. Goldman, D. E. Potential, impedance, and rectification in membranes. J. Gen. Physiol. 27, 37-60 (1943).
  38. Griffis, B., Bonner, P., Cooper, R. L. Sensitivity of transformed (phasic to tonic) motor neurons to the neuromodulator 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology A. 127, 495-504 (2000).
  39. Grundfest, H., Reuben, J. P. Neuromuscular synaptic activity in lobster. Nervous Inhibition. Florey, E. , Pergamon Press. Oxford. 92-104 (1961).
  40. Harris-Warrick, R. M., Kravitz, E. A. Cellular mechanisms for modulation of posture by octopamine and serotonin in the lobster. J. Neurosci. 4, 1976-1993 (1984).
  41. Hagiwara, S., Chichibu, S., Naka, K. I. The effects of various ions on resting and spike potentials of barnacle muscle fibers. J. Gen. Physiol. 48, 163-179 (1964).
  42. Hille, B. Ionic Channels of Excitable Membranes. , 2nd, Sinauer Assoc. Sunderland, Mass. (1992).
  43. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. (Lond.). 117, 500-544 (1952).
  44. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F., Katz, B. Measurement of current-voltage relations in the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. (Lond.). 116, 424-448 (1952).
  45. Hodgkin, A. L., Katz, B. The effect of sodium ions on the electrical activity of the giant axon of the squid. J. Physiol. (Lond.). 108, 37-77 (1949).
  46. Hodgkin, A. L., Rushton, W. A. H. The electrical constants of a crustacean nerve fibre. Proc. Roy. Soc. 133, 444-479 (1946).
  47. Hörner, M., Weiger, W. A., Edwards, D. H., Kravitz, E. A. Excitation of identified serotonergic neurons by escape command neurons in lobsters. J. Exp. Biol. 200, 2017-2033 (1997).
  48. Huxley, T. H. The crayfish. , C. Kegan Paul and Co. London. (1880).
  49. Johnson, G. E. Giant nerve fibers in crustaceans with special reference to Cambaus and Palaemonetes. J. Comp. Neurol. 36, 323-373 (1924).
  50. Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramon, F. Interaction of anaesthetics with electrical synapses. Nature (Lond.). 286, 498-500 (1980).
  51. Katz, B., Miledi, R. The role of calcium in neuromuscular facilitation. J. Physiol. (Lond.). 195, 481-492 (1968).
  52. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of abdominal flexor muscles in the crayfish: the twitch system. J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).
  53. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of the abdominal flexor in the crayfish: the tonic system. J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).
  54. Kennedy, D., Selverston, A. I., Remler, M. P. Analysis of restricted neural networks. Science. 164, 1488-1496 (1969).
  55. Krasne, F. B. Excitation and habituation of the crayfish escape reflex: the depolarizing response in lateral giant fibres of the isolated abdomen. J. Exp. Biol. 50, 29-46 (1969).
  56. Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate measures in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comp. Biochem. Physiol A. 127, 55-70 (2000).
  57. Listerman, L., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Measures of heart rate during social interactions in crayfish and effects of 5-HT. Comp. Biochem. Physiol A. 125, 251-264 (2000).
  58. Livingstone, M. S., Harris-Warrick, R. M., Kravitz, E. A. Serotonin and octopamine produce opposite postures in lobsters. Science. 208, 76-79 (1980).
  59. Lnenicka, G. A. Seasonal differences in motor terminals. Comp. Biochem. Physiol A. 104, 423-429 (1993).
  60. Lnenicka, G. A., Zhao, Y. Seasonal differences in the physiology and morphology of crayfish motor terminals. J. Neurobiol. 22, 561-569 (1993).
  61. Ma, P. M., Beltz, B. S., Kravitz, E. A. Serotonin containing neurons in lobsters: their role as 'gainsetters' in postural control mechanisms. J. Neurophysiol. 68, 36-54 (1992).
  62. Malmivuo, J., Plonsey, R. Bioelectromagnetism-Principles and Applications of Bioelectric and Biomagnetic Fields. , Oxford University Press. New York. (1995).
  63. McRae, T. On the postural effects induced in female Cherax destructor (Clark) by serotonin and octopamine. Freshwater Crayfish. 11, 293-298 (1996).
  64. Mercier, A. J., Atwood, H. L. Long-term adaptation of a phasic extensor motoneurone in crayfish. J. Exp. Biol. 145, 9-22 (1989).
  65. Monaghan, D. T., Bridges, R. J., Cotman, C. W. The excitatory amino acid receptors: their classes, pharmacology, and distinct properties in the function of the central nervous system. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29, 365-402 (1989).
  66. Moody, W. Gradual increase in the electrical excitability of crayfish slow muscle fibers produced by anoxia or uncouplers of oxidative phosphorylation. J. Comp. Physiol. 125, 327-334 (1978).
  67. Nernst, W. H. Zur Kinetik der Lösung befindlichen Körper: Theorie der Diffusion. Z. Phys. Chem. 3, 613-637 Forthcoming.
  68. Nernst, W. H. Die elektromotorische Wirksamkeit der Ionen. Z. Phys. Chem. 4, 129-181 Forthcoming.
  69. Pilgrim, R. L. C., Wiersma, C. A. G. Observations on the skeleton and somatic musculature of the abdomen and thorax of Procambarus clarkii (Girard), with notes on the thorax of Panulirus interruptus (Randall) and Astacus. J. Morphol. 113, 453-587 (1963).
  70. Robinson, M. M., Martin, J. M., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2325 (2011).
  71. Schneider, H., Budhiraja, P., Walter, I., Beltz, B. S., Peckol, E., Kravitz, E. A. Developmental expression of the octopamine phenotype in lobsters. J. Comp. Neurol. 371, 3-14 (1996).
  72. Skou, J. C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta. 1000, 439-446 (1989).
  73. Skou, J. C. The identification of the sodium-pump as the membrane-bound Na+/K+-ATPase: a commentary on 'The Influence of Some Cations on an Adenosine Triphosphatase from Peripheral Nerves. Biochim. Biophys. Acta. 1000, 435-438 (1989).
  74. Skou, J. C. Enzymatic basis for active transport of Na+ and K+ across cell membrane. Physiol. Rev. 45, 596-617 (1965).
  75. Skou, J. C. Nobel Lecture. The identification of the sodium pump. Biosci Rep. 18, 155-169 (1998).
  76. Sneddon, L. U., Taylor, A. C., Huntingford, F. A., Watson, D. G. Agonistic behavior and biogenic amines in shore crabs Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 203, 537-545 (2000).
  77. Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen. J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2000).
  78. Southard, R. C., Haggard, J., Crider, M. E., Whiteheart, S. W., Cooper, R. L. Influence of serotonin on the kinetics of vesicular release. Brain Res. 871, 16-28 (2000).
  79. Stefani, E., Steinbach, A. B. Resting potential and electrical properties of frog slow muscle fibers. Effect of different external solutions. J. Physiol. 203, 383-401 (1969).
  80. Strawn, J. R., Neckameyer, W. S., Cooper, R. L. The effects of 5-HT on sensory neurons, CNS command, and neuromuscular junctions of the crayfish abdominal superficial flexor. Comp. Biochem. Physiol B. 127, 533-550 (2000).
  81. Takeuchi, A., Takeuchi, N. Anion permeability of the inhibitory post-synaptic membrane of the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (London). 191, 575-590 (1967).
  82. Tsunoyama, T., Gojobori, S. Evolution of Nicotinic Acetylcholine receptor Subunits. Mol. Biol. Evol. 15 (5), 518-527 (1998).
  83. Van Harreveld, A., Mendelson, M. Glutamate-induced contractions in crustacean muscle. J. Cell Comp. Physiol. 54, 85-94 (1959).
  84. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustaceans. Proc. Soc Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).
  85. Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. The Triple Innervation of the Crayfish Muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22 (11), 667 (1936).
  86. Vélez, S. J., Wayman, R. J. Synaptic connectivity in a crayfish neuromuscular system. I. Gradient of innervations and synaptic strength. J. Neurophysiol. 41, 75-84 (1978).
  87. Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. J. Gen. Physiol. 45, 267-308 (1961).
  88. Watkins, J. C. L-Glutamate as a central neurotransmitter: Looking back. Biochemical Society Transactions. 28, 297-310 (2000).
  89. Wiersma, C. A. G. The neuromuscular system. The Physiology of Crustacea. Waterman, T. H. II, Academic Press. New York. (1961).
  90. Wiersma, C. A. G. Reflexes and the central nervous system. The physiology of Crustacea. II, Academic Press. New York. 241-279 (1961).
  91. Wine, J. J., Mittenthal, J. E., Kennedy, D. The structure of tonic flexor motoneurons in crayfish abdominal ganglia. J. Comp. Physiol. 93, 315-335 (1974).
  92. Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle. J. Vis. Exp. (45), e2319 (2010).
  93. Wyttenbach, R. A., Johnson, B. R., Hoy, R. R. Crawdad. A CD-ROM Lab manual for neurophysiology. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (1999).
  94. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. 3. Electrical junctions and dendrite spikes in fast flexor motoneurons. J. Neurophysiol. 35, 638-651 (1972).
  95. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. II. Physiological mechanisms underlying behavioral habituation. J. Neurophysiol. 35 (5), 621-637 (1972).
  96. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. I. Neural circuit exciting lateral giant fiber. J. Neurophysiol. 35 (5), 599-620 (1972).

Tags

Neurowetenschappen Invertebrate Rivierkreeft neurofysiologie spieren anatomie elektrofysiologie
Membraan Potentials, Synaptic Responses, neuronale circuits, Neuromodulatie en Muscle Histologie Met behulp van de rivierkreeftjes: Student Laboratorium Oefeningen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baierlein, B., Thurow, A. L.,… More

Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322, doi:10.3791/2322 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter