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Neuroscience

멤브레인 후보, 시냅틱 응답,의 연결 회로, Neuromodulation과 크레이를 사용하여 근육 조직학 : 학생 실험실 연습

Published: January 18, 2011 doi: 10.3791/2322
Automatic Translation
*1, *1, *2, *1
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

실험 근육 구조, 시냅스 반응, 이온 그라디언트 및 막 잠재력에 대한 투자율의 효과를 조사 경험을 얻기 위해 학생들을위한 쉬운 접근 방법을 보여줍니다. 또한, 감각 - CNS - 모터 근육 회로의 연결 회로에서 화합물의 효과를 테스트하는 방법을 보여 제공됩니다.

Abstract

이 보고서의 목적은 생물 학적 막에 걸쳐 이온 기울기에 의한 영향의 이해를 개발하는 것입니다. 이 실험에서 세포의 막 잠재력에 영향을 우리가 주소를 두 가지 측면은 다음과 같습니다 막의 외부에 K +를 (1) 이온 농도, 그리고 특정 이온에 멤브레인 (2) 투자율. 크레이 피쉬 복부 신근 근육 일부중인 토닉 (느린) 및 기타 phasic (빠른) 자신의 생화 학적 및 생리 학적 phenotypes에서뿐만 아니라 그들의 구조와 마찬가지로 그룹에, 이러한 근육 신경을 분포시키다 모터 뉴런은 기능 특성 correspondingly 다릅니다. 우리는 시냅스 전달의 속성을 증명하기 위해뿐만 아니라 표면, 토닉 복부 flexor 근육 이러한 근육을 사용합니다. 또한, 우리는 회로의 특정 측면에 cuticular 감각 자극의 효과뿐만 아니라 neuromodulators의 영향을 설명하기 위해 감각 - CNS - 모터 신경 - 근육 회로를 소개합니다. 이 운동에서 얻은 기술로, 하나는 다른 실험 준비뿐만 아니라 의학 및 건강에 관한 생리 응용 프로그램에 남아있는 많은 질문에 답변을하실 수 있습니다. 우리는 동물 관련 근본적인 문제를 해결하기 위해 모델 무척추 준비의 유용성을 증명하고있다.

Protocol

1. 소개

이러한 실험실 연습의 목표는 막 잠재력을 측정하기위한 고르기 세포막의 속성, 쉬고 멤브레인 전위의 이온 근거와 방법을 이해하는 것입니다. 또한, 근육의 얼룩과 조직학은 근육 구조를 가르치는 데 사용할 수있는, 제공됩니다. 또한, 해부 준비 서로 다른 두 가지 유형의 다양한 근육 그룹에 시냅스 전송의 속성을 설명하는 데 사용됩니다. 전체 감각 - 중추 신경계 (CNS) - 모터 신경 - 근육 회로 크레이 피쉬 복부 또한 감각 자극과 회로의 측면에 neromodulators과 신경 전달 물질의 영향을 검토하기 위해 준비를 제출하는 데 사용됩니다.

이 보고서의 첫 번째 부분은 쉬고있는 멤브레인 막 잠재력과 가능성에 대한 세포의 K +의 영향을 측정하는 데 사용되는 접근법을 제공합니다. 우리는 또한 근육 구조를 소개합니다. 이 연습의 두 번째 부분에서는, 우리는 신경근육학 분기점 (NMJs)의 여러 종류의 신경 반응을 측정하는 다양한 방법을 제시한다. 첫 번째 운동은 왕새우 복부 신근 근육을 사용하고 두 번째는 복부 표면 flexor의 근육을 사용합니다. 또한, 우리는 유지하기 쉬운 신경 회로 (감각 입력 및 모터 출력과 왕새우의 복부 신경 코드)를 제시하고, 어떤 감각 - CNS의 다양한 측면에서 교육뿐만 아니라 연구에 사용할 수 있습니다 - 모터 신경 - 근육 회로. 초기 연습의 설명을 마친 후, 우리는 NMJs 및 CNS 회로의 생리를 제시한다.

생물 학적 막에 걸쳐 이온 기울기는 전위차가 발생할 수 있습니다. 휴식 세포의 경우 세포막에 걸쳐 전기 요금이 차이는 세포의 휴식 막 잠재력으로 알려져 있습니다. 우리가 그 영향을 미치는에게 세포의 막 잠재력을 다룰 것입니다 두 가지 주요 요소가 있습니다. 첫 번째는 막의 양쪽에있는 이온 농도이다. 두 번째는 막의 이온 투과성이다. 살아있는 세포에있는 세포 내부와 외부 다양한 농도와 다른 이온의 숫자가있다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 우리가 주소가됩니다 열쇠 이온은 나트륨 아르 (나 +), 칼륨 (K +)과 염소 (망할 CIA). 근육 막에 걸쳐 이러한 이온의 수량과 운동이 막 잠재력을 결정합니다. 이 재단에서, 우리는 시냅스 반응에서 막의 전기 여기와 억제 동안 관찰 전기 잠재력을 주소와 약리 대리인의 효과를 확인할 수 있습니다. 우리는 또한 실험적인 테스트의 개념 (로빈슨 외., 2010) 이러한 프로세스를 상징하는 biophysical 모델을 구축할 수 있습니다.

유리 모세관 microelectrodes의 사용은 막 잠재력의 녹음을 수 있습니다. 전극은 끝 충분히 작은이고 transmembrane 잠재력의 정확한 측정을 얻을 수있다 제공 손상없이 세포막을 통해 삽입할 수 있습니다. 기술은 세포 내 전극의 삽입에 의해 손상될 수 적은 가능성이 큰 세포에 특히 적용됩니다. 이것은 생리에서 필수적인 기술 중 하나입니다.

나 +와 K의 균형 + 멤브레인 건너는 생리적 조건에서 나 - K ATPase 펌프에 의해 유지됩니다. 정상적인 조건에서 펌프 이동 평균 세 나 + 아웃 세포에 세포 두 케이 +의. 한편, 화학 노벨상은 1950 년대 후반에 다시 만들어진이 발견은 1997 년 수상했습니다. 발견의 기초는 게 (Skou, 1965, 1998)에서 axons를 사용하는 연구에서 얻은했다.

그것은 멤브레인가 depolarized 때 펌프 큰 능력 (Skou, 1989a, B)를 가지고 같은이 펌프는 electrogenic 간주됩니다. 많은 세포에서 펌프는 세포가 전기에 의해 탈분극 활성화될 때 속도.

세포가 휴식 상태에있는 동안 칼륨 또한 칼륨 "누출"채널을 통해 이동할 수 있습니다. 이러한 칼륨 누출 채널로 인해 휴식을 세포막 다른 이온보다 칼륨 더 투과합니다. 따라서, 세포의 휴식 막 잠재 나트륨에 대한보다 칼륨에 대한 평형의 가능성에 가까운 것입니다. 쉬고 멤브레인 가능성은 다음의 칼륨 평형 잠재력에 달려 있는지 확인하기 위해 검사하실 수 있습니다.

1) 근육​​ 변화

갑각류 근육 섬유 구조 기능, 멤브레인 전기적 특성과 척추 근육 섬유가보다 수축성 속성의 큰 다양성을 보여줍니다. 갑각류의 Phasic 근육 섬유 트위치 타입의 수축에 대한 수정입니다. 그들은 얇은 짧은 sarcomere 길이 (2-4 미크론), 직선 Z - 선, 굵은 근육 섬 유지하기 위해 얇은의 낮은 비율, 그리고 T - tubules 및 sarcoplasmic 잘 개발된 시스템으로 특징reticulum. Phasic 근육 섬유 점막은 등급 또는 전체 - 또는 - 없음 액션 잠재력을 생성할 수 있습니다. 토닉 근육 섬유는 반면에, 긴장이 장기간 유지 보수가 수정됩니다. 그들은 종종 10-15 미크론, 두께, 물결 모양 Z - 선, 굵은 근육 섬 유지하기 위해 얇은 높은 비율, 그리고 T - tubules 및 sarcoplasmic reticulum 적은 잘 개발된 시스템의 sarcomere 길이 있습니다. 토닉 근육 섬유 점막은 종종 전기 inexcitable, 또는 그들은 ( "등급 스파이크") 등급 전기적 응답을 생산 수 있습니다. 중간 섬유 종류의 다양한는 갑각류 근육에서 발견됩니다.

2) 방정식

일반적으로 이온과 휴식 막 잠재력의 평형 전위를 결정하는 데 사용되는 방정식은 각각 Nernst 방정식과 골드만 - 호지킨 - 캐츠 (GHK) 방정식입니다. GHK 방정식이 여러 이온과 그라디언트의 투자율을 고려하여 휴식 가능성을 결정하는 데 사용되는 반면, 두 방정식 사이의 중요한 차이는 Nernst 방정식 해당 이온에 대한 평형의 가능성을 결정하는 한 특정 이온에 대해서만 사용되는 것입니다 세포막 (Nernst, 1888, 1889, 골드만, 1943, 호지킨과 헉슬리 1952; 호지킨 외, 1952;. 호지킨과 캐츠, 1949는, Hille, 1992 참조).

Nernst 방정식은 일반적으로 일반적으로 그림과 같이 기전력을 생성하는 막에 걸쳐 이온에 대한 간주됩니다 :

V = (RT / ZF) 에선 ([X] / 아웃 [X])를

관심 X = 이온
멤브레인 건너 X 이온에 대한 V는 = 평형 전압
R = 기체 상수 [8.314 J / (몰 • K)]
T = 절대 온도 [켈빈]
이온의 Z는 원자 =
F = 패러데이의 일정 [9.649 × 10 4 C / 몰]

K + 이온은 20 ° C 및 상수의 작성과 10 함께 로그에 아까의 변화, 한에 도착 경우 :

잠재 = 58 로그 ([아웃 K] / [에 K]); 뮤직 비디오의 표현

우리만이 K의 +가 확산에 의해 permeant 있다고 가정하자. [의 K]는 K입니다 + [아웃 K] 셀을 클릭하고 내부에 농도는 K입니다 + 세포의 외부에 집중.

[에서 K] 운동으로 추정. ______________

이 계산에 대한 가정, 멤브레인 잠재력 K + 평형 전위에만 의존합니다.

제공된 [K 아웃] = 사용된 생리에 대해 5.4 MM입니다. 또한, 멤브레인 전위는 - 70mV를 가정합니다.

잠재 = 58 로그 (/ 5.4 [에 K]).

실험에서 우리는 세포의 휴식 막 잠재력을 측정하고 그것이 [K를] 변경 영향을 얼마나 결정됩니다. [아웃 K] 막 잠재력과 관련하여 가상 선의 기울기는 58이다. 다양한에서 쉬고 막 잠재력 [K 아웃] (5.4 MM에서 100 mm까지 범위)에 대한 데이터를 수집 후 우리는 가상의 라인과 일치하는 항목이 있는지 확인하기 위해 관찰된 값을 플롯됩니다. 우리는 [아웃 K] 5.4 밀리미터에서 얻은 평균 쉬고 막 잠재력을 사용합니다 비교에 대한 가설과 관찰 라인을 시작하십시오.

멤브레인 다양한 depolarized 상태에서뿐만 아니라, 나머지 한 개 이상의 이온을 투과 수 고려, 한 계정으로 여러 이온에 대한 투과성을 (방정식에서 P) 취할 GHK 방정식을 사용합니다. 막 하나만 이온을 투과 경우 GHK 방정식은 Nernst 방정식을 줄일 수 있습니다.

여기 나 +, K +, 그리고 Club 호텔에 대한 일반 GHK 방정식입니다 - 이온이 :

방정식

Club 호텔이 있기 때문에 - 부정적인 요금을, 농도 용어는 내부와 외부이 방정식의 반전이다. 이것은 Z (이온 요금)가 떨어져 남아있을 수 있습니다.

3)이 운동의 목표

이 실험에서 우리는 크레이 피쉬 근육 세포의 막 잠재력을 측정하고 해결하기 위해 위에 설명된 원칙을 적용합니다 :

  1. 적절한 장비와 기술을 가진 세포막 잠재력을 측정하는 방법.
  2. 이온 근육 세포막의 투과성 및 그것이 막 잠재력에 기여하고 있습니다.

    또한, 우리는 근육 구조의 예비 연구를 할 것입니다 :
  3. 이러한 electrophysiological 실험을 수행에 사용되는 크레이 피쉬 복부의 지느러미 부분에있는 근육의 해부를 강조 얼룩을 사용합니다.
  4. 다른 근육 섬유 유형의 조직학을 검사합니다.

이 실험실에서 운동을, 우리는 왕새우 복부 신근 근육을 사용합니다. 이 준비는 생리학에서 이러한 원칙을 가르쳐 과거에 사용되었습니다D 해부학 (앳우드 및 Parnas, 1968). 우리는 현재 장비를 수용하고 한 3 시간 학생 실험실 기간에 목표를 완료하는 소스 및 수정된 다른 절차의 많은를 사용했습니다. 이러한 연습은 켄터키 대학 (강사 박사 RL 쿠퍼 2010 년)에서 생물의학과에서 동물 생리학 과정에서 사용되는 다른 실험을위한 기초입니다.

4) 왜이 모델 동물

본 실험에서 왕새우 복부 신근 근육을 사용하는 몇 가지 좋은 이유가 있습니다 :

  1. 크레이 피쉬는 일반적으로 사용할 수 있으며, 실험실 조건에서 유지하기 위해 상대적으로 저렴하고 쉽습니다.
  2. 해부 살 준비를위한 해부 기술을 배우는 학생들에게 상대적으로 쉽습니다.
  3. 근육은 electrophysiological 기법을 학습하는 학생들에게 잘 제공하고 최소한의 정상적인 생리에 몇 시간 동안 안정합니다. 근육 준비는 외부 [K +] 짧은 기간에 대한 변경되었을 때 매우 강력합니다.
  4. 다양한 시냅스 응답 쉽게 모터 뉴런을 자극하여 얻을 수 있습니다.
  5. 신근 근육의 해부 학적 배열은 분별하기 쉽고, 그들의 큰 크기로 인해 그것은 안정적인 세포 녹음을 얻기 위해 상대적으로 쉽습니다.
  6. 근육과 innervation 패턴은 메틸렌 블루 염색법 쉽게 볼 수 있습니다. 또한, 특정 근육 섬유 유형은 쉽게 sarcomere 구조를 관찰하는 조직학을 위해 처리될 수 있습니다.
  7. 어떤 동물 프로토콜은 미국 내의 여러 기관에서 실험실 실험에서 무척추 동물 준비를 위해 현재 필요하지 않습니다.

2. 방법

1) 자료

  • 가위 (1)
  • 집게 (1)
  • 접지 와이어에 대한 실버 와이어 (1)
  • 현미경 (1)
  • 전극 프로브 (1)
  • 하단에 Sylgard와 페트리 접시 (1)
  • 생리 식염수 (1)
  • 칼륨 솔루션 : 5.4mM (일반 호수), 10, 20, 40, 80, 100 MM
  • 그래봤자 (소량, 자세 - CL을 구축하기 위해 실버 와이어의 팁을에 사용)
  • 유리 피펫 (1) 솔루션을 제거하고 추가하는
  • 주사기 (1)
  • 앰프 / 수집 시스템 (1)
  • 패러데이 케이지 (1)
  • 데스크탑 / 노트북 (1)
  • 해부 핀 (4)
  • 왕새우

2) 방법

2.1) 준비 / 해부 :

  1. 몸 길이 약 60~10센티미터 왕새우 (또는 관리 사이즈) 취득해야합니다. 머리의 뒤쪽에있는 왕새우이나 눈 뒤쪽에서 약 cm 잡아. 크레이 피쉬 또는 구강의 발톱이 왕새우를 취급하는 개인에 도달할 수 있는지 확인하십시오. (크레이 피쉬는 머리를 잘라하기 전에 그것을 마취 5 분 얼음 조각에 게재될 수 있습니다.)
  2. 빠르게 머리를 제거하는 큰 가위를 사용합니다. 왕새우 눈 뒤에서 깨끗하고 빠른 절단하십시오. 머리와 부속의 배출.
    그림 1
    그림 1. 이미지는 왕새우의 머리를 제거하기 위해 상처의 위치를 보여줍니다.
  3. 왕새우 다리와 발톱은 부상을 피하기 위해이 시점에서 제거할 수 있습니다. 남성과 여성 모두에서 남성과 swimmerets에 Stylets 또한 (그림 2) 제거할 수 있습니다. 다음, 흉부에서 복부를 구분한다. 복부와 흉부 (그림 3)을 합류 articulating 막 따라 절개를합니다. 왕새우 복부 부분을 저장하고 흉부 처분.
    그림 2
    그림 2. 가위는 stylets을 절단하고 있습니다. 이들은 왕새우에서 제거할 수 있습니다.
    그림 3
    그림 3. 이미지는 복부의 근육을 제거하기 위해 상처의 위치를 보여줍니다.
    그림 4
    복부에서 흉부의 그림 4. 제거. 컷은 세그먼트의 가입에 라인을 따라 원형 방식으로하여야한다.
    그림 5
    그림 5. 상단 이미지는 swimmeret의 부속으로 복부를 보여줍니다. 아래 이미지는 swimmeret의 부속하지 않고 복부를 보여줍니다.
  4. 복부와 상처는 복부의 각 측면의 하단, 측면 경계 쉘에하여야한다. 케어는 왕새우에 너무 깊이 잘라하지 않도록해야합니다. 껍질을 가공하는 과정에 도움, 상처가 복부 쪽을 향해 및 각도로 아래 slighting 가리키는 가위로하여야한다. 각 세그먼트의 길이 (그림 6)를 실행 왕새우 라인의 자연 쉘 패턴을 따릅니다.
    그림 6
    그림 6. 가위는 각도로 배치하고 껍질의 자연 정렬 수행하고 있습니다. 너무 깊이 잘라 준비를 파괴하지 마십시오. 화살표는 인하를 위해 따라야한다 각 세그먼트를 따라 자연 선을 가리킨 머리.
  5. 껍질의 복부 부분을 제거합니다. 복부 근육을 파괴하지 않도록 조심 해요. 복부 부분을 제거하는 집게를 사용하십시오. 껍질의 복부 부분이 제거되면, 조직의 하얀 덩어리가 깊은 flexor 근육 위에 볼 수 있습니다. 이 조직은 집게와 함께 신중하게 제거할 수 있습니다.
    그림 7
    그림 7. 집게로 껍질의 복부 부분을 제거. 올려 및 제거하는 복부 부분에 다시. 복부 쉘 아래의 근육을 파괴하지 마십시오.
    그림 8
    그림 8. 폐기되어야하는 쉘의 복부 부분에 다시 이겠지.
    그림 9
    그림 9. 가위로 준비의 복부 부분을 잘라 버리고.
  6. GI 트랙트, 깊은 flexor 근육의 정중선을 따라 실행하는 작은 튜브는, 왕새우에서 제거할 수 있습니다. 포셉와 넓이의 상단을 공략하고 복부 멀리 당기십시오. 넓이의 맨 아래를 잘라 - 꼬리의 끝에. 배설물로 폐기물이 준비에 방해가되지 않도록하기 위해 호수와 절개를 씻어.
    그림 10
    그림 10. 이미지 준비에서 GI 트랙트의 제거를 보여줍니다.
  7. 페트리 접시에 준비를 안전하게 해부 핀을 사용합니다. 준비의 위쪽과 아래쪽 모서리는 접시로 옮기고해야합니다. 생리 식염수는 페트리 접시에 부어 및 세포내 녹음을 수행할 때까지 완전히 준비를 커버한다.
    이 해부 접시는 곤충 핀이 그것에 붙어있을 수 있도록 바닥에 Sylgard (다우 코닝) 코팅 (두께 1cm)을 가지고해야합니다.
    해부 준비는 표준 크레이 피쉬 호수에서 목욕을 205 NaCl로 만든 반 Harreveld의 솔루션 (1936)에서 수정, 5.3KCl, 13.5 CaCl 2; 2 시간 2 O, 2.45 MgCl 2; 6H 2 O, 5 HEPES 및 pH의 조정 7.4 (MM)입니다.

2.2) 세포 녹음

그림 11
그림 11. 레코딩 장비의 전체 설정.

  1. 준비 페트리 접시는 현미경으로 위치와 움직임을 방지하기 위해 요리의 하단에있는 왁스와 함께 안전하게해야합니다.
    그림 12
    그림 12. 현미경 준비 배치. 페트리 접시와 준비를 보호하기 위해 왁스를 사용합니다.
  2. 각 엔드에 연결된 실버 와이어의 짧은 길이 두 개의 전선을 취득해야합니다. 실버 와이어는 자세 - CL 코팅을 얻기 위해 약 20 분 표백제 소량을 과감하게해야합니다. 사용하기 전에 물을 와이어를 씻으십시오. 유리 세포 피펫은 3M KCl 용액으로 가득 주사기에 연결된 긴 바늘로 취득하고 신중하게 backfilled해야합니다. 피펫은 거절 (바닥에 직면하고있는 개방)와 솔루션으로 가득해야합니다. 이것은 초과 KCl은 전극의 뒷면을 드립 것을 보장합니다. 더 KCl이 호수 목욕을 입력합니다 유리 피펫 따라 실행되지해야합니다. 염화칼륨 솔루션 작성 완료되면 똑바로 피펫을 켜십시오. 실버 와이어는 다음 피펫으로 삽입할 수 있습니다. 다른 쪽 끝을는 앰프 헤드 무대 + (긍정적) 극에 연결되어 있습니다. 피펫은 다음 전극 프로브를 확보합니다. 치료는 전극 팁을 깰하지하여야한다. 패러데이 케이지에 부착된 세 번째 와이어가 머리 단계의 녹색 기둥에 배치해야합니다. 아래 그림 (음수) 극 - 마지막으로 남아있는 연결의 자세 와이어는 욕조에 연결된 다른 쪽 끝을에 배치해야합니다. 와이어도 AD 컨버터 Powerlab의 지상 부분에 패러데이 케이지에서 배치해야합니다. 머리 단계는 취득 / 앰프 (Powerlab)에있는 '입력 탐사'로 연결되어 있습니다.
    그림 13
    그림 13. 헤드 단계 구성. 머리 단계의 녹색 입력에 연결된 전선은 앰프 또는 패러데이 케이지에 근거합니다. 붉은 입력에 연결된 전선은 전극 와이어에 연결되어 있습니다. 검은 입력은 목욕 솔루션에 연결하는 데 사용됩니다.
    그림 14
    그림 14. "토글 테스트"는 전극 resistance.The "거친"노브도 발견 테스트하기 위해 아래 행에DC 오프셋 아래에있는이 현명한 카운터 클럭을 설정할 수 있습니다. 이득은 50 요소에 의해 신호를 증폭 50으로 설정됩니다. 머리 단계에서 접지 와이어는 "GND"핀 잭 오프닝에 배치됩니다.
  3. LabChart 소프트웨어는 데스크탑이나 노트북에서 개설하여야한다. "설정"후 클릭하여 하나의 채널을 표시하는 차트를 조정 "채널 설정을." 채널에서 "채널 설정"변경 번호 하나. "확인"을 클릭하십시오. 차트, 왼쪽 코너의 상단에, 초당 사이클 2K해야합니다. 200mV 500mV로 주변에 볼트 (Y 축)을 설정합니다. 화면의 오른쪽 부분에 "채널 1"을 클릭하십시오. "입력 앰프"를 클릭하십시오. 차동 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다.

    앰프 출력 채널 하나에 있어야합니다. 다음 설정은 앰프와 함께 사용해야합니다 :
    • 하이 패스 - DC
    • 노치 필터 - OFF
    • 패스 - 20kHz 낮음
    • 용량 컴프 .- 반시계
    • DC 오프셋 노프 - 시계 반대 파인 물론
    • DC 오프셋 (+ OFF -) - OFF
    • 게인 노브 - 50
    • 입력 (모노 비교 GND) - 비교
    • 모드 (STIM - GATE - REC) - REC
    • ΩTEST - OFF
  4. 전극 저항의 측정으로, 전압은 2.0 NA (예, R = V / I, 또는 옴의 법칙)하는, 현재 나눈해야합니다. 결과 값은 유리 전극의 저항이다. 저항은 20-60 MegaOhms해야합니다. 낮은 (<20) 높은 저항 (> 100) 사용할 수 없습니다. 저항이 결정되면, 세포 녹음 시작할 수 있습니다. 식염 온천에 유리 전극의 끝부분을 놓으십시오. 접지 와이어의 호수 온천도 있는지 확인하십시오.
    녹음을 시작하려면 화면 하단의 시작을 누르십시오. 게인은 5 V / 사업부로 설정되어 있는지 확인하십시오. 전극을 삽입하기 전에 0으로 LabChart에 라인을 이동 앰프에 코스 노브를 사용합니다. 전환 손잡이는 전극의 저항을 테스트하기 위해 여러 차례에 다음을 해제해야합니다. 다음 결과 값의 진폭을 측정해야합니다. 꾸준한베이스 라인 하나 마커를 삽입하고 전극 저항을 얻기 위해 정상에서 두 번째를 놓습니다.
  5. 준비 세로 근육 (DEM 또는 DEL1 또는 DEL2) (그림 16 참조)에 전극을 삽입하는 전극 프로브와 현미경을 사용합니다. 전극은 거의 근육에 삽입해야합니다. 근육으로 침투하지 마십시오. 세로 근육을 찾아하고 근육에 전극을 삽입하기 위해 현미경과 프로브 설정을 사용합니다. 높은 강도 조명기는 전극이 삽입되고 있기 때문입니다 명확하게 근육을 볼 수 조정해야합니다. 이 준비 근육 섬유를 파고하면 하나는 일반적으로 근육 내에 공간과 clefts으로 실행할 수 있습니다. 이것은 막 잠재력이 나타납니다, 그때 사라진 후 나타나는 수있는 이유입니다.
    그림 15
    그림 15. 근육에 전극을 삽입.
  6. 막 잠재력을 측정하려면, 전극을 삽입하기 전에 0으로 LabChart에 라인을 이동 앰프에 거친 노브를 사용합니다. 근육 섬유를 포크. 다음, 결과 값의 진폭을 측정합니다. 꾸준한베이스 라인에 마커를 삽입하고 값을 기록합니다.
    마커 및 활성 커서 차이가 화면의 오른쪽에 표시됩니다. 값은 전압을 사용하실 수 있습니다. 기록된 전압은 앰프에 사용된 증폭의 양을 (예 : 10X 또는 100x 증폭)로 나누어해야 할 수도 있습니다. 값이 볼트로 소프트웨어에보고하는 경우 전압은 millivolts (1 V = 1000 MV)로 볼트에서 변환해야합니다.
  7. 조심스럽게 근육에서 전극을 제거하기 위해 현미경과 manipulators을 사용합니다. 다른 근육 섬유를 포크하고 휴식 막 잠재력을 확인합니다. 하나는 여러 레코딩을하고 조치뿐만 아니라 관심의 근육 섬유로 세포 전극을 연출 편안해야합니다.
    전극은 아마 모든 다른 변경 [K +] 아웃 솔루션의 변화 동안 한 근육 섬유에 머물하지 않습니다. 전극을 철회하는 것이 최선이며, 다음 솔루션을 변경 후 근육 손상을 방지하기 위해 다시 침투. 별도의 근육 섬유에서 솔루션 당 3 신호를 얻고있는 가짜 판독을 피하기 위해 평균을 사용하는 것이 좋습니다.
  8. 페트리 접시에서 생리 식염수를 제거하고 폐기하는 주사기를 사용합니다. 페트리 접시가 완전히 준비를 덮고 칼륨 염화물 살린 솔루션의 다음 높은 농도, 가득해야합니다. 동일한 프로세스는 각 칼륨 솔루션을 반복해야하고 전압 / 잠재의 변화가 주목하고 기록하여야한다. 의 시리즈 [K는 +] 우리가 사용하는 왕새우 살린 솔루션 부재 : 5.4, 20, 40, 60, 80, 100 MM.

2.3) 해부학

생리가 완료 이제, 우리는 관련 검사 수근육 섬유 innervation 패턴의 해부학. 얼룩 요리로 준비를 전송하고 메틸렌 블루 (왕새우 호수의 100 ML와 혼합 메틸렌 블루의 1g)을 추가합니다. 생리 5 분 동안 준비를 목욕 후 제거하고 얼룩없이 신선한 왕새우의 생리를 추가하자. 이러한 근육의 해부는 (; 순례자와 Wiersma 1963 헉슬리, 1880) 년 이상 자세히 설명되었습니다. 최근 근육의 일부는 (쿠퍼는 외, 1998.; 그리피스 외, 2000;. 손 외는 2000.)는 생리학과 화학적, 해부학적인 몸의 구조도 설명했습니다.

근육의 일반적인 해부학의 레이아웃은 그림 16 (이 목적을 위해 그림의 오른쪽)에 그려져 있습니다. 주로 세그먼트 내에서 근육 innervates 주요 신경을 찾습니다. SEM, DEL2, DEL1 및 세그먼트에서 DEM 근육에 innervation 패턴을 스케치. 복부 완전히 단단히 접시에 준비를 달아 의해 뻗어 있어야합니다. 다음 생리를 제거하고 고정력있는 솔루션을 추가합니다. 해결책은 부왕의 솔루션 (; 시그마 - 알드리치 (주) 포화 picric 산, 포름 알데히드와 초산 사용한)입니다.

주의. 피부 또는 눈이 솔루션을 얻을하지 마십시오. 펌 후드 아래에 협력하여 솔루션의 증기를 피하십시오. 눈을 눈 세척 역 즉시 눈을 씻어 굽기 시작하면.

부왕의 솔루션은 10 분 정도 준비에 남아 다음 피펫과 생리 교환 솔루션을 이용하자. DEL1 또는 DEL2 근육 밖의 얇은 조각을 잘라 유리 슬라이드에 놓습니다. 슬라이드를 라벨. SEM 근육에 대해 절차를 반복합니다. 두 조직의 준비에 sarcomere banding 패턴을 볼 수 있습니다. 당신은 banding 패턴을 볼 수있는 복합 현미경을 사용하고 그에 따라 목표를 조정할 수 있습니다. 가능성은 현미경의 시선을 작품을 통해 디지털 사진을 경우 (참고 : 일부 휴대 전화 카메라가이 절차에 대해 잘 작동).

그림 16
그림 16. 각 세그먼트의 신근 근육을 보여주는 크레이 피쉬 복부의 지느러미 부분의 복부보기에서 도식 그림. 지느러미 막 복부 근육 (DMA)와 표면 신근 액세서리 근육 머리 (SEAcc) 각 세그먼트에 대해 다른 방향으로 복부 5 통하여 세그먼트 1 발생합니다. 세그먼트 1의 예외로,이 근육은 calcified tergite 자신의 앞쪽에 끝에와 관절 막의 사후 끝에 자신의 첨부 파일 사이트를합니다. 세그먼트 1, 동종 근육은 흉부와 복부 사이에있는 관절 막 자신의 앞쪽에 부착 사이트를합니다. 그림은 메틸렌 블루 스테인드 준비 사진 montages에 기초했다. 그림의 왼쪽에있는 모든 깊은 신근 근육은 등의 표면 신근 근육을 보여주 제거되었습니다. 규모 = 2.35 mm. (손 외. 2000에서 촬영).

3. 검색 결과

다음 질문 및 데이터 처리는이 실험 절차에 대한 기본 원칙과 목표를 설명합니다.

  1. [+ K] 아웃 사용된 각 쉬고 막 잠재력에 대해 얻은 조치를 플롯. 준수하고 가상 선이 자신의 경사에 일치하는 경우를 참조하십시오. 줄거리하려면 값을의 X - 축과 세미 로그 플롯을 사용하여 다양한 [K +] 아웃 로그인과 막 잠재력 (아래와 같이, 그림 17)의 Y 축으로. (필요한 경우 무료 그래프 용지를 다운로드 http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/를 )
    그림 17
    그림 17. 그래프 용지
    5.4 MM에서 얻은 평균 쉬고 막 잠재력을 사용하여 [K +] 비교에 대한 가설과 관찰 라인을 시작을 위해.
    라인이있을 이유를 토론과 일치하지 않는 경우.
  2. 당신이 나 + 이온의 외부 수준을 변경하는 경우, 당신은 K 변경을위한 관찰 변경의 같은 종류 + 농도를 기대까요?
  3. 신경에 비해 얼마나 잘 메틸렌 블루는 근육 얼룩나요? 왜 차이가있을 수 있습니다? 라이브 인간의 세포에서 조직 또는 대비의 식별을 위해 오늘날 사용되는 메틸렌 블루인가요? 지그문트 프로이트와 왕새우에 사용되는 얼룩과가 어떤 관계입니까?
  4. 델 및 SEM 근육 사이 sarcomere 패턴에 차이가 있습니다. 그렇다면 이유는 무엇 수도? 모든 근육이 동일한 쉬고 sarcomere 거리가 있습니까? 당신은 가능한 한 그림 (알려진 sarcomere 근육 해부학과 관련하여)의만큼 현미경과 레이블이 관찰 근육 banding 패턴을 그립니다.

4. 시냅틱 다시 측정sponses

1) 소개

쉬고 막 잠재력을 증명하는 데 사용 복부 신근 근육 준비도 다양한 근육에서 NMJs에서 시냅스 반응의 유도를 보여주는 이상적입니다. 어떤 하나의 섬유가 같은 다리를 걸어 왕새우의 신근 근육 (앳우드, 2008 등 모두 phasic와 토닉 흥분성의 모​​터 뉴런에 의해 innervated 수 있지만 갑각류의 일부 근육은 선택, phasic 또는 강장제 모터 신경에 의해 innervated되며 조브 참조 생산 ID # 2319 - 우와 쿠퍼, 2010) 및 대부분의 다른 사지 근육 (Wiersma, 1961a). 선택 phasic와 토닉 운동 뉴런을 자극함으로써, EPSPs의 생리적 차이가 측정할 수 있습니다. Phasic 모터 뉴런은 근육 섬유의 빠른 꿈틀를 생산하고 10-40 MV의 순서에 EPSPs을 보여주고 있습니다. phasic 응답 자극 5 - 10 - Hz에서 기차로 빠르게 우울하게하실 수 있습니다. 토닉 모터 뉴런은 자극의 높은 주파수 (Hz에서 10-50)의 존재에 용이 될 수있는 작은 EPSPs을 일으키다. 구조적으로, NMJs에서 presynaptic phasic와 토닉 터미널은 다른 (앳우드와 쿠퍼, 1996; Bradacs 외, 1997;.. 쿠퍼 외, 1998).

(.; 머시와 앳우드, 1989 쿠퍼 외, 1998) 놀랍게도 phasic 생리적 반응의 표현형 7 일 동안 매일 몇 시간 동안 전기 시설 phasic 뉴런에 의해 강장제와 같은 상태로 변화를 받아야 수 있습니다. 또한 변형 NMJs의 neuromodulation에 감도는 수용체 표현의 규정 (그리피스 외., 2000)을 조사하는 소수입니다.

이 상대적으로 강력한 준비 (왕새우 복부 근육)에서 모두 토닉 및 phasic 응답 쉽게 기록하고 촉진 및 / 또는 다양한 자극의 패러다임과 시냅스 반응의 우울증에 대한 검사. 이러한 준비를 통해, 학생들은 신경 다발을 자극하여 phasic와 토닉 시냅스 응답 generalities를 인식할 수있게 될 것입니다.

표시 추가 NMJ 준비는 CNS에서 내장 모터 활동과 감각 자극 유도 모터의 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 이것은 크레이 피쉬 복부의 복부 측면에 외면 flexor 근육이다. 이 준비는 감각 - CNS - 모터 근육 회로를 모니터하는 데 사용하고 neuromodulators (스트론 외., 2000)의 효과. 것입니다

복부 세그먼트 (마지막 제외)의 각 근육의 세 그룹 기능이 있습니다 : (1) 이러한 통제 pleopod (swimmerets) 운동, (2) 3 신근 근육 (3) 3 flexor의 근육. 이 박혀과 extensors는 intersegmental 경첩에 대한 회전을 유발하여 복부 굴곡 또는 확장 중 하나에 대해 가지고 근육의 대립 그룹입니다. 토닉 근육이 지느러미 (extensors)와 각 복부 세그먼트의 복부 (박혀) 측면을 포괄하는 섬유의 얇은 시트를 구성하는 동안 phasic 근육은 대부분의 복부의 볼륨을 가득 메우고 있습니다.

크레이 피쉬에서 왕새우 토닉 복부 flexor 근육 다섯 motoneurons로와 주변​​ 신경 세포 억제하여 각 반 세그먼트에 innervated 있습니다. 흥분성의 motoneurons은 신경 전달 물질로 글루 탐 산염을 사용합니다. 조미료는 주로 나트륨 이온으로 투자율의 증가를 유발하여 근육 섬유를 depolarizes. 억제 뉴런은 보통 염화물 이온으로 투자율의 증가를 유발하여 근육 섬유를 hyperpolarizes 감마 - 아미노 버터의 산성 (GABA)를 놓습니다. 일부 갑각류 근육 (주로 사지에)에서 말초 억제 뉴런은 모터 신경 세포의 터미널과뿐만 아니라 근육 섬유와 시냅스 접촉을하고, 모터 뉴런 (presynaptic 억제) (Dudel 및 Kuffler, 1961 년 발표 송신기의 양을 줄일 수 ). 이러한 현상은 왕새우 토닉 flexor 근육에 존재하지 않습니다.

왕새우 복부 신경 코드는 동물의 길이를 실행하는 양자 대칭 구조입니다. 신체 세그먼트 당 하나의 신경절이있다. 복부 (6 세그먼트)에서 각 신경절은 수백 뉴런, 두 connectives 각각 몇 천 axons 구성되어 포함되어 있습니다. 신경 세포 기관은 각 신경절의 복부 표면에 두꺼운 레이어 여러 세포 기관을 형성합니다. 즉시 세포 본문 층 이상의 연결 프로세스의 벌금 meshwork, neuropile입니다. 모든 시냅스 상호 작용 여기서 발생, 세포 기관은 시냅스의 찾아볼 수 있습니다.

각 복부 신경절은 (마지막 제외) 양쪽에 세 뿌리를했다. 두 번째 루트는 phasic와 토닉 신근 근육과 감각 axons을 innervating axons을 포함,, 첫 번째 루트는 pleopod 근육과 감각 axons을 innervating 뉴런의 axons를 포함하고 신경절에 꼬리 신경 코드 몇 밀리미터 나뭇잎 세 번째 뿌리, axons innerv를 포함phasic와 토닉 flexor의 근육을 ating. 세 번째 루트의 두 가지가 있습니다. 딥 브랜치 (IIIa)은 오직 phasic flexor의 근육을 innervates. 각 하프 세그먼트에서 세 번째로 루트 (IIIb)의 표면 지점 토닉 flexor의 근육을 신경을 분포시키다 여섯 axons을 포함하고 있습니다.

토닉 flexor를 innervating 뉴런은 저절로 활성화되어, phasic efferent 뉴런과는 달리, 그리고 좋은 준비, 그들은 복부 후 여러 시간 동안 화재가 계속되는 동물에서 제거되었습니다. 이러한 복부 준비에 만들어진 발견의 역사 자연의 검토를 위해 앳우드 (2008)를 참조하십시오. 사의 모터 뉴런의 및 반 구간에서 토닉 flexor 근육을 innervating 주변 억제 신경 세포의 세포 기관은 해당 세그먼트의 신경절에 위치하고 있습니다. 남아있는 모터 신경 세포의 세포 본문은 다음 꼬리 신경절에 위치하고 있습니다. 이 뉴런들은 안정적으로 extracelluarly 기록 스파이크 amplitudes에 근거하여 서로 구분할 수 있습니다. 1.5 세그먼트에서 토닉 flexor 근육이 근육을 innervating 뉴런을 포함하는 두 신경 함께 제거하면, 다섯 뉴런은 일반적으로 자발적인 활동을 어느 정도 보여줍니다. 이들 뉴런은 오름차순으로, 상대 세포 스파이크 진폭을 바탕으로 번호가 있습니다. F4로 F1 motoneurons과 F5, 최대의 자발적 적극적인 신경 세포는 주변 flexor 억제제집니다. F6, 최대의 모터 신경 세포가 거의 저절로 운영되지 않습니다 흥분성의 모​​터 신경 세포이다.

토닉 모터 신경 세포 활동의 자연 자연은 화합물의 외인성 응용 프로그램이나 운동 신경 활동에 대한 모니터링되고있는 동일한 세그먼트 내의 표피에 감각 자극을 제공함으로써 변조된 수 있습니다.

2) 해부

복부 신근 준비에게 세포외 칼륨과 관련하여 쉬고 막 잠재력을 검사에 대해 위에서 설명한 것과 같은 절차를 얻을 수 있습니다. 차이점은 등딱지의 측면을 따라 실행 segmental 신경 번들 처리하는 것입니다. 이 신경은 자극 전극 역할을하는 흡입 전극에 뽑아 것입니다. phasic 반응을 모니터링 1 Hz에서에서 자극. 토닉의 반응을 모니터링하면서 10-20 자극을위한 펄스 10Hz의 짧은 파열과 자극.

크레이 토닉의 flexor 근육에 대한 실험을 배려에 대한 실험 절차는 복부 신경 코드는 그대로두고 다른 한 필요가 있습니다. 여러 복부 세그먼트 구성된 준비가 이루어집니다. 이것은 다음과 같이 얻어진다 :

  1. 몸 길이 약 60~10센티미터 왕새우 (또는 관리 사이즈) 취득해야합니다. 머리 뒤쪽이나 눈 뒤쪽에서 약 2 ~ 3cm에서 개최하여 왕새우를 구합니다. 크레이 피쉬를 다룰 때 왕새우 또는 입안의 발톱은 실험자에 도달할 수 있는지 확인하십시오. 그들을 제거 후 머리와 부속의 배출.
  2. 빠르게 머리를 제거하기 위해 가위를 사용합니다. 왕새우 눈 뒤에서 깨끗하고 빠른 절단하십시오.
    그림 18
    그림 18. 이미지는 왕새우의 머리를 제거하기 위해 상처의 위치를 보여줍니다.
    왕새우 다리와 발톱은 부상을 피하기 위해이 시점에서 제거할 수 있습니다. 남성과 여성 모두에서 남성과 swimmerets에 Stylets도 (그림 19, 20) 제거할 수 있습니다. 다음, 흉부에서 복부를 구분한다. 복부와 흉부 (그림 20) 합류 articulating 막 따라 절개를합니다.
  3. 왕새우 복부 부분을 저장하고 흉부 처분.
    그림 19
    19 그림. 이미지가 왕새우에서 제거할 수 있습니다 stylets의 위치를 보여줍니다.
    그림 20
    20 그림. 이미지가 복부에서 흉부를 제거하기 위해 상처의 위치를 보여줍니다.
    그림 21
    복부에서 흉부의 그림 21. 제거. 컷은 세그먼트의 가입의 라인을 따라 원형 방식으로하여야한다.
    그림 22
    그림 22. 상단 이미지는 부속과 함께 복부를 보여줍니다. 아래 이미지는 복부 부속의 제거를 보여줍니다.
  4. 큰 페트리 접시에 생리 식염수에 고립 꼬리 준비를 놓습니다. 접시에 준비의 꼬리와 상단 부분을 아래로 핀. 준비가 안전한지 확인하십시오. 갈비뼈 사이의 준비 복부 쪽의 사각형 부분을 제거하는 메스를 사용합니다.
    그림 23
    그림 23.컷이 준비의 복부 물약을 제거하여야한다 보여줍니다.
  5. 작은 상처는 (또한 가위로 할 수 있음)하여야한다. 플랩은 절단 및 위를 해제해야합니다. 플랩은 다음 깊은 flexor의 근육을 노출, 가위로 제거할 수 있습니다. 현미경은 준비의 복부 부분을 제거에 정밀도를 높이기 위해이 과정에서 사용해야합니다.
    그림 24
    그림 24. 근육을 노출 가위로 준비를 커팅.
    그림 25
    그림 25. 톱 이미지 포셉와 플랩의 욕심을 보여줍니다. 아래 이미지는 현미경을 사용하여 준비에서 플랩의 제거를 보여줍니다.
    그림 26
    그림 26. 외면 flexor 근육의 노출.

3) 세포 녹음 :

그림 27
그림 27. 레코딩 장비의 전체 설정.

  1. 준비 페트리 접시는 현미경으로 위치와 움직임을 방지하기 위해 요리의 하단에있는 왁스와 함께 안전하게해야합니다.
    그림 28
    그림 28. 현미경 준비의 위치를 표시합니다. 페트리 접시와 준비를 보호하기 위해 왁스를 사용합니다.
  2. 한쪽에 연결된 실버 와이어의 짧은 길이를 가진 두 개의 전선을 취득해야합니다. 실버 와이어는 자세 - CL 코팅을 얻기 위해 약 20 분 표백제 소량을 과감하게해야합니다. 사용하기 전에 물을 와이어를 씻으십시오. 유리 세포 피펫은 KCl (3 M) 솔루션을 취득하고 신중하게 기입해야합니다. 피펫은 거절 (바닥에 직면하고있는 개방)와 솔루션으로 가득해야합니다. 후자는 초과 KCl은 전극의 뒷면을 드립 것을 보장합니다. 더 KCl이 호수 목욕탕에 들어갈 것입니다 유리 피펫 따라 실행되지해야합니다. 염화칼륨 솔루션 작성 완료되면 똑바로 피펫을 켜십시오. 실버 와이어는 다음 피펫으로 삽입할 수 있습니다. 다른 쪽 끝을은 머리 무대 + (긍정적) 극에 연결되어 있습니다. 피펫은 다음 전극 프로브를 확보합니다. 치료는 전극 피펫을 깰하지하여야한다. 패러데이 케이지에 부착된 세 번째 와이어가 머리 단계의 녹색 기둥에 배치해야합니다. 아래 그림 (음수) 극 - 마지막으로 남아있는 연결의 자세 와이어는 욕조에 연결된 다른 쪽 끝을에 배치해야합니다. 와이어도 AD 컨버터 Powerlab의 지상 부분에 패러데이 케이지에서 배치해야합니다. 머리 단계는 취득 / 앰프 (Powerlab)에있는 '입력 프로브 "로 연결되어 있습니다.
    그림 29
    그림 29. 헤드 단계 구성. 머리 단계의 녹색 부분에 연결된 전선은 앰프 또는 패러데이 케이지에 근거합니다. 빨간색 부분에 연결된 전선은 전극 와이어에 연결되어 있습니다. 검은 부분은 목욕 솔루션에 연결하는 데 사용됩니다.
    그림 30
    그림 30. "토글 테스트"는 전극의 저항을 테스트하기 위해 아래 행에 있습니다. "거친"노브는 현명한 카운터 클럭을 설정할 수 있어야 DC 오프셋 아래에서 발견된다. 이득은 50 요소에 의해 신호를 증폭 50으로 설정됩니다. 머리 단계에서 접지 와이어는 "GND"핀 잭 오프닝에 배치됩니다.
  3. LabChart 소프트웨어는 데스크탑이나 노트북에서 개설하여야한다. 다음을 클릭하십시오 "설치"로 하나의 채널 표시하는 차트를 조정 "채널 설정을." 채널에서 "채널 설정"변경 번호 하나. "확인"을 클릭하십시오. 차트, 왼쪽 코너의 상단에, 초당 사이클 2K해야합니다. 200mV 500mV로 주변에 볼트 (Y 축)을 설정합니다. 화면의 오른쪽 부분에 "채널 1"을 클릭하십시오. "입력 앰프"를 클릭하십시오. 차동 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다.

    앰프 출력 채널 하나에 있어야합니다. 다음 설정은 앰프와 함께 사용해야합니다 :
    • 하이 패스 - DC
    • 노치 필터 - OFF
    • 패스 - 20kHz 낮음
    • 용량 컴프 .- 반시계
    • DC 오프셋 노프 - 시계 반대 파인 물론
    • DC 오프셋 (+ OFF -) - OFF
    • 게인 노브 - 50
    • 입력 (모노 비교 GND) - 비교
    • 모드 (STIM - GATE - REC) - REC
    • ΩTEST - OFF
  4. 전극의 저항을 측정하기 위해 전압은 2.0 나되는 전류로 나눈해야합니다. 결과 값은 유리 전극의 저항이다. 저항은 20-60 MegaOhms해야합니다. 저항이 결정되면, 세포 녹음 시작할 수 있습니다. 식염 온천에 유리 전극의 팁을 플레이스. 접지 와이어의 호수 온천도 있는지 확인하십시오.
    녹음을 시작하려면 화면 하단의 "시작"을 누르십시오. 게인은 5 V / 사업부로 설정되어 있는지 확인하십시오. 전극을 삽입하기 전에 0으로 LabChart에 라인을 이동 앰프에 코스 노브를 사용합니다. 전환 손잡이는 전극의 저항을 테스트하기 위해 여러 차례에 다음을 해제해야합니다. 다음 결과 값의 진폭을 측정해야합니다. 한 제조 업체에게 꾸준한베이스 라인을 놓고 다음 전극 저항을 얻기 위해 정상에서 두 번째를 놓습니다.
  5. 근육에 전극을 삽입하는 전극 프로브와 현미경을 사용합니다. 근육으로 침투하지 마십시오. 근육 섬유의 얇은 레이어를 발견하고 섬유에 전극을 삽입하기 위해 현미경과 프로브 설정을 사용합니다. 근육을 관통하면 높은 강도의 조명기는 광원으로 사용할 수 있습니다.
    그림 31
    그림 31. 근육에 전극을 삽입.
  6. 케어는 표면 근육에 신경 뿌리를 손상을 방지하기 위해 이동해야합니다.
    그것은 호수 목욕 준비 시원한 (섭씨 10-15도) 및 실험 절차를 수행하는 동안 산소 잘 유지하는 것이 좋습니다. 냉각 장치가 사용할 수없는 신선한으로 호수를 교체하는 경우, 정기적으로 살린 냉각. 산소 가스, 또는 적어도 공기, 호수로 부풀어 오른해야합니다.
  7. EPSPs의 자발적인 활동을 기록합니다. EPSPs의 서로 다른 크기를 참고 IPSPs이 존재하는 경우.
  8. 매우 신중하게 작은 페인트 숲을 수작업으로 한 자발적인 활동을 감시하는 것과 동일한 세그먼트 내의 표피 가장자리 자극. 응답 주파수의 변화를 참고하고 다른 크기 EPSPs 전에 표피를 자극 거기에 없다는 사실을 표시하십시오.
    그림 32
    그림 32. 칫솔과 신경 뿌리를 자극과 함께 준비. (스트론 외., 2000 수정)
  9. 자극은 신중하게 같은 CO 2와 함께 부풀어 오른 세로토닌 (1 microM) 또는 호수로 neuromodulator를 포함 하나와 호수 목욕을 교환 후 반복 수 있습니다. 주어진 자극에 대한 활동의​​ 프로필에 미치는 영향을 확인합니다. 초기 상태로 활동을 살린 신선한 반환에 생리를 다시 교환하는 경우도 있습니다.
  10. 다음 하나는 여러 가지 방법으로 감각 - CNS - 모터 신경 회로 내의 신경 활동을 모니터링할 수 있습니다. 우리는 모니터 모터 신경 세포 활동 대신 세포내 전극 (그림 33)의 흡입 전극을 사용할 수 있습니다. 유리 흡입 전극의 끝에, 플라스틱 튜브가 끝에 신경을 당길 올바른 크기의 오프닝을 가지고있는 위치입니다. 신경이 전극의 압력에 의해 손상될 것입니다 때문에, 너무 작거나, 개통은 신경가 가을처럼, 너무 큰해서는 안됩니다. 플라스틱 관은 불꽃이 차를 길가에 필요한 크기로 손질합니다.
    그림 33
    그림 33. 흡입 전극 녹음 배열로 설정합니다.
    흡입 전극이 호수 목욕탕에 쉽게 접근할 수있는 위치에 micromanipulator를 놓습니다. 흡입관은 그것은 흡입 전극 내부의 은색 철사와 접촉에 생리 때까지. 전극의 끝부분에 가까운 흡입 전극의 컷 - 측면에 다른 전선을 마련, 두 전선이 호수 목욕탕 접촉을 받게 될 것입니다.
    전기 모니터링에 대해서는 것은 파워 랩 26T로 AC / DC 차동 증폭기 (앰프)를 연결합니다. PowerLab 26T에 입력 1에서 앰프의 출력에 적절한 코드를 연결하여이 작업을 수행합니다.
    • 증폭기 악기 컨트롤은 다음과 같은 설정을 설정해야합니다 :
      • 하이 패스 - DC
      • 노치 필터 - OFF
      • 패스 - 20kHz 낮음
      • 용량 컴프 .- 반시계
      • DC 오프셋 노프 - 시계 반대 파인 물론
      • DC 오프셋 (+ OFF -) - OFF
      • 게인 노브 - 50
      • 입력 (모노 비교 GND) - 비교
      • 모드 (STIM - GATE - REC) - REC
      • ΩTEST - OFF
    '입력 프로브'앰프에에 머리 단계를 연결합니다.
    흡입 전극에서 머리 단계로 전기 전선을 연결합니다. 와이어가 검은 중간에 녹색이 (지상), (맨 아래에있는 부정, 왼쪽 상단에 (긍정적인) 빨간색과 연결되어 있어야합니다. 이것은 그림 34에 표시됩니다. 접지 와이어가 방금 살린 욕탕에 넣어 수 있습니다.
    그림 34
    그림 34. 헤드 무대 구성
  11. 이제 노트북에 PowerLab의 26T에서 USB 코드를 연결합니다. 앰프와 PowerLab26T 모두에 연결되어 있고 컴퓨터에 LabChart7을 열기 전에이 켜져 있는지 확인하십시오.
  12. LabChart7를 엽니다.
    • LabChart 웰컴 센터 상자가 열립니다 나타납니다. 그것을 닫습니다. </ 리>
    • 설정을 클릭하십시오
    • 채널 설정을 클릭합니다. 확인을 누르면 1 (상자의 왼쪽 하단)에 채널 번호를 변경합니다.
    • 차트의 맨 왼쪽에 2K 약 초당 사이클로 설정합니다. 약 500 200mv로 볼트 (Y 축)을 설정합니다.
    • 차트의 오른쪽에 채널 1을 클릭합니다. 입력 앰프를 클릭하십시오. 않도록 설정 : AC 결합, 단일 종단, 그리고 반전 (필요한 경우 신호를 전도), 그리고 안티 - 별칭, 확인합니다.
    • 기록 프레스 시작를 시작합니다.
    우리는 세포외 기록과 행동 잠재력의 크기를 모니터링하기 위해 표면 flexor 근육 (지점 IIIb)를 innervates 3 ​​차 루트의 지점에서 녹화할 수 있습니다. 세포외 신경 자극은 '급상승'이라고합니다. 오 excitor 모터 뉴런이 루트에서 하나 억제제 모터 뉴런 (; 벨레즈 및 와이먼 1978 년 케네디와 다케다, 1965)가있다는 것을 기억. 브러쉬 또는 neuromodulators의 노출과 표피의 자극은 (​​그림 35) 활용하실 수 있습니다. 페인트 그것은 압력과 움직임의 양을 제어하는​​ micromanipulator에 장착 될 수 손으로 또는 지속적인 자극을 위해 사용될 수 있습니다.
    그림 35
    그림 35. 전에 호수 (위)와 100 nm의 5 - HT (하단)에 cuticular 자극하는 동안 제 3 루트의 활동. 표피의 자극 동안 시간은 막대로 표시됩니다. 준비가 5 - HT (스트론 외., 2000에서 수정)에서 목욕됩니다 자극 전후 향상 활동을합니다.
    우리는 신경의 ...하는 김에 녹음 작업을 수행하여 1 일 또는 2 차 뿌리에서 녹화할 수 있습니다, 또는 우리는 VNC와 VNC에 신호를 보내는 것입니다 주변에서 발생하는 기록 순수한 감각 입력으로부터 멀리 뿌리를 가로로 쪼개다 수 있습니다. 따라서, 당신은 감각 활동에 대한 주변 이어지는 가로 루트에서 기록합니다.
    2 층 루트는 신근 모터 뉴런 (필즈와 케네디, 1965)에 근육 수용체 기관 (MRO)와 efferents 작은 axons에서 매우 큰 차 수입 성의 axons가 포함되어 있습니다. 1 일 2 차 뿌리에 많은 감각 axons가 있습니다.
    mechanosensory 뉴런은 측면 거대한 axons (LG) (; 주커 1972 크라스네 1969)와 전기 시냅스로 직접 연결을했습니다. 또한, mechanosensory 뉴런은 시냅스를 통해 화학 interneurons를 자극하는 것으로 알려져 있습니다.
    검사하는 방법을 감각 입력 감각 - CNS - 모터 신경 회로를 통해, 모터 신경 세포 활동에 영향을 미칠 수있다, 우리는 근육의 신경 반응을 기록할 수 있습니다. 우리가 사용하는 회로의 다양한 측면을 검사하실 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 스파이크 주파수 레코딩을 분석하려면 VNC에 손상 감각 입력 여부에 상관없이 혼자 감각 신경 루트 또는 모터 루트에서 녹화할 수 있습니다 하나는 다양한 조건에서 일정 기간의 시간이 지남에 따라 셀 수 있습니다. 조치는 자극과 시간의 주어진 금액 (그림 35)에 대한 브러쉬 자극하는 동안에 브러시하기 전에 만들 수 있습니다. 하나는 조건, 5 번 반복하고 비교를하기위한 조치로 주파수의 평균 퍼센트 변화를 얻을 수 있습니다.
    하나는 또한 세로토닌 (스트론 외., 2000) 또는 아세틸콜린 (이크), 니코틴이나 글루 탐 산염과 같은 외인성 화합물을 적용할 수 있습니다. 다양한 행동 행동은 무척추 동물에서 니코틴에 대한 설명했습니다. 이것은 nicotinic 수용체의 존재 (Tsunoyama 및 Gojobori, 1998)를 제안합니다. 글루 탐 산염은 NMJ와 이크의 대부분의 무척추 동물의 중요한 흥분성의 신경 전달 물질 것은 CNS 내의 주요 흥분성의 신경 전달 물질 (.; 왓킨스, 외, 1990 Monoghan 외, 1989)입니다.
    하나는 heptanol 시도하거나 박사 소냐 M. Bierbower이 (켄터키 대학) 그녀의 논문 연구에 나타난 것처럼 그것은 회로 내에서 septate (또는 간격) 분기점 왕새우를 떨어지다 때문에 CO 2가 호수 부풀어 오른 모양이었다. 환경에서 높은 CO 2 (Bierbower와 쿠퍼, 2010)에 노출된 경우이 동작은 변경 전체 동물의 행동에 대한 계정 수 있습니다. 전에 활동과 heptanol 또는 CO 2 노출 동안에 차이가있다면 칫솔과 운전 감각 입력과 표피를 자극하고 모터 뉴런의 반응을 기록하면됩니다. 이것은 또는 감각 - CNS - 모터 신경 회로의 역할을 가지고 간격 분기점을 제안하지 않을 수 있습니다.

Discussion

막 잠재

마찬가지로 초기 1902와 같은, 번스타인은 오징어의 축삭에서 휴식 가능성의 문제를 처리했습니다. 그것은 번스타인 (1902)와 Nernst (1888)의 초기 아이디어와 관찰 나중에 막 생리 연구 영향을 어떻게 고려하는 흥미로운 것입니다. (Malmivuo 및 Plonsey 1995의 리뷰를 참조하고, WWW에서도 가능 http://www.bem.fi/book/ ). 이온 채널 기능과 조직, 장기 및 시스템의 기능에 관한 세포 생리를 이해하는 매우 중요한 아르 생물 세포막의 속성에 대해 만들어지고 획기이 오늘날까지 여전히있다.

외부의 실험과 이론적으로 파생 효과의 비교 [K +] 쉬고 막 잠재력에 막 잠재력에 대한 이온의 영향을 나타냅니다. 이 같은 준비를 사용하여 추가 실험은 근본적인 생리 질문을 해결하기 위해 수행할 수 남아 있습니다. 일부는 앳우드와 Parnas에 의해 1968 년 다시 강조되었고 아직 완전히 달려드는해야합니다. 이 운동에서 얻은 기술로, 하나는 다른 실험 준비뿐만 아니라 의학 및 건강에 관한 생리 응용 프로그램에 남아있는 많은 질문에 답변을 진행할 수 있습니다. 우리는 동물 관련 근본적인 문제를 해결하기 위해 모델 무척추 준비의 유용성을 증명하고있다.

지식이 위 운동 이온의 전기 그라디언트에서 얻은으로, 당신은 지금 왕새우에 신경근육학 준비에 신경 전송을 검토하여 세포막의 흥분을 진행하실 수 있습니다.

시냅틱 응답 측정

이 실험의 첫번째 부분과 관련된 영화가 제공하는 내용은, 멤브레인 잠재력을 기록하고 근육 구조를 조사하는 주요 단계를 제공합니다. 이 연구소의 두 번째 부분에서는, phasic 및 토닉 모터 단위의 NMJs에서 절개 및 녹음 시냅스 전달의 데모는 생리학 기본 개념에 노출을 제공했습니다. 부분에 자신의 실험실 운동 내에서 다양한 기한이 질문을 조사하기 위해 학생뿐만 아니라의 연결 회로에 대한 미래의 연구뿐만 아니라 잠재적인 우물에있는 그대로 동​​물에 관련된 행위를 설명하는 데 사용할 수있는 수있는 신경 회로에 노출 설립 무척추 준비 (케네디 외, 1969;. Antonsen와 에드워즈, 2003)

이러한 준비는 시냅스 촉진, 우울증 및 장기 소성 (이 실험실 연구에서 조사되지 않음) 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 뿐만 아니라 자연 환경, 심지어 왕새우 종 (种) 이내의 연결을 소성의 실험 자극 조건 (. 쿠퍼 외, 1998 머시 및 앳우드, 1989)에 따라 달라집니다. 어느 정도하기 위해 시냅스 효능과 근육 역학을 변경하는 능력은 동물이 조사에 남아 역할을합니다. 크레이 피쉬는 계절 변화 및 ​​털갈이 사이클과 관련하여 자신의 행동을 변경합니까 때문에, 자신의 신경근육학 시스템에 비교적 장기간의 활동 차이가 있습니다. 이것은 클로 가까이 근육의 phasic 모터 신경 터미널은 겨울 동안 고전 phasic 형태를 전시하지만, 여름 동안 터미널의 길이를 따라 더 정맥류의 (; Lnenicka 및 조 1991 Lnenicka 1993) 팽창하고 될 것으로 나타났습니다.

복부 신경 코드 내에서 왕새우 측면 대형 (LG) interneurons 실시 몇몇 초기 연구 갑 분기점 (; 와타나베와 Grundfest, 1961 존슨 1924 년)의 존재를 보여주었다. 이곳은 CO 2 갑 분기점을 (아레 야노 외, 1990) uncoupling하여 전기 통신에 효과를내는 것으로 알려져 있습니다. 이것은 최근에 본 보고서에 설명되어있는 감각 - CNS - 모터 근육 회로, 내의 신경 코드와 통신 간격 분기점 (Bierbower 2010의 존재를 나타내는 2 노출 CO 또한 민감한 것을 보여주었다 Bierbower와 쿠퍼, 2010)

1960이 동일하거나 인접한 세그먼트 내의 정적 근육 수용체 기관 (MRO)을 해고 토닉은 자연 모터 드라이브에 대한 계정이있다면 에커트 (1961)는 검사 때부터 3 차 모터 뿌리의 자발적인 활동 주제를했습니다. 이러한 초기 연구에서는이 활동을 가능성이 높은 센터 (; 케네디와 다케다, 1965a, B;. 스트론 외, 2000 에커트, 1961)에서 복부 신경 코드 (VNC) 내에서 구동 것을 분명했다. CO 2의 존재가 자발적 활동을 중단 이후, 한 갑 분기점 또는 glutamatergic 흥분성의 드라이브가있을 어딘가 드라이브에 모터 뉴런을 추측할 수있다. NMJs가 차단 또는 전시 CO 2의 존재에 조미료로 감도를 감소, 그들은 블록 수 아르(; Bierbower와 쿠퍼, 2010; Badre 외 또보고, 2005. Bierbower 2010) CNS 내에서뿐만 아니라 ked.

다양한 neuromodulators의 동작도 쉽게 NMJs의 다양한 유형 (; 그리피스 외, 2000;. 서더드 외, 2000;.. 스트론 외, 2000, 쿠퍼와 쿠퍼, 2009)에서 공부합니다. 또한, 다양한 영향은 CNS 회로에 neuromodulators로 끼쳤다 있습니다. . 슈나이더 외, 1996,,. 호르너 외, 1997;. 이것은 5 - HT 및 octopaminergic 뉴런이의 연결 회로의 출력 (MA 외, 1992를 변경에서 '이득 세터스'로 기능을 수있는 제안되었습니다 에드워즈 외., 2002). 우리가 완전히 개별 타겟 세포에 neuromodulators의 영향을 이해하기 전에 많은 작업이 남았 는데요. 다른 neuromodulators가 서로 콘서트에서 일할 수 있습니다 감안할 때, 그들의 혼합 행동의 분석 미래 연구 (Djokaj 외., 2001)을위한 영역입니다. 또한, 몇 가지 연구, 특히 척추 동물에서 특정 동작을 조절할 수있는 전체 경로에 neuromodulators의 효과를 주소를 입력합니다. 이 감각 - CNS - 모터 유닛 준비 하나는 모터 뉴런 (케네디 외., 1969)의 활동에 감각 입력 및 neuromodulators 모두의 영향을 검토할 수 있습니다.

그것이 5 - HT는 왕새우의 행동 상태, 바다 가재 규제의 역할을하고, 게는 (.. 리빙스턴 외, 1980; 스네돈 외, 2000)을 postulated되어 있기 때문에, 여러 시도에 그 농도를 결정되었습니다 VNC, hemolymph, 그리고 바다 가재 (리빙스톤 외, 1980., 해리스 - 워릭과 크래빗 1984;. Fadool 외, 1988)의 절연 신경 인치 그러나, 행동 행동에 대한 계정을 수있는 구체적인 선량 - 반응 관계를 precluding, 기록된 측정에 상당한 변화가 발생했습니다.

제기 위치하고 복부 아래에 자리잡고 꼬리 개최 발톱과 왕새우가 (리빙스턴 외., 1980) 지배 자세를 전시하는 것으로 생각되었습니다. 크레이 피쉬의 복부 굴곡의 상태는 지배 계층 상태 (Listerman 외., 2000) 유지하면서 지배 왕새우는 한 쌍의 내에서 사회적 상호 작용을하는 동안 전시 또는 자세로 나타나지 않습니다. 그들은 상대의 휴양지로 복종 왕새우도 스스로하에 자신의 abdomens 넣어 것입니다. 이러한 꼬리 집어넣고 또한 방위 태세 (Listerman 외., 2000)으로 여겨진다. 이러한 행동은 쉽게 (; Bruski 및 던햄, 1987; 리 외, 2000;.. Listerman 외, 2000 Bovbjerg, 1953, 1956) 현장 및 실험실 설정에서 관찰되었습니다. 흥미롭게도, 행동 자세 랍스타 (리빙스턴 외., 1980)에 명시된 바와는 5 - HT 및 호주 왕새우, Cherax의 소멸자 (맥레이, 1996)에 octopamine 주사에 대해 반대하고 있습니다. 아마, 완전히 다른 응답은 호주 왕새우의 표면 flexor 준비에서 관찰됩니다. 지배력은 일반적으로 왕새우 중에서 관련 크기이기 때문에 또한, 하나는 신속하게 변경 사회적 조건 (스트론 외., 2000)에 대한 매우 플라스틱 응답 시스템을 기대합니다. 무척추 동물에서 neuromodulators에 대응에서 소성 조사의 빈 공간입니다.

Wyttenbach, 존슨, 그리고 호이 (1999)는 디지털 미디어 및 기타 왕새우 준비 외에이 보고서에 표시되는 동일한 근육을 포함한 다양한 크레이 피쉬 experimentations위한 실험실 매뉴얼을 제작했습니다. 이것은 학생 운동에 대한 훌륭한 리소스입니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

켄터키 대학, 생물 학부, 학부 연구과 예술 & 과학 대학 사무실에서 지원됩니다.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld’s solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. Bouin’s fixative solution was used directly and methylene blue is made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139).
  4. Sylgard-bottomed glass dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Model 3000 AC/DC amplifier for intracellular as well as extracellular recordings can be used.
  8. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
  9. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. Intracellular electrodes were filled with 3 M KCl.
  10. A suction electrode is used to record extracellular signals.
  11. Faraday cage.
  12. High Intensity Illuminator (light source).
  13. Micromanipulator

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신경 과학 제 47 무척추 동물 크레이 피쉬 neurophysiology 근육 해부학 전기 생리학
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Baierlein, B., Thurow, A. L.,… More

Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322, doi:10.3791/2322 (2011).

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