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Neuroscience

Potenziali di membrana, Risposte Synaptic, circuiti neuronali, neuromodulazione e Istologia muscolare Utilizzando la Gamberi: Esercizi di laboratorio per studenti

Published: January 18, 2011 doi: 10.3791/2322
Automatic Translation
*1, *1, *2, *1
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Gli esperimenti dimostrano un approccio facile per gli studenti di acquisire esperienza nell'esame struttura muscolare, le risposte sinaptiche, gli effetti dei gradienti ionici e permeabilità di potenziali di membrana. Inoltre, un senso-SNC-motorio-muscolare circuito è presentato per mostrare un modo per testare gli effetti dei composti su un circuito neuronale.

Abstract

Lo scopo di questa relazione è quello di contribuire a sviluppare una comprensione degli effetti causati da gradienti ionici attraverso una membrana biologica. Due aspetti che influenzano il potenziale di membrana di una cellula e che affronteremo in questi esperimenti sono: (1) la concentrazione di ioni di K + all'esterno della membrana, e (2) la permeabilità della membrana agli ioni specifici. Il addominale muscoli estensori gamberi sono in raggruppamenti con alcuni tonico essere (lento) e altri fasica (veloce) nel loro fenotipo biochimico e fisiologico, così come nella loro struttura, i motoneuroni che innervano questi muscoli sono corrispondentemente diverse caratteristiche funzionali. Noi usiamo questi muscoli così come il superficiale, il muscolo flessore tonico addominali per dimostrare la proprietà nella trasmissione sinaptica. Inoltre, si introduce un senso-SNC-motoneurone-muscolare circuito per dimostrare l'effetto della stimolazione sensoriale cuticolare così come l'influenza dei neuromodulatori su alcuni aspetti del circuito. Con le tecniche ottenute in questo esercizio, si può cominciare a rispondere a molte domande ancora in altre preparazioni sperimentali così come nelle applicazioni fisiologiche legate alla medicina e alla salute. Abbiamo dimostrato l'utilità di preparati invertebrati modello per affrontare questioni fondamentali pertinenti a tutti gli animali.

Protocol

1. Introduzione

Gli obiettivi di questi esercizi di laboratorio per comprendere le proprietà delle membrane eccitabili, la base ionica del potenziale di membrana a riposo, e metodi per misurare il potenziale di membrana. Inoltre, colorazione e istologia del muscolo si presenta, che può essere utilizzato per insegnare la struttura muscolare. Inoltre, due diversi tipi di preparati sezionato vengono utilizzati per dimostrare le proprietà della trasmissione sinaptica nei vari gruppi muscolari. Un completo sensoriale-sistema nervoso centrale (SNC)-motoneuroni dei muscoli circuito nell'addome gambero viene utilizzato anche per presentare una preparazione per esaminare stimolazione sensoriale e l'influenza di neromodulators neurotrasmettitori e sugli aspetti di un circuito.

La prima parte della presente relazione illustra i metodi utilizzati per misurare il potenziale di riposo della membrana e l'influenza di K + extracellulare sul potenziale di membrana. Verrà inoltre presentata la struttura muscolare. Nella seconda parte di questo esercizio, vi presentiamo i vari mezzi di misurare le risposte sinaptiche da diversi tipi di giunzioni neuromuscolari (NMJs). Il primo esercizio utilizza le addominali muscoli estensori gamberi di fiume e il secondo utilizza i muscoli addominali flessori superficiali. Inoltre, presentiamo un circuito neurale (il cordone nervoso ventrale del gambero con input sensoriali e output motori) che è facile da mantenere, e che possono essere utilizzati per l'insegnamento e per la ricerca in vari aspetti di un senso-SNC -motoneuroni del muscolo-circuito. Dopo aver completato la spiegazione degli esercizi iniziali, vi presentiamo la fisiologia del sistema nervoso centrale NMJs e circuito.

Il gradiente di ione attraverso una membrana biologica può comportare una differenza di potenziale. Per una cellula a riposo, questa differenza di cariche elettriche attraverso la membrana cellulare è conosciuto come potenziale di membrana a riposo della cellula. Ci sono due fattori principali che affronterà che influenzano il potenziale di membrana di una cellula. Il primo è la concentrazione di ioni ai due lati della membrana. Il secondo è la permeabilità ionica della membrana. E 'importante tenere presente che in una cellula vivente ci sono una serie di diversi ioni, con concentrazioni variabili all'interno e all'esterno della cellula. Gli ioni chiave che affronteranno sono il sodio (Na +), potassio (K +) e cloro (Cl-). Le quantità e il movimento di questi ioni attraverso la membrana muscolare determina il potenziale di membrana. Da questa base, si possono affrontare potenziali elettrici osservati durante l'eccitazione elettrica e l'inibizione di una membrana dalle risposte sinaptica e di esaminare gli effetti di agenti farmacologici. Possiamo anche costruire modelli biofisici per rappresentare questi processi i concetti di test sperimentali (Robinson et al., 2010).

L'utilizzo di microelettrodi capillare di vetro permette la registrazione dei potenziali di membrana. L'elettrodo può essere inserito attraverso la membrana cellulare, senza danni, fornendo la punta è abbastanza piccolo e una misura precisa del potenziale transmembrana può essere ottenuto. La tecnica è particolarmente applicabile alle cellule di grandi dimensioni, che hanno meno probabilità di essere danneggiato da l'inserimento dell'elettrodo intracellulare. Questa è una delle tecniche fondamentali nella fisiologia.

Il saldo di Na + e K + attraverso la membrana è mantenuta dalla pompa Na-K ATPasi in condizioni fisiologiche. In condizioni normali le mosse della pompa, in media, tre Na + fuori dalla cellula e due K + all'interno della cellula. Come nota a margine, il Premio Nobel per la chimica è stato assegnato nel 1997 per questa scoperta fatta alla fine degli anni 1950. I fondamentali della scoperta sono stati ottenuti dalla ricerca usando assoni da un granchio (Skou, 1965, 1998).

Questa pompa è anche considerato elettrogenico in quanto ha una maggiore capacità di pompa quando la membrana è depolarizzata (Skou, 1989a, b). In molte cellule, la pompa accelera quando una cellula è elettricamente attivato da depolarizzazione.

Potassio può anche muoversi attraverso potassio "fuga" canali, mentre una cella è in uno stato di riposo. A causa di questi canali perdita di potassio, la membrana cellulare a riposo è più permeabile al potassio che ad altri ioni. Così, il potenziale di membrana a riposo della cellula è più vicino al potenziale di equilibrio per il potassio di quella per il sodio. Il potenziale di membrana a riposo può essere esaminata per vedere se dipende dal potenziale di equilibrio di potassio.

1) Muscle variabilità

Fibre muscolari crostacei mostrano una maggiore variabilità di caratteristiche strutturali, le proprietà elettriche della membrana e le proprietà contrattili di quanto non facciano le fibre muscolari vertebrati. Fibre muscolari fasiche nei crostacei vengono modificati per contrazione di tipo contrazioni. Sono caratterizzati da lunghezze sarcomero (2-4 micron), sottile, diritto Z-linee, un basso rapporto di sottili miofilamenti spessi, e ben sviluppato sistemi di T-tubuli e sarcoplasmaticoreticolo. Fasica membrane delle fibre muscolari possono generare potenziali d'azione graduale o tutto o niente. Fibre muscolari toniche, d'altra parte, vengono modificati per il mantenimento prolungato di tensione. Spesso hanno lunghezze sarcomero da 10 a 15 micron di spessore, le linee ondulate Z, un elevato rapporto di sottili miofilamenti spessi, e di sistemi meno sviluppati di T-tubuli e reticolo sarcoplasmatico. Tonico membrane delle fibre muscolari sono spesso elettricamente ineccitabili, o possono produrre classificato risposte elettriche ("spikes classificato"). Una vasta gamma di tipi di fibra intermedia è presente nei muscoli crostacei.

2) Equazioni

Equazioni che sono comunemente usati per determinare il potenziale di equilibrio di un potenziale di membrana di ioni e di riposo sono l'equazione di Nernst e la Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) equazione, rispettivamente. Una distinzione importante tra le due equazioni è che l'equazione di Nernst viene utilizzato solo per uno ione specifico per determinare il potenziale di equilibrio per lo ione, mentre l'equazione GHK viene utilizzato per determinare il potenziale di riposo, considerando la permeabilità degli ioni e delle loro molteplici sfumature attraverso una membrana cellulare (Nernst, 1888, 1889; Goldman, 1943; Hodgkin e Huxley, 1952; Hodgkin et al, 1952;. Hodgkin e Katz, 1949, vedi Hille, 1992).

L'equazione di Nernst è generalmente considerato per ioni attraverso la membrana generando una forza elettromotrice come comunemente indicato come:

V = (RT / ZF) ln ([X] out / [X] in)

X = ione di interesse
V = tensione di equilibrio per lo ione X attraverso la membrana
R = costante dei gas [8,314 J / (mol • K)]
T = temperatura assoluta [Kelvin]
Z = valenza dello ione
F = costante di Faraday [9,649 x 10 4 C / mol]

Per la K + ione a 20 ° C e la trasformazione dei Ln il login 10 insieme a compilare le costanti, si arriva a:

Potenziale = 58 log ([K a] / [K out]), espresso in mV

Supponiamo che K + è solo permeanti per diffusione. [K] è la concentrazione di K + all'interno della cellula e [k] è la concentrazione di K + all'esterno della cellula.

Come stima esercizio [K]. ______________

Supponiamo per questo calcolo, potenziale di membrana dipende solo dalla K + potenziale di equilibrio.

Data la [K out] = per la soluzione salina utilizzata è 5,4 mm. Inoltre, si assuma potenziale di membrana è-70mV.

Potenziale = 58 log ([K] / 5,4).

Nell'esperimento si misurerà potenziale di riposo della membrana delle cellule e determinare come esso è influenzato alterando [K out]. La pendenza della linea ipotetica relativo potenziale di membrana e [k] è 58. Dopo aver raccolto dati sul potenziale di membrana a riposo a vari [K out] (intervallo da 5,4 mm a 100 mm) saremo riportare i valori osservati per determinare se esiste una corrispondenza con la linea ipotetica. Useremo il potenziale di membrana a riposo medio ottenuto al 5,4 mM [K out] per l'avvio delle linee ipotetiche e osservati per un confronto.

Considerando che una membrana può essere permeabile a più ioni a riposo, così come in vari stati depolarizzata, si usa l'equazione GHK di prendere in considerazione la permeabilità (P nell'equazione) per vari ioni. L'equazione GHK ridurrà l'equazione di Nernst se una membrana è permeabile ad un solo ione.

Ecco una equazione GHK generalizzato per Na +, K + e Cl - ioni:

Equazione

Dal Cl - ha una carica negativa, il termine concentrazione si inverte in questa equazione per l'interno e l'esterno. Questo permette la Z (carica ionica) per essere lasciato.

3) Finalità di questo esercizio

In questo esperimento si misura il potenziale di membrana di una cellula muscolare gamberi e applicare i principi di cui sopra per l'indirizzo:

  1. Come misurare un potenziale di membrana cellulare con strumentazione appropriata e la tecnica.
  2. Permeabilità agli ioni della membrana cellulare del muscolo e come esso contribuisce al potenziale di membrana.

    Inoltre, faremo uno studio preliminare della struttura muscolare:
  3. Utilizzare le macchie per evidenziare l'anatomia dei muscoli nella parte dorsale dell'addome gamberi, che viene utilizzato per lo svolgimento di questi esperimenti di elettrofisiologia.
  4. Esaminare l'istologia di diversi tipi di fibra muscolare.

In questo esercizio di laboratorio, useremo il addominali muscoli estensori gamberi. Questa preparazione è stata utilizzata in passato per insegnare questi principi di fisiologia unod anatomia (Atwood e Parnas, 1968). Abbiamo usato molte delle procedure da questa fonte e gli altri modificati per strumentazione attuale e per completare gli obiettivi in ​​un singolo periodo studente 3 ore di laboratorio. Questi esercizi sono la base per altri esperimenti utilizzati nel corso Fisiologia Animale presso il Dipartimento di Biologia presso l'Università del Kentucky (Istruttore Dott. RL Cooper, 2010).

4) Perché questo modello animale

Ci sono diverse buone ragioni per l'utilizzo del addominali muscoli estensori gamberi in questo esperimento:

  1. Gamberi sono comunemente disponibili e sono relativamente economici e facili da mantenere in condizioni di laboratorio.
  2. La dissezione è relativamente facile per gli studenti l'apprendimento delle tecniche di dissezione per le preparazioni dal vivo.
  3. Il muscolo è stabile per diverse ore in una soluzione salina normale minimo che serve anche per gli studenti l'apprendimento delle tecniche elettrofisiologiche. La preparazione muscolare è abbastanza robusta quando esterno [K +] è alterata per brevi periodi.
  4. Varie risposte sinaptica può essere facilmente ottenuto attraverso la stimolazione dei neuroni motori.
  5. La disposizione anatomica dei muscoli estensori è facile discernere, e grazie alle loro grandi dimensioni è relativamente facile da ottenere stabile registrazioni intracellulari.
  6. I muscoli e il modello di innervazione può essere osservata facilmente con colorazione blu di metilene. Inoltre, particolari tipi di fibra muscolare può essere facilmente elaborati per l'esame istologico di osservare la struttura del sarcomero.
  7. Nessun protocollo di animali sono necessari in questo momento per le preparazioni animale invertebrato nella sperimentazione di laboratorio in molte istituzioni all'interno degli Stati Uniti.

2. Metodi

1) Materiali

  • Forbici (1)
  • Pinza (1)
  • Filo d'argento per il cavo di terra (1)
  • Microscopio (1)
  • Elettrodo sonda (1)
  • Capsula di Petri con Sylgard sul fondo (1)
  • Soluzione salina (1)
  • Soluzioni di potassio: 5.4mm (soluzione fisiologica), 10, 20, 40, 80, 100 mM
  • Bleach (piccola quantità, Usa per la punta del filo d'argento per la costruzione di Ag-Cl)
  • Pipetta di vetro (1), per rimuovere e aggiungere soluzioni
  • Siringa (1)
  • Amplificatore / sistema di acquisizione (1)
  • Gabbia di Faraday (1)
  • Desktop / Laptop (1)
  • Perni di dissezione (4)
  • Gambero

2) Metodi

2.1) Preparazione / Dissection:

  1. Un gambero di fiume di circa 6-10 cm di lunghezza del corpo deve essere ottenuto (o una dimensione gestibile). Tenere il gambero di fiume nella parte posteriore della testa o circa un centimetro dal fondo degli occhi. Garantire che gli artigli del gambero o la sua bocca non può raggiungere l'individuo manipolazione del gambero di fiume. (I gamberi possono essere immessi in ghiaccio per 5 minuti per anestetizzare la prima di tagliare la testa.)
  2. Utilizzare le forbici grandi per rimuovere rapidamente la testa. Fare un taglio netto e veloce da dietro gli occhi del gambero. Smaltire la testa e appendici.
    Figura 1
    Figura 1. Immagine mostra il posizionamento del taglio a rimuovere la testa del gambero.
  3. Le gambe e le chele del gambero può essere rimosso, a questo punto per evitare infortuni. Stiletti su maschi e swimmerets su entrambi maschi e femmine possono essere rimossi (Figura 2). Quindi, a parte l'addome dal torace. Fare un taglio lungo la membrana articolare che unisce l'addome e torace (Figura 3). Salva la parte dell'addome del gambero e disporre del torace.
    Figura 2
    Figura 2. Le forbici sono il taglio del stiletti. Questi possono essere rimossi dal gambero di fiume.
    Figura 3
    Figura 3. Immagine mostra il posizionamento del taglio per rimuovere il torace dall'addome.
    Figura 4
    Figura 4. Rimozione del torace dall'addome. Il taglio dovrebbe essere effettuato in modo circolare lungo la linea della giunzione dei segmenti.
    Figura 5
    Figura 5. L'immagine in alto mostra l'addome con appendici swimmeret. Immagine in basso mostra l'addome senza appendici swimmeret.
  4. Con l'addome, un taglio dovrebbe essere effettuato in guscio lungo il basso, bordo laterale di ogni lato del ventre. Si deve prestare attenzione a non tagliare troppo in profondità il gambero di fiume. Per aiutare nel processo di taglio del guscio, il taglio deve essere effettuato con le forbici che punta sprezzanti verso il lato ventrale e ad angolo. Seguono lo schema naturale guscio delle linee del gambero che corrono la lunghezza di ogni segmento (Figura 6).
    Figura 6
    Figura 6. Forbici sono posti in un angolo e seguire l'allineamento naturale del guscio. Non tagliare troppo a fondo e distruggere la preparazione. La freccia teste punto alla linea naturale lungo ciascun segmento che deve essere seguita per i tagli.
  5. Rimuovere la parte ventrale del guscio. Fare attenzione a non distruggere i muscoli addominali. Usare pinze per rimuovere la parte ventrale. Quando la parte ventrale del guscio viene rimosso, una massa di tessuto bianco può essere visto sopra dei muscoli flessori profondi. Questo tessuto può essere rimosso con cura con una pinza.
    Figura 7
    Figura 7. Rimozione della porzione ventrale del guscio con una pinza. Tirare verso l'alto e indietro sulla parte ventrale da rimuovere. Non distruggete muscoli sotto il guscio ventrale.
    Figura 8
    Figura 8. Tirare indietro la parte ventrale del guscio che è da scartare.
    Figura 9
    Figura 9. Tagliare la parte ventrale del preparato con le forbici e scartare.
  6. Il tratto GI, un piccolo tubo che corre lungo la linea mediana dei muscoli flessori profondi, può essere rimosso dal gambero di fiume. Pizzicare la parte superiore del tratto con la pinza e tirare fuori l'addome. Tagliare la parte inferiore del tratto - alla fine della coda. Sciacquare la dissezione con soluzione salina per assicurare i rifiuti fecali non interferisce con la preparazione.
    Figura 10
    Figura 10. Immagine mostra la rimozione del tratto gastrointestinale dalla preparazione.
  7. Utilizzare perni dissezione per fissare la preparazione alla piastra Petri. Gli angoli superiore e inferiore della preparazione deve essere immobilizzato al piatto. Soluzione salina deve essere versato nella piastra di Petri e coprire completamente la preparazione fino a quando le registrazioni intracellulari vengono eseguite.
    Questo piatto dissezione dovrebbe avere un (Dow Corning) Sylgard rivestimento sulla parte inferiore (1 cm di spessore) in modo che i pin di insetti possono essere bloccati in esso.
    Preparati sezionato sono immersi in soluzione salina gamberi standard, modificato dalla soluzione di Van Harreveld (1936), che è fatto con 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl 2; 2H 2 O; 2,45 MgCl 2; 6H 2 O, 5 HEPES e portato a pH 7.4 (in mm).

2.2) La registrazione intracellulare

Figura 11
Figura 11. Impostazione generale dell'apparecchio di controllo.

  1. La piastra di Petri con la preparazione deve essere posta sotto il microscopio e fissato con cera sul fondo del piatto per evitare il movimento.
    Figura 12
    Figura 12. Il posizionamento della preparazione sotto il microscopio. Utilizzare la cera per fissare il Petri e preparazione.
  2. Due fili ciascuno con un breve tratto di filo d'argento attaccato ad una estremità dovrebbe essere ottenuto. Il filo d'argento devono essere immersi in una piccola quantità di candeggina per circa 20 minuti per ottenere un rivestimento di Ag-Cl. Lavare il filo con acqua prima dell'uso. Una pipetta di vetro intracellulare deve essere ottenuto con attenzione e riempito con un lungo ago collegato a una siringa riempita con una soluzione di KCl 3M. La pipetta deve essere rifiutato (con l'apertura rivolta verso il pavimento) e riempito di soluzione. Questo farà sì che ogni KCl eccesso gocciolare sul retro dell'elettrodo. Assicurarsi che nessun KCl corre lungo la pipetta di vetro che entrerà nella vasca salina. Girare la pipetta in posizione verticale quando finito di riempire con una soluzione di cloruro di potassio. Il filo d'argento possono poi essere inseriti nella pipetta. L'altra estremità è collegata al polo + (positivo) sul palco testa amplificatore. La pipetta va poi fissato sulla sonda elettrodo. Cura dovrebbe essere fatta a non rompere la punta dell'elettrodo. Un terzo filo collegato alla gabbia di Faraday dovrebbe essere inserito nel polo verde dello stadio testa. Infine il filo di Ag del cavo rimanente deve essere collocato nella vasca da bagno e l'altra estremità collegata al - (negativo) polo illustrato di seguito. Un filo dovrebbe essere messo anche dalla gabbia di Faraday per la parte a terra del convertitore AD Powerlab. Lo stadio di testa è collegata al 'input-sonda' sull'acquisizione / amplificatore (Powerlab).
    Figura 13
    Figura 13. Fase di configurazione di testa. Il filo collegato all'ingresso verde dello stadio testa è a terra per l'amplificatore o gabbia di Faraday. Il filo collegato all'ingresso rosso è collegato al filo elettrodo. L'ingresso nero è utilizzato per collegare alla soluzione da bagno.
    Figura 14
    Figura 14. "Test passare" è nella riga in basso per verificare resistance.The elettrodo manopola "grossolano" si trova anchein offset DC che dovrebbe essere girato clock del contatore saggio. Guadagno è impostato su 50, che amplifica i segnali di un fattore di cinquanta. Il cavo di massa dal palco posto in testa è l'apertura "GND" pin jack.
  3. Il software LabChart dovrebbe essere aperto sul desktop o laptop. Regolare il grafico per visualizzare un solo canale facendo clic su "Impostazioni", poi "Impostazioni canale". Con il numero "Impostazioni Canale," cambiamento di canali a uno. Fare clic su "OK". Nella parte superiore della, angolo mano grafico a sinistra, cicli al secondo dovrebbe essere 2K. Set volt (asse y) a circa 200mV a 500mV. Clicca su "Canale 1" sulla parte destra dello schermo. Fare clic su "amplificatore di ingresso". Assicurarsi che la casella è selezionata differenziale.

    L'uscita dell'amplificatore dovrebbe essere in canale. Le seguenti impostazioni devono essere usati con l'amplificatore:
    • High Pass-DC
    • Notch Filter-OFF
    • Passa-basso-20kHz
    • Capacità Comp .- antiorario
    • DC Offset fine e Corso-manopola in senso antiorario
    • DC Offset (+ OFF-) - OFF
    • Manopola di guadagno-50
    • Ingresso (DIFF MONO GND) - DIFF
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
  4. Come misura della resistenza degli elettrodi, la tensione deve essere divisa per la corrente, che è pari a 2,0 nA (cioè, R = V / I, o legge di Ohm). Il valore risultante è la resistenza del elettrodo di vetro. La resistenza dovrebbe essere 20-60 megaohm. Basso (<20) e alta resistenza (> 100) non sono accettabili. Una volta che la resistenza è stata determinata, registrazioni intracellulari può iniziare. Posizionare la punta del elettrodo di vetro nel bagno salino. Assicurarsi che un cavo di terra è anche nella vasca salina.
    Per iniziare a registrare, premere start in basso dello schermo. Assicurarsi che il guadagno è impostato a 5 V / div. Utilizzare la manopola di rotta sull'amplificatore per spostare la linea sul LabChart a zero prima di inserire l'elettrodo. La manopola di commutazione dovrebbe essere acceso e poi spento più volte al fine di testare la resistenza degli elettrodi. Successivamente, l'ampiezza dei valori risultanti devono essere misurati. Posizionare un marcatore sulla linea di base stabile e poi il secondo posto al culmine di ottenere la resistenza degli elettrodi.
  5. Utilizzare la sonda elettrodo e microscopio per inserire l'elettrodo nei muscoli longitudinali (DEM o DEL1 o DEL2) della preparazione (vedi Figura 16). L'elettrodo dovrebbe a malapena essere inserito nel muscolo. Non penetrano attraverso il muscolo. Usa microscopio e le impostazioni della sonda per trovare i muscoli longitudinali e per inserire gli elettrodi nel muscolo. L'illuminatore ad alta intensità deve essere regolata di vedere chiaramente il muscolo come l'elettrodo viene inserito. Quando frugando fibre muscolari in questa preparazione si possono comunemente incontrare spazi e interstizi all'interno del muscolo. Questo è il motivo per cui il potenziale di membrana può apparire, poi scompare, poi riappare.
    Figura 15
    Figura 15. Inserimento di elettrodi nel muscolo.
  6. Per misurare il potenziale di membrana, utilizzare la manopola grossolana sull'amplificatore per spostare la linea sul LabChart a zero prima di inserire l'elettrodo. Poke una fibra muscolare. Quindi, misurare l'ampiezza dei valori risultanti. Mettere un segno sulla linea di base stabile e registrare il valore.
    La differenza tra i marcatori e il cursore attivo viene visualizzato sul lato destro dello schermo. Il valore si dà la tensione. La tensione ha registrato potrebbe aver bisogno di essere diviso per la quantità di amplificazione utilizzato l'amplificatore (cioè amplificazione 10x e 100x). La tensione deve essere convertiti da volt a millivolt (1 V = 1.000 mV) se i valori sono riportati sul software come volt.
  7. Usare con attenzione le microscopio e manipolatori di rimuovere l'elettrodo dal muscolo. Poke un'altra fibra muscolare e prendere nota del potenziale di riposo della membrana. Si dovrebbe prendere diverse registrazioni e di stare bene con misure così come dirigere l'elettrodo intercellulare nelle fibre muscolari di interesse.
    L'elettrodo probabilmente non soggiornare in una fibra muscolare durante il cambio di tutti i diversi alterato [K +] soluzioni fuori. E 'meglio ritirare l'elettrodo, quindi modificare la soluzione, poi penetrare ancora una volta per evitare di danneggiare il muscolo. È meglio ottenere 3 letture al soluzione da fibre muscolari separate e usare una media per evitare letture spurie.
  8. Utilizzare una siringa per rimuovere ed eliminare la soluzione salina dalla piastra di Petri. La piastra di Petri devono essere riempiti con la concentrazione immediatamente superiore di soluzione fisiologica di cloruro di potassio, che copre completamente la preparazione. Lo stesso processo deve essere ripetuto con ogni soluzione di potassio e le variazioni di tensione / potenziale dovrebbe essere notato e registrato. La serie di [K +] i gamberi soluzioni saline da noi utilizzati sono: 5,4, 20, 40, 60, 80, 100 mm.

2.3) Anatomia

Ora che la fisiologia è completato, possiamo esaminare il relativoanatomia delle fibre muscolari ed il modello innervazione. Trasferire la preparazione del piatto e aggiungere la colorazione blu di metilene (1 grammo di blu di metilene mescolati con 100 mL di soluzione salina gamberi). Lasciate che la soluzione salina bagnano la preparazione per 5 minuti e poi togliere e aggiungere salina fresca gamberi senza la macchia. L'anatomia di questi muscoli è stato descritto in dettaglio nel corso degli anni (Huxley, 1880; Pellegrino e Wiersma, 1963). Solo di recente alcuni dei muscoli stato descritto anatomicamente, fisiologicamente e biochimicamente (Cooper et al, 1998;. Griffis et al, 2000;. Sohn et al, 2000)..

Il layout generale anatomiche dei muscoli è mostrata in Figura 16 (lato destro della figura per questo scopo). Cercare il nervo principale che innerva i muscoli principalmente all'interno di un segmento. Disegnare il modello di innervazione al SEM, DEL2, DEL1 e DEM muscoli in un segmento. L'addome deve essere steso completamente da appuntare la preparazione nel piatto con fermezza. Avanti rimuovere la salina e aggiungere la soluzione di fissativo. La soluzione correzione è soluzione di un Bouin (preparata con acido picrico saturo, formaldeide e acido acetico, Sigma-Aldrich).

ATTENZIONE. Non ottenere questa soluzione sulla pelle o negli occhi. Evitare i vapori della soluzione, lavorando sotto la cappa. Se i tuoi occhi cominciano a bruciare gli occhi lavare immediatamente presso la stazione di lavaggio oculare.

Lasciate che la soluzione di Bouin rimangono sulla preparazione per circa 10 minuti e poi usare una pipetta e di scambio per la soluzione salina. Tagliare un sottile pezzo di DEL1 o DEL2 fuori muscolare e posto su un vetrino. Etichettare il vetrino. Ripetere la procedura per il muscolo SEM. Visualizza il modello sarcomero bande in entrambe le preparazioni di tessuto. È possibile utilizzare il microscopio composto e regolare gli obiettivi di conseguenza per vedere i modelli di bande. Se possibile scattare una foto digitale attraverso l'oculare del microscopio (nota: alcune macchine fotografiche del telefono delle cellule funzionano bene per questa procedura).

Figura 16
Figura 16. Schema da una visione ventrale della parte dorsale dell'addome gamberi mostra la muscolatura estensoria di ogni segmento. La dorsale muscolo dell'addome membrana (DMA) e la superficiale estensori testa muscolo accessorio (SEAcc) si verificano in segmenti da 1 a 5 del ventre con un orientamento diverso per ogni segmento. Con l'eccezione del segmento 1, questi muscoli hanno i loro siti attaccamento alla loro estremità anteriore al tergite calcificato e alla fine posteriore della membrana articolare. Nel segmento 1, il omologhi muscoli hanno i loro siti attaccamento anteriore alla membrana articolare trova tra il torace e l'addome. L'illustrazione è stata basata su montaggi fotografici di blu di metilene preparati colorati. Sul lato sinistro della figura tutti i muscoli estensori profondi sono stati rimossi per mostrare i muscoli estensori dorsali superficiali. Scale = 2,35 mm. (Tratto da Sohn et al. 2000).

3. Risultati

Le seguenti domande ed elaborazione dei dati illustrano i principi e gli obiettivi principali di questa procedura di laboratorio.

  1. Tracciare i provvedimenti ottenuti per i potenziali di membrana a riposo ad ogni [K +] fuori uso. Vedere se le linee osservate e ipotetico sono abbinati a loro pendenza. Per tracciare i valori d'uso un semi-log complotto con l'asse x di vario [K +] come un tronco e l'asse y dei potenziali di membrana (come illustrato di seguito: Figura 17). (Scarica carta libera grafico, se necessario http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ )
    Figura 17
    Figura 17. Grafico carta
    Utilizzare il potenziale di membrana a riposo medio ottenuto al 5,4 mM [K +] per iniziare le linee ipotetiche e osservati per un confronto.
    Se le linee non corrispondono discutere perché questo potrebbe essere.
  2. Se avete modificato il livello esterno di ioni Na +, ci si può aspettare lo stesso tipo di alterazioni come osservato per la modifica della concentrazione di K +?
  3. Quanto bene ha fatto di blu di metilene macchia i muscoli rispetto ai nervi? Perché potrebbero esserci delle differenze? È il blu di metilene oggi utilizzato per l'identificazione di tessuto o di contrasto in vivo le cellule umane? Che rapporto c'è con Sigmund Freud e le macchie utilizzato in gamberi?
  4. Prendere nota di eventuali differenze nei modelli di sarcomero tra il CANC e muscoli SEM. Se è così, quello che potrebbe essere il motivo? Non tutti i muscoli hanno le stesse distanze sarcomero a riposo? Disegnare il modello muscolare bande si osserva al microscopio e l'etichetta come gran parte della figura più possibile (in relazione al noto anatomia del muscolo sarcomero).

4. Misurazione Re Synapticsponses

1) INTRODUZIONE

La preparazione addominale muscolo estensore usati per dimostrare il potenziale di riposo della membrana è ideale anche per dimostrare l'induzione di risposte sinaptiche al NMJs dai vari muscoli. Alcuni muscoli nei crostacei sono selettivamente innervate sia da un fasico o tonico dei neuroni motori, anche se alcune singole fibre possono essere innervate da entrambi i neuroni fasica e tonica motore eccitatori, come per muscolo estensore del gambero di fiume a piedi gambe (Atwood, 2008; vedere JOVE produzione id # 2319-Wu e Cooper, 2010) e la maggior parte dei muscoli degli arti altri (Wiersma, 1961a). Da stimolare selettivamente i motoneuroni fasici e tonici, differenze fisiologiche nei epsps può essere misurata. Motoneuroni fasici produrre una rapida contrazione delle fibre muscolari ed evocano EPSPS dell'ordine di 10-40 mV. La risposta fasica possono deprimere rapidamente con 5-10-Hz treni di stimolazione. I motoneuroni tonici danno luogo a piccole EPSPS che può essere facilitato in presenza di una frequenza più elevata (10-50 Hz) di stimolazione. Strutturalmente, i terminali presinaptici fasica e tonica al NMJs sono diversi (Atwood e Cooper, 1996; Bradacs et al, 1997;.. Cooper et al, 1998).

Sorprendentemente il fenotipo delle risposte fasiche fisiologiche possono subire una trasformazione di un tonico stato simile da parte dei neuroni di condizionamento elettrico fasica per poche ore al giorno per 7 giorni (Cooper et al, 1998;. Mercier e Atwood, 1989). Anche la sensibilità di neuromodulazione del NMJs trasformato è primo per studiare la regolazione dell'espressione dei recettori (Griffis et al., 2000).

In questa preparazione relativamente robusta (gamberi muscoli addominali), entrambe le risposte tonica e fasica sono facilmente registrati e esaminati per agevolazione e / o depressione delle risposte sinaptiche con paradigmi di stimolazione variata. Con questi preparativi, gli studenti saranno in grado di riconoscere generalità delle risposte fasica e tonica sinaptica stimolando un fascio nervoso.

Una preparazione aggiuntiva NMJ presentato viene utilizzato per il monitoraggio dell'attività intrinseca del motore e stimolo sensoriale attività motoria indotta dal sistema nervoso centrale. Questo è il muscolo flessore superficiale sul lato ventrale dell'addome gamberi. Questa preparazione sarà utilizzato anche per monitorare la SNC-sensoriale-motorio-muscolare del circuito e gli effetti di neuromodulatori (Strawn et al., 2000).

In ciascuno dei segmenti addominali (tranne l'ultimo) ci sono tre gruppi funzionali di muscoli: (1) coloro che controllano pleopod (swimmerets) movimento, (2) tre muscoli estensori e (3) tre muscoli flessori. I flessori ed estensori sono gruppi antagonisti di muscoli che determinano sia flessione o estensione addominale causando rotazione intorno le cerniere intersegmentale. La muscolatura fasica occupa la maggior parte del volume dell'addome, mentre i muscoli tonici comprendono fogli sottili di fibre che attraversano la dorsale (estensori) e ventrale (flessori) aspetto di ogni segmento addominale.

In gamberi, i muscoli addominali tonici flessori di gamberi sono innervate in ogni segmento di mezzo da cinque motoneuroni e da un neurone periferico inibitorio. I motoneuroni eccitatori usano il glutammato come neurotrasmettitore. Glutammato depolarizza le fibre muscolari, provocando un aumento della permeabilità principalmente agli ioni sodio. I neuroni inibitori rilascio gamma-ammino butirrico (GABA), che hyperpolarizes di solito le fibre muscolari, provocando un aumento della permeabilità agli ioni cloruro. In alcuni muscoli crostacei (soprattutto negli arti), i neuroni inibitori periferici contatti sinaptici con motore terminazioni neuronali così come con le fibre muscolari, e ridurre la quantità di trasmettitore rilasciata dal neurone motore (inibizione presinaptica) (Dudel e Kuffler, 1961 ). Questo fenomeno non è presente nei muscoli flessori tonico di gamberi.

Il cordone nervoso ventrale del gambero di fiume è una struttura di simmetria bilaterale che corre lungo l'animale. C'è un ganglio per ogni segmento del corpo. Nell'addome (6 segmenti), ogni ganglio contiene diverse centinaia di neuroni, e ciascuno dei due connettivi consiste di poche migliaia di assoni. I corpi delle cellule nervose formano un diversi corpi cellulari spesso strato sulla superficie ventrale di ogni ganglio. Immediatamente sopra lo strato corpo cellulare è un sottile reticolo di processi neuronali, l'neuropile. Tutte le interazioni sinaptiche avvengono qui, i corpi cellulari sono privi di sinapsi.

Ogni ganglio addominale (tranne l'ultimo) ha tre radici su ogni lato. La prima radice contiene gli assoni dei neuroni che innervano la muscolatura pleopod e assoni sensoriali, la seconda radice contiene assoni innervano fasica e tonica muscolatura estensoria e assoni sensoriali, e la terza radice, che lascia i millimetri cordone nervoso diversi caudale al ganglio, contiene assoni innervating muscolatura flessoria fasica e tonica. Ci sono due rami della terza radice. Il ramo profondo (IIIa) innerva i muscoli flessori solo fasica. Il ramo superficiale della radice terza (IIIb) in ciascuna metà contiene sei segmento assoni che innervano i muscoli flessori tonico.

I neuroni che innervano il flessore tonico sono spontaneamente attivi, a differenza dei neuroni efferenti fasica, e in una buona preparazione, essi continueranno a sparare per molte ore dopo l'addome è stato rimosso dall'animale. Per una rassegna della natura storica delle scoperte fatte in questi preparativi addominale vedere Atwood (2008). I corpi cellulari dei quattro dei motoneuroni e del neurone periferico inibitorio che innervano il muscolo flessore tonico in ogni segmento di mezzo si trovano nel ganglio di quel segmento. Il corpo cellulare dei rimanenti motoneuroni si trova nel ganglio prossimo caudale. Questi neuroni possono essere attendibilmente distinti l'uno dall'altro sulla base di extracelluarly registrato ampiezze picco. Se il muscolo flessore tonico da un segmento di mezzo viene rimosso insieme alle due gangli contenente i neuroni che innervano questo muscolo, cinque neuroni di solito mostrano un certo grado di attività spontanea. Questi neuroni sono numerati sulla base del relativo picco di ampiezza extracellulare, in ordine crescente. F1 a F4 e F5 sono motoneuroni, il più grande neurone attivo spontaneamente, è l'inibitore periferico flessori. f6, il più grande dei motoneuroni, è una dei motoneuroni eccitatori che raramente spontaneamente attiva.

La natura spontanea di attività tonica del motoneurone può essere modulata mediante l'applicazione di composti esogeni o fornendo uno stimolo sensoriale per la cuticola nello stesso segmento che viene monitorato per l'attività del nervo motore.

2) La dissezione

Per ottenere la preparazione degli estensori addominale la stessa procedura sopra descritta per l'esame delle potenziali di membrana a riposo in relazione al potassio extracellulare. La differenza è di prendersi cura del fascio nervo segmentale che corre lungo il lato del carapace. Questo nervo sarà tirato in un elettrodo di aspirazione che servirà come l'elettrodo stimolante. Stimolare a 1 Hz per il monitoraggio risposte fasiche. Stimolare con brevi sequenze di impulsi di 10 Hz per 10 a 20 stimoli, mentre il monitoraggio delle risposte tonico.

Le procedure sperimentali per la cura degli esperimenti sui muscoli flessori gamberi tonici sono differenti e si ha la necessità di lasciare il cordone nervoso ventrale intatto. Una preparazione composti da più segmenti addominali è fatto. Questo si ottiene come segue:

  1. Un gambero di fiume di circa 6-10 cm di lunghezza del corpo deve essere ottenuto (o una dimensione gestibile). Ottenere i gamberi tenendolo dalla parte posteriore della testa a circa i 2 o 3 centimetri dalla parte posteriore degli occhi. Garantire che gli artigli del gambero o la bocca non riesce a raggiungere lo sperimentatore durante la manipolazione del gambero di fiume. Smaltire la testa e appendici dopo averli rimossi.
  2. Utilizzare le forbici per rimuovere rapidamente la testa. Fare un taglio netto e veloce da dietro gli occhi del gambero.
    Figura 18
    Figura 18. Immagine mostra il posizionamento del taglio a rimuovere la testa del gambero.
    Le gambe e le chele del gambero può essere rimosso, a questo punto per evitare infortuni. Stiletti su maschi e swimmerets su entrambi maschi e femmine possono essere rimossi (Figura 19 e 20). Quindi, a parte l'addome dal torace. Fare un taglio lungo la membrana articolare che unisce l'addome e torace (Figura 20).
  3. Salva la parte dell'addome del gambero e disporre del torace.
    Figura 19
    Figura 19. Immagine mostra la posizione del stiletti che può essere rimosso dal gambero di fiume.
    Figura 20
    Figura 20. Immagine mostra il posizionamento del taglio per rimuovere il torace dall'addome.
    Figura 21
    Figura 21. Rimozione del torace dall'addome. Il taglio dovrebbe essere effettuato in modo circolare lungo la linea di giunzione dei segmenti.
    Figura 22
    Figura 22. L'immagine in alto mostra l'addome con appendici. Immagine in basso mostra la rimozione delle appendici addominali.
  4. Mettere il preparato isolato coda in soluzione salina in un grande piatto di Petri. Definire con precisione la parte superiore della coda e la preparazione al piatto. Assicurarsi che la preparazione è sicuro. Utilizzare un bisturi per rimuovere una porzione quadrata di lato ventrale della preparazione tra le costole.
    Figura 23
    Figura 23.Mostra dove il taglio dovrebbe essere fatto per rimuovere la pozione ventrale della preparazione.
  5. Un piccolo taglio deve essere fatto (può anche essere fatto con le forbici). Un lembo deve essere tagliato e sollevato verso l'alto. Il lembo può essere rimossa con le forbici, esponendo i muscoli flessori profondi. Il microscopio deve essere usato durante questo processo per assicurare la precisione nella rimozione della porzione ventrale del preparato.
    Figura 24
    Figura 24. Preparazione di taglio con le forbici per esporre i muscoli.
    Figura 25
    Figura 25. Top immagine mostra la afferrare del lembo con una pinza. Immagine in basso mostra la rimozione del lembo dalla preparazione utilizzando il microscopio.
    Figura 26
    Figura 26. Esposizione dei muscoli flessori superficiali.

3) Registrazione intracellulare:

Figura 27
Figura 27. Impostazione generale dell'apparecchio di controllo.

  1. La piastra di Petri con la preparazione deve essere posta sotto il microscopio e fissato con cera sul fondo del piatto per evitare il movimento.
    Figura 28
    Figura 28. Mostra il posizionamento della preparazione sotto il microscopio. Utilizzare la cera per fissare il Petri e preparazione.
  2. Due fili con breve tratto di filo d'argento attaccato ad una estremità dovrebbe essere ottenuto. Il filo d'argento devono essere immersi in una piccola quantità di candeggina per circa 20 minuti per ottenere un rivestimento di Ag-Cl. Lavare il filo con acqua prima dell'uso. Una pipetta di vetro intracellulare deve essere ottenuto con attenzione e riempito con una (3 M) soluzione di KCl. La pipetta deve essere rifiutato (con l'apertura rivolta verso il pavimento) e riempito di soluzione. Quest'ultimo farà in modo che qualsiasi KCl eccesso gocciolare sul retro dell'elettrodo. Assicurarsi che nessun KCl corre lungo la pipetta di vetro che entreranno nel bagno salino. Girare la pipetta in posizione verticale quando finito di riempire con una soluzione di cloruro di potassio. Il filo d'argento possono poi essere inseriti nella pipetta. L'altra estremità è collegata al polo + (positivo) sul palco testa. La pipetta va poi fissato sulla sonda elettrodo. Cura dovrebbe essere fatta a non rompere la pipetta elettrodo. Un terzo filo collegato alla gabbia di Faraday dovrebbe essere inserito nel polo verde dello stadio testa. Infine il filo di Ag del cavo rimanente deve essere collocato nella vasca da bagno e l'altra estremità collegata al - (negativo) polo illustrato di seguito. Un filo dovrebbe essere messo anche dalla gabbia di Faraday per la parte a terra del convertitore AD Powerlab. Lo stadio di testa è collegata al "input-sonda" sull'acquisizione / amplificatore (Powerlab).
    Figura 29
    Figura 29. Fase di configurazione di testa. Il filo collegato alla parte verde dello stadio testa è a terra per l'amplificatore o gabbia di Faraday. Il filo collegato alla parte rossa è collegata al filo elettrodo. La parte nera è utilizzata per collegare alla soluzione da bagno.
    Figura 30
    Figura 30. "Test passare" è nella riga in basso per test di resistenza elettrodo. La manopola "grossolano" si ritrova anche in offset DC che dovrebbe essere girato clock del contatore saggio. Guadagno è impostato su 50, che amplifica i segnali di un fattore di cinquanta. Il cavo di massa dal palco posto in testa è l'apertura "GND" pin jack.
  3. Il software LabChart dovrebbe essere aperto sul desktop o laptop. Regolare il grafico per visualizzare un solo canale di cliccare su "Impostazioni", poi "Impostazioni canale". Con il numero "Impostazioni Canale," cambiamento di canali a uno. Fare clic su "OK". Nella parte superiore della, angolo mano grafico a sinistra, cicli al secondo dovrebbe essere 2K. Set volt (asse y) a circa 200mV a 500mV. Clicca su "Canale 1" sulla parte destra dello schermo. Fare clic su "amplificatore di ingresso". Assicurarsi che la casella è selezionata differenziale.

    L'uscita dell'amplificatore dovrebbe essere in canale. Le seguenti impostazioni devono essere usati con l'amplificatore:
    • High Pass-DC
    • Notch Filter-OFF
    • Passa-basso-20kHz
    • Capacità Comp .- antiorario
    • DC Offset fine e Corso-manopola in senso antiorario
    • DC Offset (+ OFF-) - OFF
    • Manopola di guadagno-50
    • Ingresso (DIFF MONO GND) - DIFF
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
  4. Per misurare la resistenza degli elettrodi, la tensione deve essere divisa per la corrente, che è pari a 2,0 nA. Il valore risultante è la resistenza del elettrodo di vetro. La resistenza dovrebbe essere 20-60 megaohm. Una volta che la resistenza è stata determinata, registrazioni intracellulari può iniziare. Posizionare la punta del elettrodo di vetro nel bagno salino. Assicurarsi che un cavo di terra è anche nella vasca salina.
    Per iniziare a registrare, premere il tasto "start" nella parte inferiore dello schermo. Assicurarsi che il guadagno è impostato a 5 V / div. Utilizzare la manopola di rotta sull'amplificatore per spostare la linea sul LabChart a zero prima di inserire l'elettrodo. La manopola di commutazione dovrebbe essere acceso e poi spento più volte al fine di testare la resistenza degli elettrodi. Successivamente, l'ampiezza dei valori risultanti devono essere misurati. Posizionare un creatore della linea di base stabile e poi il secondo posto al culmine di ottenere la resistenza degli elettrodi.
  5. Utilizzare la sonda elettrodo e microscopio per inserire l'elettrodo nel muscolo. Non penetrano attraverso il muscolo. Usa microscopio e le impostazioni della sonda per trovare il sottile strato di fibre muscolari e di inserire gli elettrodi nelle fibre. L'illuminatore ad alta intensità può essere utilizzato come una sorgente di luce quando penetra il muscolo.
    Figura 31
    Figura 31. Inserimento di elettrodi nel muscolo.
  6. Bisogna fare attenzione a non danneggiare le radici dei nervi ai muscoli superficiali.
    Si consiglia di mantenere il bagno salino alla preparazione fresco (10-15 gradi Celsius) e ben ossigenato, mentre l'esecuzione delle procedure sperimentali. Se le unità di raffreddamento non sono disponibili sostituire la soluzione salina fresca, raffreddata salina regolarmente. Ossigeno gassoso, o almeno l'aria, deve gorgogliare attraverso la soluzione salina.
  7. Registrare l'attività spontanea del EPSPS. Notare le diverse dimensioni del EPSPS IPSPs e se sono presenti.
  8. Molto attentamente prendere un piccolo cespuglio di vernice e stimolare a mano lungo il bordo cuticola nello stesso segmento che si sta monitorando l'attività spontanea. Nota un cambiamento nella frequenza delle risposte e se EPSPS diverse dimensioni sembrare che non erano lì prima di stimolare la cuticola.
    Figura 32
    Figura 32. Preparazione con pennello e stimolante radici nervose. (Modificato da Strawn et al, 2000).
  9. La stimolazione può essere ripetuto dopo aver attentamente scambiare il bagno con una soluzione salina contenente un neuromodulatore come la serotonina (1 microM) o di soluzione fisiologica con bolle di CO 2. Notare l'effetto sul profilo di attività per un dato stimolo. Si noti anche se lo scambio sul retro salina a salina fresca torna l'attività alla sua condizione iniziale.
  10. Successivamente, si può monitorare l'attività neurale all'interno del sensorio-SNC-Circuito del motore neurone in vari modi. Possiamo usare un elettrodo di aspirazione al posto di un elettrodo intracellulare (Figura 33) per monitorare l'attività dei neuroni motori. Sulla punta dell'elettrodo di aspirazione in vetro, tubi in plastica è posto, che ha un'apertura di dimensioni corrette per tirare il nervo nella punta. L'apertura non deve essere troppo grande, come il nervo sarebbe caduta fuori, o troppo piccolo, perché il nervo potrebbe essere danneggiato dalla pressione dell'elettrodo. Il tubo di plastica è tirato sopra una fiamma e tagliato tornare alla dimensione necessaria.
    Figura 33
    Figura 33. Istituito con la disposizione degli elettrodi di registrazione di aspirazione.
    Posizionare il micromanipolatore in una posizione in cui l'elettrodo di aspirazione ha un facile accesso al bagno salino. Aspirazione fino salina fino a quando non è in contatto con il filo d'argento all'interno dell'elettrodo di aspirazione. Disporre l'altro filo sul taglio sul lato di aspirazione elettrodi vicino alla punta di elettrodo, in modo da entrambi i cavi saranno in contatto con il bagno salino.
    Per quanto riguarda il monitoraggio elettrico collegare l'alimentatore AC / DC amplificatore differenziale (amplificatore) a 26T Lab il Potere. Per fare ciò, collegare il cavo corretto da ingresso 1 sulla 26T PowerLab all'uscita dell'amplificatore.
    • I controlli amplificatore strumento deve essere impostato per le seguenti impostazioni:
      • High Pass-DC
      • Notch Filter-OFF
      • Passa-basso-20kHz
      • Capacità Comp .- antiorario
      • DC Offset fine e Corso-manopola in senso antiorario
      • DC Offset (+ OFF-) - OFF
      • Manopola di guadagno-50
      • Ingresso (DIFF MONO GND) - DIFF
      • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
      • ΩTEST-OFF
    Collegare la fase di testa al 'input-sonda' sull'amplificatore.
    Collegare i fili elettrici dall'elettrodo aspirazione alla fase testa. I fili devono essere collegati con il rosso (positivo) in alto a sinistra, verde (terra) al centro, nero (negativo in basso. Questo è indicato in Figura 34. Il cavo di terra può solo essere messo nella vasca da bagno salino.
    Figura 34
    Figura 34. Testa fase di configurazione
  11. Ora collegare il cavo USB dal 26T PowerLab al computer portatile. Assicurare che sia l'amplificatore e PowerLab26T siano collegati e accesi prima di aprire LabChart7 sul computer.
  12. Aperto LabChart7.
    • Il Welcome casella Centro LabChart si aprirà. Chiuderlo. </ Li>
    • Fare clic su Setup
    • Clicca sulle impostazioni dei canali. Modificare il numero di canali a 1 (in basso a sinistra della scatola) premere OK.
    • In alto a sinistra del grafico di cicli al secondo a circa 2k. Impostare il volt (asse y) a circa 500 o 200 mV.
    • Clicca sul canale 1 sulla destra del grafico. Clicca su amplificatore di ingresso. Assicurarsi che le impostazioni: single-ended, accoppiamento AC, e invertire (inverte il segnale, se necessario), e anti-alias, sono controllati.
    • Per iniziare la stampa avviare la registrazione.
    Siamo in grado di registrare dal ramo della radice 3 ° che innerva il muscolo flessore superficiale (ramo III ter) per monitorare dimensioni del potenziale d'azione con la registrazione extracellulare. Gli impulsi nervosi extracellulare sono indicati come 'picchi'. Ricordiamo che ci sono cinque i motoneuroni excitor e un neurone inibitore motore in questa radice (Kennedy e Takeda, 1965; Velez e Wyman, 1978). La stimolazione della cuticola con una spazzola o l'esposizione di neuromodulatori possono essere utilizzati (Figura 35). Il pennello può essere utilizzato a mano o per la stimolazione costante potrebbe essere montato su un micromanipolatore per controllare la quantità di pressione e il movimento.
    Figura 35
    Figura 35. Attività della radice 3 °, prima e durante la stimolazione cuticolare in soluzione salina (in alto) e in 100 nM 5-HT (in basso). Il tempo durante la stimolazione cuticola è indicato dalla barra. Si noti la maggiore attività prima e dopo la stimolazione quando la preparazione è immerso in 5-HT (modificato da Strawn et al., 2000).
    Siamo in grado di registrare dal 1 ° o 2 ° radici facendo una registrazione en passant del nervo, oppure possiamo transetto la radice di distanza dal record di input VNC e pura sensoriale derivante dalla periferia che sarebbe l'invio di segnali in VNC. Quindi, si dovrebbe registrare dalla radice sezionati che porta alla periferia per l'attività sensoriale.
    Il 2 ° radice contiene assoni primari molto grandi organi afferenti dai recettori del muscolo (MRO) e più piccoli di assoni efferenti ai estensori motoneuroni (Campi e Kennedy, 1965). Ci sono molti assoni sensoriali nel 1 ° e 2 ° radici.
    I neuroni mechanosensory hanno collegamenti diretti, da sinapsi elettriche con gli assoni giganti laterali (LG) (Krasne 1969; Zucker 1972). Inoltre, i neuroni mechanosensory sono noti per eccitare interneuroni tramite sinapsi chimiche.
    Per esaminare in che modo l'input sensoriale può influenzare l'attività dei motoneuroni, attraverso un senso-SNC-motoneurone circuito, siamo in grado di registrare le risposte sinaptica in un muscolo. Vari aspetti del circuito useremo può essere esaminato. Per esempio, possiamo registrare dalla radice del nervo sensitivo solo o la radice motore, con o senza intatto input sensoriale in VNC Per analizzare le registrazioni di frequenza picco, si può contare per un lungo periodo in condizioni diverse. Le misure possono essere effettuate prima di pennello stimolazione e durante la stimolazione pennello per un determinato periodo di tempo (Figura 35). Si può ripetere le condizioni di 5 volte e di ottenere la variazione media percentuale di frequenza come misura per fare paragoni.
    Si può anche applicare composti esogeni come la serotonina (Strawn et al., 2000) o acetilcolina (Ach), la nicotina o glutammato. Varie azioni comportamentali sono stati descritti per la nicotina negli invertebrati. Ciò suggerisce la presenza di recettori nicotinici (Tsunoyama e Gojobori, 1998). Il glutammato è un neurotrasmettitore eccitatorio principale nella maggior parte dei invertebrati al NMJ e Ach è il principale neurotrasmettitore eccitatorio nel sistema nervoso centrale (Monoghan et al, 1989;. Watkins, et al, 1990).
    Si può provare eptanolo o CO 2 bolle salina poiché essa disaccoppiare i gamberi settate (o gap) giunzioni all'interno del circuito con il nome Dr. Sonya M. Bierbower (University of Kentucky) ha dimostrato nella sua tesi di dottorato di ricerca. Questa azione può spiegare alterato comportamento animale intero se esposti a CO 2 elevata nell'ambiente (Bierbower e Cooper, 2010). Quando si stimolano le cuticole con un pennello e ingresso disco sensoriali e registrare una risposta nei motoneuroni, nota se c'è una differenza nell'attività prima e durante eptanolo o CO 2 esposizione. Questo può o non può suggerire giunzioni gap di avere un ruolo nel senso-SNC-motoneurone circuito.

Discussion

Potenziale di membrana

Già nel 1902, Bernstein aveva a che fare con i temi di un potenziale di riposo nel assone di un calamaro. E 'interessante considerare come queste prime idee e osservazioni di Berstein (1902) e Nernst (1888) in seguito influenzato la ricerca in fisiologia della membrana. (Vedi recensione di Malmivuo e Plonsey, 1995, disponibile anche sul www http://www.bem.fi/book/ ). Ci sono ancora, fino ad oggi, le scoperte in corso sulla funzione dei canali ionici e le proprietà delle membrane biologiche che sono molto importanti per comprendere la fisiologia cellulare, che si riferisce alla funzione di tessuti, organi e sistemi.

Il confronto degli effetti sperimentali e teoricamente derivata esterno [K +] sul potenziale di membrana a riposo indica l'influenza di ioni sul potenziale di membrana. Ulteriori esperimenti utilizzando questa stessa preparazione rimangono da eseguire per affrontare le domande fondamentali fisiologico. Alcuni sono stati evidenziati nel 1968 da Atwood e Parnas e devono ancora essere pienamente affrontato. Con le tecniche ottenute in questo esercizio, si può procedere a rispondere a molte domande ancora in altre preparazioni sperimentali così come nelle applicazioni fisiologiche legate alla medicina e alla salute. Abbiamo dimostrato l'utilità di una preparazione invertebrati modello per affrontare questioni fondamentali pertinenti a tutti gli animali.

Con le conoscenze acquisite sui gradienti elettrochimici degli ioni in questo esercizio di cui sopra, è ora possibile passare alla eccitabilità delle membrane esaminando la trasmissione sinaptica a preparati neuromuscolari in gamberi.

Misura Risposte Synaptic

I dati forniti per la prima parte di questo laboratorio, e il film associati, hanno fornito passaggi chiave per la registrazione di potenziali di membrana e indagare la struttura muscolare. Nella seconda parte di questo laboratorio, la dimostrazione di dissezione e di registrazione, la trasmissione sinaptica alla NMJs di unità motorie fasica e tonica ha fornito una esposizione a concetti fondamentali nella fisiologia. L'esposizione ad un circuito neurale, che può in parte può essere usata per spiegare comportamenti associati, nell'animale intatto ha un potenziale non solo per gli studenti per studiare varie questioni di tipo aperto all'interno del loro esercizio di laboratorio, ma anche per la ricerca futura sui circuiti neuronali in un pozzo invertebrati preparazione stabilita (Kennedy et al, 1969;. Antonsen e Edwards, 2003)

Queste preparazioni possono essere utilizzati anche per studiare facilitazione sinaptica, depressione e lungo termine plasticità (non indagato in questo studio di laboratorio). Anche all'interno di alcune specie di gamberi, plasticità neuronale dipende dallo stimolo condizioni sperimentali (Mercier e Atwood, 1989;. Cooper et al, 1998) così come la loro ambiente naturale. In che misura la capacità di alterare l'efficacia sinaptica e la dinamica dei muscoli serve l'animale resta ancora da esplorare. Dal gambero si alterano il loro comportamento in relazione alle variazioni stagionali e il ciclo di muta, ci sono relativamente a lungo termine differenze attività nei loro sistemi neuromuscolare. E 'stato dimostrato che la fasica terminali del motore nervose dei muscoli artiglio più vicino esporre la morfologia classica fasica durante l'inverno, ma si gonfiano e diventano più varicose per tutta la lunghezza del terminale durante i mesi estivi (Lnenicka 1993; Lnenicka e Zhao, 1991).

Alcuni primi studi condotti in laterale gamberi giganti (LG) interneuroni all'interno del cordone nervoso ventrale dimostrato la presenza di giunzioni gap (Johnson, 1924; Watanabe e Grundfest, 1961). E 'noto che la CO2 ha un effetto sulla comunicazione elettrica di disaccoppiamento giunzioni gap (Arellano et al, 1990). E 'stato recentemente dimostrato che il cordone nervoso e la comunicazione all'interno del sistema nervoso centrale-sensoriale-motorio-muscolare del circuito, come descritto nella presente relazione, è anche sensibile al CO 2 l'esposizione, che indica la presenza di giunzioni gap (Bierbower, 2010; Bierbower e Cooper, 2010)

L'attività spontanea della radice 3 ° motore è stato un argomento in quanto il 1960, quando Eckert (1961) ha esaminato se il tonico di tiro statico organo recettore muscolare (MRO) nello stesso segmento o vicini potrebbe spiegare l'unità motoria spontanea. In questi studi precedenti è emerso che l'attività è stata guidata all'interno del cordone nervoso ventrale (VNC) eventualmente da centri superiori (Eckert, 1961; Kennedy e Takeda, 1965a, b;. Strawn et al, 2000). Poiché la presenza di CO 2 smesso l'attività spontanea, si può assumere in qualche parte del disco ai motoneuroni potrebbe esserci giunzioni gap o glutamatergica disco eccitatori. Il NMJs sono bloccati o esibire diminuita sensibilità al glutammato in presenza di CO 2, e possono essere bloccoKED come pure all'interno del sistema nervoso centrale (Bierbower, 2010; Bierbower e Cooper, 2010; vedi anche Badre et al, 2005)..

L'azione di diversi neuromodulatori è anche facilmente studiato i vari tipi di NMJs (Cooper e Cooper, 2009; Griffis et al, 2000;. Southard et al, 2000;.. Strawn et al, 2000). Inoltre, varie influenze sono esercitate dai neuromodulatori sul circuito nervoso centrale. È stato suggerito che la 5-HT e neuroni octopaminergic può funzionare come 'guadagno-setter' nel alterando la produzione di circuiti neuronali (Ma et al, 1992;. Schneider et al, 1996;. Hörner et al, 1997;. Edwards et al., 2002). Molto lavoro resta da fare prima di poter comprendere appieno gli effetti dei neuromodulatori sulle cellule bersaglio individuali. Dato che neuromodulatori diversi possono lavorare in concerto con gli altri, l'analisi della loro azione mista è uno spazio per la ricerca futura (Djokaj et al., 2001). Inoltre, pochi studi, in particolare nei vertebrati, affrontare gli effetti dei neuromodulatori su percorsi intero che può regolare uno specifico comportamento. In questo senso-SNC-motore preparazione unità si può esaminare l'influenza sia di input sensoriali e neuromodulatori sull'attività dei motoneuroni (Kennedy et al., 1969).

Poiché è stato ipotizzato che il 5-HT gioca un ruolo nella regolazione dello stato comportamentale di gamberi, aragoste e granchi (Livingstone et al, 1980;.. Sneddon et al, 2000), diversi tentativi sono stati fatti per determinare la sua concentrazione in il VNC, l'emolinfa, e nei gangli isolati di aragoste (Livingstone et al, 1980;. Harris-Warrick e Kravitz 1984;. Fadool et al, 1988). Tuttavia, c'è stata una notevole variazione nelle misure registrato, precludendo specifiche relazioni dose-risposta, che potrebbe spiegare le azioni comportamentali.

Un gambero di fiume con gli artigli tenuto in posizione rialzata e con la coda nascosta sotto il suo addome è stato pensato di esporre una posizione dominante (Livingstone et al., 1980). Lo stato di flessione addominale in gamberi non sembra essere la postura che gambero dominante, all'interno di una coppia, mostra durante le interazioni sociali e, pur mantenendo uno status dominante gerarchico (Listerman et al., 2000). Gamberi sottomesso sarà anche infilare sotto i loro addomi se stessi come si ritirano da un avversario. Rimboccare coda tale è anche visto come una postura di difesa (Listerman et al., 2000). Questi comportamenti sono stati prontamente osservati in campo e in laboratorio (Bovbjerg, 1953, 1956; Bruski e Dunham, 1987; Li et al, 2000;.. Listerman et al, 2000). È interessante notare che le posture del comportamento osservato nel aragoste (Livingstone et al., 1980) sono invertiti per la 5-HT e iniezioni octopamina nel gambero australiano, distruttore Cherax (McRae, 1996). Forse, risposte completamente diverse sarebbe osservata nella preparazione flessore superficiale nel gambero australiano. Inoltre, poiché il dominio è generalmente dimensioni legati tra gamberi, ci si aspetterebbe un sistema di risposta molto rapido in plastica per mutate condizioni sociali (Strawn et al., 2000). La plasticità in risposta a neuromodulatori negli invertebrati è uno spazio aperto di indagine.

Wyttenbach, Johnson e Hoy (1999) hanno prodotto dei media digitali e un manuale di laboratorio per sperimentazioni che coinvolgono le varie gamberi muscolare stesso presentati in questo rapporto, oltre ad altre preparazioni di gamberi. Questa è una risorsa eccellente per le esercitazioni degli studenti.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Supportato da University of Kentucky, Dipartimento di Biologia, Ufficio di studi universitari e il College of Arts & Sciences.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld’s solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. Bouin’s fixative solution was used directly and methylene blue is made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139).
  4. Sylgard-bottomed glass dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Model 3000 AC/DC amplifier for intracellular as well as extracellular recordings can be used.
  8. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
  9. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. Intracellular electrodes were filled with 3 M KCl.
  10. A suction electrode is used to record extracellular signals.
  11. Faraday cage.
  12. High Intensity Illuminator (light source).
  13. Micromanipulator

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Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322, doi:10.3791/2322 (2011).

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