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Neuroscience

Los potenciales de membrana, las respuestas sinápticas, circuitos neuronales, neuromodulación y la histología muscular utilizando el cangrejo de río: Los ejercicios de laboratorio para estudiantes

Published: January 18, 2011 doi: 10.3791/2322
Automatic Translation
*1, *1, *2, *1
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Los experimentos muestran un método fácil para que los estudiantes adquieran experiencia en el examen de la estructura muscular, las respuestas sinápticas, los efectos de los gradientes iónicos y la permeabilidad de los potenciales de membrana. Además, una sensorial-CNS-motor de los músculos del circuito se presenta para mostrar un medio para probar los efectos de los compuestos en un circuito neuronal.

Abstract

El propósito de este informe es ayudar a desarrollar una comprensión de los efectos causados ​​por los gradientes iónicos a través de una membrana biológica. Dos aspectos que influyen en el potencial de membrana de una célula y que abordaremos en estos experimentos son: (1) Concentración de iones de K + en el exterior de la membrana, y (2) la permeabilidad de la membrana de iones específicos. Los músculos extensores de cangrejos de río abdominal se encuentran en los grupos con algún tónico que (lento) y otros fásica (rápida) en sus fenotipos bioquímicos y fisiológicos, así como en su estructura, las neuronas motoras que inervan los músculos están correspondientemente diferentes características funcionales. Utilizamos estos músculos, así como el músculo superficial, tónico flexor abdominales para demostrar las propiedades en la transmisión sináptica. Además, se introduce un sensoriales-CNS-neurona motora de los músculos del circuito para demostrar el efecto de la estimulación sensorial cuticular, así como la influencia de los neuromoduladores sobre determinados aspectos del circuito. Con las técnicas obtenidos en este ejercicio, se puede empezar a responder a muchas preguntas que quedan en otras preparaciones experimentales, así como en aplicaciones fisiológicas relacionadas con la medicina y la salud. Hemos demostrado la utilidad de los preparativos de invertebrados modelo para abordar cuestiones fundamentales pertinentes a todos los animales.

Protocol

1. Introducción

Los objetivos de estos ejercicios de laboratorio para comprender las propiedades de las membranas excitables, las bases iónicas del potencial de membrana en reposo, y los métodos para medir el potencial de membrana. Además, la tinción y la histología del músculo se presenta, lo que puede ser utilizada para enseñar la estructura muscular. Además, dos diferentes tipos de preparaciones disecadas se utilizan para demostrar las propiedades de la transmisión sináptica en diversos grupos musculares. Una completa sensorial del sistema nervioso central (SNC) de la neurona motora de los músculos del circuito en el abdomen del cangrejo de río también es utilizado para presentar una preparación para examinar la estimulación sensorial y la influencia de neromodulators y los neurotransmisores en los aspectos de un circuito.

La primera parte de este informe se presentan los métodos utilizados para medir el potencial de membrana en reposo y la influencia de K + extracelular sobre el potencial de membrana. También vamos a introducir la estructura muscular. En la segunda parte de este ejercicio, se presentan los diversos medios de medición de las respuestas sinápticas de diferentes tipos de uniones neuromusculares (NMJs). El primer ejercicio utiliza los músculos extensores de cangrejos de río abdominal y el segundo utiliza los músculos abdominales superficial flexor. Además, presentamos un circuito neural (el cordón nervioso ventral de los cangrejos de río con las entradas sensoriales y salidas motoras) que es fácil de mantener, y que puede ser utilizado para la enseñanza, así como para la investigación en diversos aspectos de un sistema nervioso central-sensorial -neurona motora de los músculos del circuito. Después de completar la explicación de los ejercicios iniciales, se presenta la fisiología del sistema nervioso central y el circuito de NMJs.

El gradiente de iones a través de una membrana biológica puede dar lugar a una diferencia de potencial. Para que una célula en reposo, esta diferencia de carga eléctrica a través de la membrana de la célula que se conoce como potencial de las células de la membrana en reposo. Hay dos factores principales que vamos a abordar la influencia potencial de la membrana celular. La primera es la concentración de iones a ambos lados de la membrana. La segunda es la permeabilidad iónica de la membrana. Es importante tener en cuenta que en una célula viva hay una serie de diferentes iones con diferentes concentraciones dentro y fuera de la célula. Los iones de clave que se abordarán son el sodio (Na +), potasio (K +) y cloruro (Cl-). Las cantidades y el movimiento de estos iones a través de una membrana muscular determina el potencial de membrana. A partir de esta base, podemos abordar los potenciales eléctricos observados durante la excitación eléctrica y la inhibición de una membrana de las respuestas sinápticas y examinar los efectos de los agentes farmacológicos. También podemos construir modelos biofísicos para representar estos procesos a los conceptos de la prueba experimental (Robinson et al., 2010).

El uso de microelectrodos capilar de vidrio permite el registro de los potenciales de membrana. El electrodo puede ser insertado a través de la membrana celular sin causar daños, proporcionando la punta es lo suficientemente pequeño y una medida exacta del potencial de membrana se puede obtener. La técnica es particularmente aplicable a las células grandes, que son menos propensos a ser dañados por la inserción del electrodo intracelular. Esta es una de las técnicas esenciales en la fisiología.

El balance de Na + y K + a través de la membrana se mantiene por la bomba Na-K ATPasa en condiciones fisiológicas. En condiciones normales, los movimientos de la bomba, en promedio, tres Na + fuera de la célula y dos K ​​+ en la célula. Como nota al margen, el premio Nobel de química fue concedido en 1997 por este descubrimiento hizo a finales de los años 1950. Los fundamentos del descubrimiento fueron obtenidos de la investigación con los axones de un cangrejo (Skou, 1965, 1998).

Esta bomba también se considera electrógenos ya que tiene una mayor capacidad de la bomba cuando la membrana se despolariza (Skou, 1989a, b). En muchas células, la bomba se acelera cuando una célula es activada eléctricamente por la despolarización.

El potasio también puede moverse a través de potasio "fuga" de canales, mientras que una célula está en un estado de reposo. Debido a estos canales de fuga de potasio, la membrana de la célula en reposo es más permeable al potasio que a otros iones. Por lo tanto, el potencial de las células de membrana en reposo está más cerca del potencial de equilibrio para el potasio que de sodio. El potencial de reposo de la membrana puede ser examinada para ver si se depende del potencial de equilibrio de potasio.

1) la variabilidad del músculo

Las fibras musculares de crustáceos muestran una mayor variabilidad de las características estructurales, propiedades de la membrana eléctrica y las propiedades contráctiles de las fibras del músculo de vertebrados hacer. Las fibras musculares fásicas en los crustáceos se modifican las contracciones tipo de contracción. Se caracterizan por su corta longitud del sarcómero (2-4 micras), delgado y recto Z-líneas, una proporción baja de los filamentos delgados de espesor, y los sistemas bien desarrollados de túbulos T y sarcoplásmicoretículo. Fásica las membranas de la fibra muscular puede generar potenciales de acción gradual o todo o nada. Las fibras musculares tónicos, por otra parte, se modifican para el mantenimiento prolongado de tensión. A menudo tienen longitudes de sarcómera de 10 a 15 micras, grueso, ondulado líneas Z, una alta proporción de los miofilamentos delgados de espesor, y los sistemas menos desarrollados de los túbulos T y retículo sarcoplásmico. Tonic las membranas de las fibras musculares son a menudo eléctricamente inexcitables, o pueden producir calificado respuestas eléctricas ("picos clasificados"). Una amplia gama de tipos de fibras intermedias se encuentra en los músculos de los crustáceos.

2) Las ecuaciones

Las ecuaciones que se utilizan comúnmente para determinar el potencial de equilibrio de un potencial de membrana de iones y el descanso son la ecuación de Nernst y la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz (GHK), respectivamente. Una diferencia importante entre las dos ecuaciones es que la ecuación de Nernst se utiliza sólo para un ion específico para determinar el potencial de equilibrio para que el ion, mientras que la ecuación GHK se utiliza para determinar el potencial de reposo, considerando la permeabilidad de los iones múltiples y sus gradientes a través de una membrana celular (Nernst, 1888, 1889, Goldman, 1943; Hodgkin y Huxley, 1952; Hodgkin et al, 1952;. Hodgkin y Katz, 1949; ver Hille, 1992).

La ecuación de Nernst se considera en general para los iones a través de una membrana de la generación de una fuerza electromotriz, como comúnmente se muestra como:

V = (RT / ZF) ln ([X] a / [X] en)

X = ion de interés
V = tensión de equilibrio para el ion X través de la membrana
R = constante de los gases [8.314 J / (mol • K)]
T = temperatura absoluta [Kelvin]
Z = valencia del ion
F = constante de Faraday [9,649 x 10 4 C / mol]

Para los iones K + a 20 ° C y la transformación de Ln a Log 10 junto con el llenado de las constantes, se llega a:

Potencial = 58 log ([K] / [K out]), expresado en mV

Supongamos que K + sólo es permeable a la difusión. [K] es la concentración de K + en el interior de la célula y [K out] es la concentración de K + en el exterior de la célula.

Como una estimación del ejercicio [K]. ______________

Suponga para este cálculo, el potencial de membrana depende sólo del potencial de equilibrio K +.

Teniendo en cuenta la [K out] = para la solución salina usada es de 5,4 mM. Además, asume el potencial de membrana es-70mV.

Potencial = 58 log ([K] / 5,4).

En el experimento vamos a medir el potencial de una célula de membrana en reposo, y determinar cómo se ve influida por la alteración [K out]. La pendiente de la línea hipotética sobre el potencial de membrana y [K out] es de 58. Después de recoger datos sobre el potencial de membrana en reposo en varias [K out] (intervalo de 5,4 mM a 100 mM) que se representará los valores observados para determinar si hay una coincidencia con la línea hipotética. Vamos a utilizar el potencial de membrana en reposo promedio obtenido en el 5,4 mM [K out] para iniciar las líneas de hipótesis y observar para la comparación.

Teniendo en cuenta que una membrana puede ser permeable a más de un ion en reposo, así como en diferentes estados de despolarizado, se utiliza la ecuación de GHK tener en cuenta la permeabilidad (P en la ecuación) para varios iones. La ecuación de GHK se reduce a la ecuación de Nernst si una membrana es permeable a un solo ion.

Esta es una ecuación de GHK generalizada de Na +, K +, y iones Cl -:

Ecuación

Desde Cl - tiene una carga negativa, el término de concentración se invierte en esta ecuación para el interior y exterior. Esto permite que el Z (carga de iones) que se dejó.

3) Los objetivos de este ejercicio

En este experimento se medirá el potencial de membrana de una célula del músculo del cangrejo de río y aplicar los principios discutidos anteriormente a la dirección:

  1. ¿Cómo medir un potencial de membrana de la célula con la instrumentación adecuada y la técnica.
  2. Ion permeabilidad de la membrana celular del músculo y cómo contribuye al potencial de membrana.

    Además, vamos a hacer un estudio preliminar de la estructura muscular:
  3. Use las manchas para resaltar la anatomía de los músculos de la cara dorsal del abdomen del cangrejo de río, que se utiliza para llevar a cabo estos experimentos electrofisiológicos.
  4. Examinar la histología de los diferentes tipos de fibras musculares.

En este ejercicio de laboratorio, vamos a utilizar los músculos abdominales cangrejos extensor. Esta preparación ha sido utilizado en el pasado para enseñar estos principios en la fisiología de und anatomía (Atwood y Parnas, 1968). Hemos utilizado muchos de los procedimientos de esta fuente y otros modificados para dar cabida a los instrumentos actuales y para completar las metas en un único periodo de 3 horas de laboratorio los estudiantes. Estos ejercicios son una base para los experimentos de otros utilizados en el curso de Fisiología Animal del Departamento de Biología de la Universidad de Kentucky (Instructor Dr. RL Cooper, 2010).

4) ¿Por qué este modelo animal

Hay varias buenas razones para el uso de los músculos extensores de cangrejos de río abdominal en este experimento:

  1. Cangrejos de río están comúnmente disponibles y son relativamente baratos y fáciles de mantener en condiciones de laboratorio.
  2. La disección es relativamente fácil para los estudiantes que están aprendiendo técnicas de disección de los preparativos en vivo.
  3. El músculo es estable durante varias horas en una solución salina normal, mínimo que sirve bien para los estudiantes el aprendizaje de técnicas electrofisiológicas. La preparación muscular es bastante robusto cuando externos [K +] se ve alterada por cortos períodos de tiempo.
  4. Diversas respuestas sinápticas pueden obtenerse fácilmente mediante la estimulación de las neuronas motoras.
  5. La disposición anatómica de los músculos extensores es fácil de discernir, y debido a su gran tamaño es relativamente fácil de obtener estabilidad registros intracelulares.
  6. Los músculos y el patrón de inervación se puede observar fácilmente con tinción de azul de metileno. Además, determinados tipos de fibras musculares pueden ser fácilmente procesados ​​para histología para observar la estructura del sarcómero.
  7. No hay protocolos de animales son necesarios en este momento para la preparación de los animales invertebrados en la experimentación de laboratorio en muchas instituciones dentro de los EE.UU..

2. Métodos

1) Materiales

  • Tijeras (1)
  • Pinzas (1)
  • Alambre de plata para el cable de tierra (1)
  • Microscopio (1)
  • Electrodo de la sonda (1)
  • Petri con Sylgard en la parte inferior (1)
  • Solución salina (1)
  • Soluciones de potasio: 5.4mm (solución salina normal), 10, 20, 40, 80, 100 mM
  • Bleach (en pequeñas cantidades, el uso de la punta del hilo de plata para construir Ag-Cl)
  • Pipeta de vidrio (1), retirar y añadir soluciones
  • Jeringa (1)
  • Amplificador / sistema de adquisición (1)
  • Jaula de Faraday (1)
  • Desktop / Laptop (1)
  • Pines disección (4)
  • Cangrejo de río

2) Los métodos

2.1) Preparación / disección:

  1. Un cangrejo de río de aproximadamente 60-10 cm de longitud del cuerpo debe obtener (o un tamaño manejable). Mantener los cangrejos de río en la parte posterior de la cabeza o alrededor de un centímetro de la parte posterior de los ojos. Asegúrese de que las garras del cangrejo de río o de su boca no puede llegar al individuo el manejo de la langosta. (El cangrejo de río pueden ser colocados en hielo picado durante 5 minutos para anestesiar antes de cortar la cabeza.)
  2. Use las tijeras grandes para eliminar rápidamente la cabeza. Haga un corte limpio y rápido por detrás de los ojos de los cangrejos de río. Disponer de la cabeza y los apéndices.
    Figura 1
    Figura 1. La imagen muestra la ubicación de la incisión para extraer la cabeza de la langosta.
  3. Las patas y las garras de los cangrejos de río se puede quitar en este punto para evitar lesiones. Estiletes en los hombres y swimmerets tanto en hombres como en mujeres también pueden ser removidos (Figura 2). Luego, separe el abdomen del tórax. Haga un corte a lo largo de la membrana de la articulación que une el abdomen y el tórax (Figura 3). Guarde la parte del abdomen de los cangrejos de río y disponer de la caja torácica.
    Figura 2
    Figura 2. Las tijeras están reduciendo los estiletes. Estos pueden ser removidos de los cangrejos de río.
    Figura 3
    Figura 3. La imagen muestra la ubicación de la incisión para extraer el tórax del abdomen.
    Figura 4
    Figura 4. Eliminación del tórax del abdomen. El corte debe hacerse en forma circular a lo largo de la línea en la unión de los segmentos.
    Figura 5
    Figura 5. La imagen superior muestra el abdomen con apéndices swimmeret. Imagen inferior muestra el abdomen sin apéndices swimmeret.
  4. Con el abdomen, una corte debe ser hecho en la cáscara a lo largo del borde inferior, lateral de cada lado del abdomen. Se debe tener cuidado de no cortar demasiado profundamente en el cangrejo de río. Para ayudar en el proceso de cortar la cáscara, el corte debe ser hecho con las tijeras apuntando menosprecio hacia el lado ventral y en un ángulo. Siga el patrón de concha natural de las líneas de los cangrejos de río que recorren la longitud de cada segmento (Figura 6).
    Figura 6
    Figura 6. Tijeras se colocan en un ángulo y seguir la alineación natural de la cáscara. No corte demasiado profundo y destruir a la preparación. Los cabezas de flecha a punto de la línea natural a lo largo de cada segmento que debe ser seguido por los recortes.
  5. Eliminar la porción ventral de la concha. Tenga cuidado de no destruir los músculos abdominales. El uso de fórceps para extraer la parte ventral. Cuando la porción ventral de la concha se retira, una masa blanca de tejido se puede ver en la parte superior de los músculos flexores profundos. Este tejido puede ser removido cuidadosamente con pinzas.
    Figura 7
    Figura 7. Eliminación de la porción ventral de la concha con una pinza. Tire hacia arriba y atrás en la parte ventral de quitar. No destruir los músculos debajo de la cáscara ventral.
    Figura 8
    Figura 8. Tirando de la porción ventral de la concha, que debe ser descartado.
    Figura 9
    Figura 9. Corte la porción ventral de la preparación con unas tijeras y desechar.
  6. El tracto gastrointestinal, un pequeño tubo a lo largo de la línea media de los músculos flexores profundos, se pueden eliminar de los cangrejos de río. Apriete la parte superior de las vías con las pinzas y tire hacia afuera del abdomen. Corte la parte inferior de las vías - al final de la cola. Enjuague la disección con solución salina para los desechos fecales no interfiere con la preparación.
    Figura 10
    Figura 10. La imagen muestra el retiro del tubo digestivo desde la preparación.
  7. Utilizan los pernos para asegurar la disección de la preparación de la placa de Petri. Las esquinas superior e inferior de la preparación debe ser precisado en el plato. Solución salina se debe verter en la placa de Petri y cubrir la preparación por completo hasta que se llevan a cabo registros intracelulares.
    Este plato debe tener una disección Sylgard (Dow Corning) revestimiento en la parte inferior (1 cm de grosor), de modo que los pasadores de insectos pueden ser atrapados en él.
    Preparados disecados se bañan en una solución salina estándar de cangrejos de río, modificado a partir de solución de Van Harreveld (1936), que se hace con 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl2, 2H 2 O, 2,45 de MgCl 2, 6H 2 O, 5 HEPES y ajustar el pH 7,4 (en mm).

2.2) registro intracelular

Figura 11
Figura 11. Configuración general del equipo de grabación.

  1. La placa de Petri con la preparación debe ser colocado bajo el microscopio y se fija con cera en la parte inferior del plato para evitar el movimiento.
    Figura 12
    Figura 12. La colocación de la preparación en el microscopio. El uso de cera para asegurar la placa de Petri y la preparación.
  2. Dos cables, cada uno con un pequeño trozo de alambre de plata en un extremo debe ser obtenida. El hilo de plata deben ser sumergidos en una pequeña cantidad de cloro durante 20 minutos para obtener un recubrimiento de Ag-Cl. Lavar el hilo con agua antes de usar. Una pipeta de vidrio intracelular debe ser obtenido y rellenado con cuidado con una aguja larga conectada a una jeringa llena con una solución KCl 3M. La pipeta debe ser rechazado (con la abertura hacia el suelo) y se llena con la solución. Esto se asegurará de que cualquier exceso de KCl por goteo por la parte trasera del electrodo. Asegúrese de que no KCl corre a lo largo de la pipeta de vidrio que entrará en el baño de solución salina. A su vez la pipeta en posición vertical cuando se termine de llenar con una solución de cloruro de potasio. El hilo de plata puede ser colocado en la pipeta. El otro extremo está conectado al + (positivo) la pole en la etapa de la cabeza del amplificador. La pipeta se asegura entonces en la sonda del electrodo. El cuidado debe ser no romper la punta del electrodo. Un tercer cable conectado a la jaula de Faraday debe ser colocado en el polo verde de la etapa de la cabeza. Por último, el alambre de Ag del plomo restante debe ser colocado en el baño y el otro extremo conectado al - (negativo) polo se muestra a continuación. Un cable también debe ser colocada en la jaula de Faraday a la parte baja de la Powerlab convertidor AD. La etapa de la cabeza está conectada a la "entrada de la sonda 'en la adquisición / amplificador (Powerlab).
    Figura 13
    Figura 13. Jefe de configuración etapa. El cable conectado a la entrada del verde de la etapa de la cabeza se basa en el amplificador o jaula de Faraday. El cable conectado a la entrada de rojo está conectado al cable de electrodos. La entrada de negro se utiliza para conectarse a la solución del baño.
    Figura 14
    Figura 14. "Prueba de palanca" está en la fila inferior a la del electrodo de prueba resistance.The "grueso" botón también se encuentraen DC offset, que debe convertirse agujas del reloj contador. La ganancia se establece en 50, lo que amplifica las señales por un factor de cincuenta. El cable de tierra desde la etapa de la cabeza se coloca en el "GND" la apertura de clavija.
  3. El software LabChart se debe abrir en el escritorio o portátil. Ajustar el gráfico para mostrar sólo un canal haciendo clic en "Configuración", luego "Ajustes de canal". En "Configuración del canal", cambiar el número de canales a uno. Haga clic en "Aceptar". En la parte superior de la tabla, en la esquina izquierda, ciclos por segundo debe ser de 2K. Set V (eje Y) a alrededor de 200 mV a 500 mV. Haga clic en "Channel 1" en la parte derecha de la pantalla. Haga clic en "amplificador de entrada." Asegúrese de que la caja de diferencial se verifica.

    La salida del amplificador debe estar en un canal. Los siguientes ajustes se debe utilizar con el amplificador:
    • High Pass-DC
    • Filtro Notch-OFF
    • De paso bajo a 20 kHz
    • Capacidad de la izquierda .- Comp
    • DC Offset Artes y Curso de mando-en sentido contrario
    • DC Offset (+ OFF) - OFF
    • Ganancia de mando-50
    • De entrada (DIF MONO GND) - DIF
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
  4. Como una medida de la resistencia de los electrodos, la tensión debe ser dividida por la corriente, que es de 2,0 nA (es decir, R = V / I, o la ley de Ohm). El valor resultante es la resistencia del electrodo de vidrio. La resistencia debe ser 20 a 60 MegaOhmios. Más bajo (<20) y alta resistencia (> 100) no son aceptables. Una vez que la resistencia ha sido determinada, registros intracelulares puede comenzar. Coloque la punta del electrodo de vidrio en el baño de solución salina. Asegúrese de que un cable de tierra también está en el baño de solución salina.
    Para empezar a grabar, pulse Inicio en la parte inferior de la pantalla. Asegúrese de que la ganancia es de 5 V / div. Utilice el botón de dirección en el amplificador para mover la línea en la LabChart a cero antes de insertar el electrodo. La perilla de palanca debe estar encendido y apagado varias veces para poner a prueba la resistencia del electrodo. A continuación, la amplitud de los valores resultantes deben ser medidos. Coloque un marcador en la línea de base estable y el segundo lugar en la cima de obtener la resistencia del electrodo.
  5. Use la sonda del electrodo y el microscopio para insertar el electrodo en el músculo longitudinal (DEM o DEL1 o DEL2) de la preparación (ver figura 16). El electrodo apenas se inserta en el músculo. No penetran a través del músculo. El uso del microscopio y la configuración de la sonda con el fin de encontrar los músculos longitudinales y para insertar los electrodos en el músculo. La luz de alta intensidad debe ajustarse a ver con claridad el músculo como el electrodo que se introduce. Al meter las fibras musculares en esta preparación que comúnmente se puede ejecutar en los espacios y grietas en el músculo. Esta es la razón por la cual el potencial de membrana puede aparecer y luego desaparecer, y luego reaparecer.
    Figura 15
    Figura 15. Inserción de electrodos en el músculo.
  6. Para medir el potencial de membrana, utilice el botón de grueso en el amplificador para mover la línea en la LabChart a cero antes de insertar el electrodo. Poke una fibra muscular. A continuación, medir la amplitud de los valores resultantes. Colocar un marcador en la línea de base estable y registrar el valor.
    La diferencia en el marcador y el cursor activo se muestra en la parte derecha de la pantalla. El valor se da la tensión. La tensión registrada que tenga que ser dividida por la cantidad de amplificación en el amplificador (es decir, la amplificación de 10x o 100x). La tensión se deben convertir de volts a milivoltios (1 V = 1.000 mV) si los valores se registran en el software como voltios.
  7. Cuidadosamente el uso del microscopio y manipuladores para extraer el electrodo de la muscular. Poke otra fibra muscular y tenga en cuenta el potencial de membrana en reposo. Uno debe tomar varias grabaciones y se sienten cómodos con las medidas, así como la dirección del electrodo intracelular en las fibras musculares de interés.
    El electrodo probablemente no va a permanecer en una fibra muscular durante el cambio de todos los diferentes alterado [K +] soluciones a cabo. Lo mejor es retirar el electrodo, a continuación, cambiar la solución, entonces penetrar de nuevo para evitar daños en el músculo. Lo mejor es obtener tres lecturas por la solución de las fibras musculares por separado y el uso de un medio para evitar lecturas falsas.
  8. Utilizar una jeringa para retirar y desechar la solución salina de la placa de Petri. La placa de Petri se debe llenar con la concentración inmediatamente superior de la solución de cloruro de potasio, solución salina, cubriendo completamente la preparación. El mismo proceso se debe repetir con cada solución de potasio y los cambios en el voltaje / potencial debe ser anotado y registrado. La serie de [K +] soluciones salinas cangrejos que utilizamos son: 5,4, 20, 40, 60, 80, 100 mm.

2.3) Anatomía

Ahora que la fisiología se ha completado, podemos examinar los asociadosanatomía de las fibras musculares y el patrón de inervación. La transferencia de la preparación para el plato de tinción y añadir el azul de metileno (1 gramo de azul de metileno mezclado con 100 ml de solución salina cangrejos). Deje que la solución salina se bañan la preparación de 5 minutos y luego retirar y añadir solución salina cangrejo fresco, sin la mancha. La anatomía de estos músculos se han descrito en detalle en los últimos años (Huxley, 1880; Pilgrim y Wiersma, 1963). Sólo recientemente algunos de los músculos se han descrito anatómica, fisiológica y bioquímicamente (Cooper et al, 1998;. Griffis et al, 2000;. Sohn et al, 2000)..

La disposición anatómica de los músculos en general se muestra en la Figura 16 (lado derecho de la figura para este propósito). Busque el nervio principal que inerva los músculos de todo dentro de un segmento. Sketch el patrón de inervación de la SEM, DEL2, DEL1 DEM y los músculos en un segmento. El abdomen debe ser extendido completamente fijando la preparación en el plato con firmeza. A continuación, retire la solución salina y la solución de fijador. La solución de solución es una solución de Bouin (preparado con ácido pícrico saturado, formaldehído y ácido acético, Sigma-Aldrich Co.).

PRECAUCIÓN. No se deje esta solución en su piel o sus ojos. Evitar que los vapores de la solución, trabajando bajo la campana de humos. Si sus ojos empiezan a arder los ojos lavar inmediatamente en la estación de lavado de ojos.

Deje que la solución de Bouin permanecer en la preparación de unos 10 minutos y luego utilizar una pipeta y el intercambio de la solución de suero salino. Corte un pedazo fino de los músculos de DEL1 o DEL2 y el lugar en un portaobjetos de vidrio. Etiqueta de la diapositiva. Repita el procedimiento para el músculo SEM. Ver el patrón de bandas del sarcómero en los dos preparaciones de tejidos. Usted puede utilizar el microscopio compuesto y ajustar los objetivos de acuerdo a ver los patrones de bandas. Si es posible tomar una foto digital a través del ocular del microscopio (nota: algunas cámaras de teléfonos celulares funcionan bien para este procedimiento).

Figura 16
Figura 16. Esquema de una vista ventral de la parte dorsal del abdomen del cangrejo de río que muestra la musculatura extensora de cada segmento. El abdomen de la membrana muscular dorsal (DMA) y la cabeza superficial del extensor de los músculos accesorios (SEACC) se producen en los segmentos de 1 a 5 del abdomen con una orientación diferente para cada segmento. Con la excepción del segmento 1, estos músculos tienen sus sitios de unión en su extremo anterior a la tergito calcificado y en el extremo posterior de la membrana articular. En el segmento 1, los músculos tienen su homóloga sitios de fijación anterior a la membrana articular situada entre el tórax y el abdomen. La ilustración se basa en montajes fotográficos de metileno preparaciones teñidas azules. En el lado izquierdo de la figura de todos los músculos extensores de profundidad se han eliminado para mostrar los músculos extensor dorsal superficial. Escala = 2,35 mm. (Tomado de Sohn et al. 2000).

3. Resultados

Las siguientes preguntas y procesamiento de datos de ilustrar los principios y objetivos principales de este procedimiento de laboratorio.

  1. Parcela las medidas obtenidas de los potenciales de membrana en reposo en cada uno de [K +] a utilizar. A ver si las líneas observadas e hipotéticas coinciden en su vertiente. Para representar los valores de uso un terreno semi-log con el eje x de la variada [K +] como un tronco y el eje de los potenciales de membrana (como se muestra a continuación, la Figura 17). (Descargar documento gráfico gratis si es necesario http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ )
    Figura 17
    Figura 17. Papel cuadriculado
    Utilizar el potencial de membrana en reposo promedio obtenido en el 5,4 mM [K +] para iniciar a las líneas de hipótesis y observar para la comparación.
    Si las líneas no coinciden discutir por qué puede ser.
  2. Si ha alterado el nivel externo de iones Na +, se puede esperar el mismo tipo de alteraciones que se observan para cambiar la concentración de K +?
  3. ¿Qué tan bien de azul de metileno mancha los músculos en comparación con los nervios? ¿Por qué puede haber diferencias? Es el azul de metileno se utiliza hoy para la identificación de los tejidos o el contraste en células humanas vivas? ¿Qué relación hay con Sigmund Freud y las manchas utilizadas en cangrejos de río?
  4. Tenga en cuenta las diferencias en los patrones de sarcómero entre el DEL y los músculos SEM. Si es así, lo que podría ser la razón? ¿Todos los músculos tienen la misma distancia en reposo sarcómero? Dibujar el patrón de bandas musculares que ha observado con el microscopio y la etiqueta como gran parte de la figura como sea posible (en relación con la anatomía muscular conocida sarcómero).

4. Medición Re Synapticsponses

1) INTRODUCCIÓN

La preparación de extensión del músculo abdominal para demostrar el potencial de membrana en reposo es también ideal para demostrar la inducción de las respuestas sinápticas en el NMJs de los distintos músculos. Algunos músculos de los crustáceos son selectivamente inervados ya sea por un fásico o tónico de la neurona del motor, aunque algunas fibras individuales pueden ser inervadas por tanto las neuronas motoras fásicas y tónicas de excitación, como para el músculo extensor de los cangrejos caminando piernas (Atwood, 2008; ver JOVE producción id # 2319-Wu y Cooper, 2010) y la mayoría de los otros músculos de las extremidades (Wiersma, 1961a). Mediante la estimulación selectiva las neuronas motoras fásicas y tónicas, las diferencias fisiológicas en la EPSPS se puede medir. Las neuronas motoras fásicas produce una rápida contracción de las fibras musculares y evocar PPSE del orden de 10 a 40 mV. La respuesta fásica puede deprimir rápidamente con 5-10-Hz trenes de estimulación. Las neuronas motoras tónicas dar lugar a pequeños PPSE que se puede facilitar la presencia de una mayor frecuencia (10-50 Hz) de estimulación. Estructuralmente, los terminales presinápticos fásica y tónica en el NMJs son diferentes (Atwood y Cooper, 1996; Bradacs et al, 1997;.. Cooper et al, 1998).

Sorprendentemente, el fenotipo de las respuestas fisiológicas fásica puede sufrir una transformación a un estado tónico-como por las neuronas acondicionado eléctricamente fásica durante unas horas al día durante 7 días (Cooper et al, 1998;. Mercier y Atwood, 1989). También la sensibilidad a la neuromodulación de la NMJs transformado es primordial para la investigación de la regulación de la expresión del receptor (Griffis et al., 2000).

En esta preparación relativamente robusto (los músculos abdominales del cangrejo de río), tanto las respuestas tónica y fásica son fácilmente registrados y examinados para la facilitación y / o depresión de las respuestas sinápticas con los paradigmas de la estimulación variada. Con estos preparativos, los estudiantes serán capaces de reconocer las generalidades de las respuestas sinápticas fásico y tónico, estimulando un manojo de nervios.

Un adicional de preparación MNJ presentado se utiliza para monitorizar la actividad motriz intrínseca y estímulo sensorial inducida por la actividad motora del sistema nervioso central. Este es el músculo flexor superficial en la parte ventral del abdomen del cangrejo de río. Esta preparación también se utiliza para controlar el sensorial-CNS-motor de los músculos del circuito y los efectos de los neuromoduladores (Strawn et al., 2000).

En cada uno de los segmentos abdominales (excepto la última), hay tres grupos funcionales de los músculos: (1) los pleopod de control (pleópodos) movimiento, (2) tres músculos extensores y tres (3) los músculos flexores. Los flexores y extensores son grupos antagónicos de los músculos que producen la flexión ya sea abdominal o la extensión, causando la rotación alrededor de las articulaciones intersegmental. La musculatura fásica ocupa la mayor parte del volumen del abdomen, mientras que los músculos tónicos incluye las hojas delgadas de fibras que se extienden de la dorsal (extensores) y ventral (flexores) los aspectos de cada segmento abdominal.

En cangrejos de río, los músculos abdominales tónico flexor de cangrejos de río están inervadas en cada segmento medio por cinco neuronas motoras y por una neurona inhibitoria periférica. Las motoneuronas excitatorias uso el glutamato como neurotransmisor. Glutamato despolariza las fibras musculares, causando un aumento de la permeabilidad principalmente a los iones de sodio. La liberación de las neuronas inhibitorias ácido gamma-amino butírico (GABA), que por lo general hiperpolariza las fibras musculares, causando un aumento de la permeabilidad a los iones cloruro. En algunos músculos crustáceos (principalmente en las extremidades), las neuronas inhibidoras periféricas hacen contactos sinápticos con terminales de las neuronas motoras, así como con las fibras musculares, y reducir la cantidad de transmisor liberado por la neurona motora (inhibición presináptica) (Dudel y Kuffler de 1961 ). Este fenómeno no está presente en los músculos flexores de la tónica de los cangrejos.

El cordón nervioso ventral del cangrejo de río es una estructura de simetría bilateral que recorre el largo del animal. No hay un ganglio por segmento del cuerpo. En el abdomen (6 segmentos), cada ganglio contiene varios cientos de neuronas, y cada uno de los dos conectores se compone de unos pocos miles de axones. Los cuerpos de las células nerviosas forman una capa de varios cuerpos de células de espesor en la superficie ventral de cada ganglio. Inmediatamente por encima de la capa de células del cuerpo es una malla fina de los procesos neuronales, la neuropile. Todas las interacciones sinápticas se producen aquí, los cuerpos celulares están desprovistos de las sinapsis.

Cada ganglio abdominal (excepto el último) tiene tres raíces en cada lado. La primera raíz contiene axones de las neuronas que inervan la musculatura pleopod y axones sensoriales, la segunda raíz contiene los axones que inervan la musculatura extensora fásica y tónica y los axones sensoriales, y la tercera raíz, lo que deja el cordón nervioso varios milímetros caudal al ganglio, contiene los axones inervating musculatura flexora fásica y tónica. Hay dos ramas de la tercera raíz. La rama profunda (IIIa) inerva los músculos flexores sólo fásica. La rama superficial de la tercera raíz (IIIb) en cada mitad del segmento contiene seis axones, que inervan los músculos flexores de la tónica.

Las neuronas que inervan el músculo flexor tónico se activa espontáneamente, a diferencia de las neuronas eferentes fásica, y en una buena preparación, que continuará el fuego durante varias horas después de que el abdomen se ha eliminado de los animales. Para una revisión de la naturaleza histórica de los descubrimientos realizados en estos preparativos abdominal ver Atwood (2008). Los cuerpos celulares de cuatro de las neuronas motoras y de la neurona periférica inhibitoria que inervan el músculo flexor tónica en cualquier segmento de la mitad se encuentran en el ganglio de ese segmento. El cuerpo celular de la neurona motora restantes se localizan en el ganglio caudal que viene. Estas neuronas puede ser fácil distinguir unos de otros sobre la base de extracelluarly registrado amplitudes pico. Si el músculo flexor tónica del segmento medio se quita uno, junto con los ganglios dos que contenían neuronas que inervan el músculo, cinco neuronas suelen mostrar cierto grado de actividad espontánea. Estas neuronas están contados sobre la base de la amplitud relativa extracelular pico, en orden ascendente. F1 a F4 y F5 son las neuronas motoras, la más grande de la neurona activa espontáneamente, es el inhibidor periférico flexor. f6, el más grande de las neuronas motoras, es una neurona del motor de excitación que rara vez se activa espontáneamente.

El carácter espontáneo de la actividad de las neuronas motoras tónicas puede ser modulada por la aplicación exógena de compuestos o por un estímulo sensorial a la cutícula en el mismo segmento que se está supervisando la actividad de los nervios motores.

2) La disección

Para obtener la preparación de extensión abdominal el mismo procedimiento descrito anteriormente para el examen de los potenciales de membrana en reposo en relación con el potasio extracelular. La diferencia es cuidar del conjunto de nervios segmentarios que corre por el lado del caparazón. Este nervio se detuvo en un electrodo de succión que servirá como el electrodo de estimulación. Estimular a 1 Hz para el monitoreo respuestas fásicas. Estimular con ráfagas de pulsos de 10 Hz de 10 a 20 estímulos, mientras que el control de la respuesta tónica.

Los procedimientos experimentales para el cuidado a cabo experimentos en los músculos flexores de cangrejos de río son diferentes tónicas y las necesidades de uno y dejar el cordón nervioso ventral intacto. Preparación que consta de varios segmentos abdominales se hace. Este se obtiene de la siguiente manera:

  1. Un cangrejo de río de aproximadamente 60-10 cm de longitud del cuerpo debe obtener (o un tamaño manejable). Obtener el cangrejo de río mediante la celebración de la parte posterior de la cabeza o alrededor de 2 o 3 centímetros de la parte posterior de los ojos. Asegúrese de que las garras del cangrejo de río o de la boca no puede llegar al experimentador el manejo de los cangrejos de río. Disponer de la cabeza y apéndices después de retirarlas.
  2. Use las tijeras para eliminar rápidamente la cabeza. Haga un corte limpio y rápido por detrás de los ojos de los cangrejos de río.
    Figura 18
    Figura 18. La imagen muestra la ubicación de la incisión para extraer la cabeza de la langosta.
    Las patas y las garras de los cangrejos de río se puede quitar en este punto para evitar lesiones. Estiletes en los hombres y swimmerets tanto en hombres como en mujeres también pueden ser removidos (Figura 19 y 20). Luego, separe el abdomen del tórax. Haga un corte a lo largo de la membrana de la articulación que une el abdomen y el tórax (Figura 20).
  3. Guarde la parte del abdomen de los cangrejos de río y disponer de la caja torácica.
    Figura 19
    Figura 19. La imagen muestra la ubicación de los estiletes que se puede extraer de los cangrejos de río.
    Figura 20
    Figura 20. La imagen muestra la ubicación de la incisión para extraer el tórax del abdomen.
    Figura 21
    Figura 21. Eliminación del tórax del abdomen. El corte debe hacerse en forma circular a lo largo de la línea de la unión de los segmentos.
    Figura 22
    Figura 22. La imagen superior muestra el abdomen con apéndices. Imagen inferior muestra la eliminación de los apéndices abdominales.
  4. Colocar la preparación de la cola aisladas en solución salina en una gran placa de Petri. Precisar la parte de la cola y la parte superior de la preparación para el plato. Asegúrese de que la preparación es seguro. Use un bisturí para extirpar una porción cuadrada de la parte ventral de la preparación entre las costillas.
    Figura 23
    Figura 23.Muestra que debe ser el corte realizado para eliminar la poción ventral de la preparación.
  5. Un pequeño corte debe ser hecho (también se puede hacer con unas tijeras). Un colgajo debe ser cortado y levantado hacia arriba. El colgajo se puede eliminar con unas tijeras, exponiendo los músculos flexor profundo. El microscopio debe utilizarse durante este proceso para asegurar la precisión en la eliminación de la porción ventral de la preparación.
    Figura 24
    Figura 24. Corte de la preparación con unas tijeras para exponer los músculos.
    Figura 25
    Figura 25. Imagen superior muestra la captación de la tapa con unas pinzas. Imagen inferior muestra la eliminación de la aleta de la preparación con el microscopio.
    Figura 26
    Figura 26. La exposición de los músculos flexores superficiales.

3) registro intracelular:

Figura 27
Figura 27. Configuración general del equipo de grabación.

  1. La placa de Petri con la preparación debe ser colocado bajo el microscopio y se fija con cera en la parte inferior del plato para evitar el movimiento.
    Figura 28
    Figura 28. Muestra la ubicación de la preparación en el microscopio. El uso de cera para asegurar la placa de Petri y la preparación.
  2. Dos cables de corta longitud de alambre de plata en un extremo debe ser obtenida. El hilo de plata deben ser sumergidos en una pequeña cantidad de cloro durante 20 minutos para obtener un recubrimiento de Ag-Cl. Lavar el hilo con agua antes de usar. Una pipeta de vidrio intracelular se debe obtener y llena con cuidado con un KCl (3 M) solución. La pipeta debe ser rechazado (con la abertura hacia el suelo) y se llena con la solución. Este último se asegurará de que cualquier exceso de KCl por goteo por la parte trasera del electrodo. Asegúrese de que no KCl corre a lo largo de la pipeta de vidrio, que entrará en el baño de solución salina. A su vez la pipeta en posición vertical cuando se termine de llenar con una solución de cloruro de potasio. El hilo de plata puede ser colocado en la pipeta. El otro extremo está conectado al + (positivo) pole en el escenario con la cabeza. La pipeta se asegura entonces en la sonda del electrodo. El cuidado debe ser no romper la pipeta de los electrodos. Un tercer cable conectado a la jaula de Faraday debe ser colocado en el polo verde de la etapa de la cabeza. Por último, el alambre de Ag del plomo restante debe ser colocado en el baño y el otro extremo conectado al - (negativo) polo se muestra a continuación. Un cable también debe ser colocada en la jaula de Faraday a la parte baja de la Powerlab convertidor AD. La etapa de la cabeza está conectada a la "entrada de la sonda" en la adquisición / amplificador (Powerlab).
    Figura 29
    Figura 29. Jefe de configuración etapa. El cable conectado a la parte verde de la etapa de la cabeza se basa en el amplificador o jaula de Faraday. El cable conectado a la porción roja se conecta al cable de electrodos. La porción de negro se utiliza para conectarse a la solución del baño.
    Figura 30
    Figura 30. "Prueba de palanca" está en la fila de abajo para poner a prueba la resistencia del electrodo. El "grueso" botón también se encuentra en desplazamiento DC, que debe convertirse agujas del reloj contador. La ganancia se establece en 50, lo que amplifica las señales por un factor de cincuenta. El cable de tierra desde la etapa de la cabeza se coloca en el "GND" la apertura de clavija.
  3. El software LabChart se debe abrir en el escritorio o portátil. Ajustar el gráfico para mostrar sólo un canal haciendo clic en "Configuración", luego "Ajustes de canal". En "Configuración del canal", cambiar el número de canales a uno. Haga clic en "Aceptar". En la parte superior de la tabla, en la esquina izquierda, ciclos por segundo debe ser de 2K. Set V (eje Y) a alrededor de 200 mV a 500 mV. Haga clic en "Channel 1" en la parte derecha de la pantalla. Haga clic en "amplificador de entrada." Asegúrese de que la caja de diferencial se verifica.

    La salida del amplificador debe estar en un canal. Los siguientes ajustes se debe utilizar con el amplificador:
    • High Pass-DC
    • Filtro Notch-OFF
    • De paso bajo a 20 kHz
    • Capacidad de la izquierda .- Comp
    • DC Offset Artes y Curso de mando-en sentido contrario
    • DC Offset (+ OFF) - OFF
    • Ganancia de mando-50
    • De entrada (DIF MONO GND) - DIF
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
  4. Para medir la resistencia del electrodo, la tensión debe ser dividida por la corriente, que es de 2,0 nA. El valor resultante es la resistencia del electrodo de vidrio. La resistencia debe ser 20 a 60 MegaOhmios. Una vez que la resistencia ha sido determinada, registros intracelulares puede comenzar. Coloque la punta del electrodo de vidrio en el baño de solución salina. Asegúrese de que un cable de tierra también está en el baño de solución salina.
    Para empezar a grabar, pulse el botón "start" en la parte inferior de la pantalla. Asegúrese de que la ganancia es de 5 V / div. Utilice el botón de dirección en el amplificador para mover la línea en la LabChart a cero antes de insertar el electrodo. La perilla de palanca debe estar encendido y apagado varias veces para poner a prueba la resistencia del electrodo. A continuación, la amplitud de los valores resultantes deben ser medidos. Coloque un fabricante de la línea de base estable y el segundo lugar en la cima de obtener la resistencia del electrodo.
  5. Use la sonda del electrodo y el microscopio para insertar el electrodo en el músculo. No penetran a través del músculo. El uso del microscopio y la configuración de la sonda con el fin de encontrar la fina capa de fibras musculares y para insertar los electrodos en las fibras. La luz de alta intensidad puede ser utilizado como una fuente de luz cuando penetra en el músculo.
    Figura 31
    Figura 31. Inserción de electrodos en el músculo.
  6. Se debe tener cuidado para evitar dañar las raíces nerviosas a los músculos superficiales.
    Es aconsejable mantener el baño de solución salina los preparativos fresco (10-15 grados Celsius) y bien oxigenadas, mientras que llevar a cabo los procedimientos experimentales. Si las unidades de refrigeración no se dispone de reemplazar la solución salina con agua fresca, salina fría con regularidad. El oxígeno gaseoso o de aire por lo menos, debe burbujear a través de la solución salina.
  7. Registrar la actividad espontánea de los PPSE. Tenga en cuenta los diferentes tamaños de los PPSE y si IPSPs están presentes.
  8. Con mucho cuidado, tomar un pequeño arbusto y pintura a mano estimular lo largo del borde cutícula en el mismo segmento que se está monitoreando la actividad espontánea. Nota un cambio en la frecuencia de las respuestas y si PPSE diferente tamaño parece que no estaban allí antes de la estimulación de la cutícula.
    Figura 32
    Figura 32. Preparación con la estimulación de las raíces de arbustos y los nervios. (Modificado de Strawn et al., 2000)
  9. La estimulación se puede repetir después de una cuidadosa intercambiar el baño de solución salina con una que contiene un neuromodulador, como la serotonina (1 microM) o solución salina con burbujas de CO 2. Tenga en cuenta el efecto sobre el perfil de actividad de un determinado estímulo. También tenga en cuenta si el intercambio de la parte posterior de solución salina a un nuevo vuelve la actividad de solución salina a su estado inicial.
  10. A continuación, se puede monitorear la actividad neuronal en el circuito sensorial-CNS-neurona motora de diversas maneras. Podemos utilizar un electrodo de succión en lugar de un electrodo intracelular (Figura 33) para controlar la actividad neuronal motor. En la punta del electrodo de succión de vidrio, tubos de plástico que se coloca tiene una abertura del tamaño correcto para tirar el nervio en la punta. La apertura no debe ser demasiado grande, ya que el nervio se caen, o demasiado pequeño, ya que el nervio se vería perjudicada por la presión del electrodo. El tubo de plástico se coloca sobre una llama y se recorta de nuevo al tamaño necesario.
    Figura 33
    Figura 33. Puesta en funcionamiento con arreglo grabación de electrodos de aspiración.
    La posición del micromanipulador en una posición en el electrodo de succión tiene fácil acceso al baño de solución salina. De succión de hasta salina hasta que esté en contacto con el alambre de plata en el interior del electrodo de succión. Organizar el otro cable en la parte cortada hacia un electrodo de succión cerca de la punta del electrodo, por lo que ambos conductores se pondrá en contacto con el baño de solución salina.
    Como para el control eléctrico conectar el amplificador diferencial AC / DC (amplificador) a la alimentación 26T laboratorio. Para ello, conectar el cable adecuado a partir de la entrada 1 en el PowerLab 26T a la salida del amplificador.
    • Los controles del instrumento amplificador se debe establecer los siguientes ajustes:
      • High Pass-DC
      • Filtro Notch-OFF
      • De paso bajo a 20 kHz
      • Capacidad de la izquierda .- Comp
      • DC Offset Artes y Curso de mando-en sentido contrario
      • DC Offset (+ OFF) - OFF
      • Ganancia de mando-50
      • De entrada (DIF MONO GND) - DIF
      • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
      • ΩTEST-OFF
    Conecte la etapa de la cabeza a la "entrada de la sonda" en el amplificador.
    Conecte los cables eléctricos de los electrodos de succión para la etapa de la cabeza. Los cables deben estar conectados con el rojo (positivo) en la parte superior izquierda, el verde (tierra) en el medio, negro (negativo en la parte inferior. Esto se indica en la Figura 34. El cable de tierra solo se puede poner en el baño de solución salina.
    Figura 34
    Figura 34. Jefe etapa de configuración
  11. A continuación, conecte el cable USB de la 26T PowerLab a la computadora portátil. Asegúrese de que tanto el amplificador y PowerLab26T están conectados y encendidos antes de abrir LabChart7 en el ordenador.
  12. Abrir LabChart7.
    • La caja de LabChart Centro de Bienvenida se abrirá. Cerca de ella. </ Li>
    • Haga clic en Configuración
    • Haga clic en configuración de canal. Cambiar el número de canales a 1 (parte inferior izquierda del cuadro) pulse OK.
    • En la parte superior izquierda de la tabla del conjunto de ciclos por segundo a cerca de 2k. Establecer los voltios (eje Y) a unos 500 o 200 mV.
    • Haga clic en el canal 1 a la derecha del gráfico. Haga clic en la entrada de amplificador. Asegúrese de que la configuración: un solo terminal, junto ac, y se invierte (se invierte la señal si es necesario), y anti-alias, se comprueban.
    • Para comenzar a iniciar la grabación de prensa.
    Podemos grabar de la rama de la raíz 3 º que inerva el músculo flexor superficial (rama IIIb) para controlar el tamaño de los potenciales de acción con registro extracelular. Los impulsos nerviosos extracelular son conocidos como 'picos'. Hay que recordar que hay cinco neuronas motoras Excitor y un inhibidor de las neuronas motoras en esta raíz (Kennedy y Takeda, 1965; Vélez y Wyman, 1978). La estimulación de la cutícula con un cepillo o la exposición de los neuromoduladores pueden ser utilizados (Figura 35). El pincel se podría utilizar a mano o por la estimulación constante que podría ser montado en un micromanipulador para controlar la cantidad de presión y el movimiento.
    Figura 35
    Figura 35. Actividad de la raíz 3 º antes y durante la estimulación cuticular en solución salina (arriba) y en 100 nm 5-HT (abajo). El tiempo durante la estimulación cutícula se indica en la barra. Tenga en cuenta el incremento de la actividad antes y después de la estimulación cuando la preparación se baña en 5-HT (modificado de Strawn et al., 2000).
    Podemos grabar desde el 1 º o 2 º raíces al hacer una grabación al paso de los nervios, o podemos transecto la raíz fuera de la VNC y registro de entrada sensorial puro derivados de la periferia, que sería el envío de señales en el VNC. Por lo tanto, se registraría a partir de la raíz seccionada que lleva a la periferia de la actividad sensorial.
    La raíz contiene 2 ª gran axones aferentes primarias de los órganos receptores de los músculos (MRO) y el más pequeño de los axones eferentes a las neuronas motoras extensoras (Campos y Kennedy, 1965). Hay muchos axones sensoriales en la 1 ª y 2 ª raíces.
    Las neuronas mechanosensory tienen conexiones directas, por las sinapsis eléctricas con los axones gigantes laterales (LG) (Krasne 1969; Zucker, 1972). Además, las neuronas mechanosensory se sabe que excitan las interneuronas a través de sinapsis químicas.
    Para examinar cómo la información sensorial pueden influir en la actividad motora neuronal, a través de un circuito sensorial-CNS-las neuronas motoras, que pueden registrar las respuestas sinápticas en un músculo. Diversos aspectos del circuito vamos a utilizar puede ser examinado. Por ejemplo, se puede grabar desde la raíz del nervio sensorial solo o la raíz de motor, con o sin entrada sensorial intacta en el VNC Para analizar las grabaciones de la frecuencia pico, se pueden contar más de un período de tiempo en diferentes condiciones. Las medidas se pueden hacer antes de la brocha y la estimulación durante la estimulación cepillo para una determinada cantidad de tiempo (Figura 35). Se puede repetir las condiciones de 5 veces y obtener el cambio porcentual promedio en la frecuencia como una medida para hacer comparaciones.
    Uno puede también aplicar compuestos exógenos como la serotonina (Strawn et al., 2000) o la acetilcolina (ACh), la nicotina o el glutamato. Diversas acciones de comportamiento se han descrito para la nicotina en los invertebrados. Esto sugiere la presencia de los receptores nicotínicos (Tsunoyama y Gojobori, 1998). El glutamato es un neurotransmisor excitatorio importante en la mayoría de los invertebrados en la UNM y Ach es el principal neurotransmisor excitador en el SNC (Monoghan et al, 1989;. Watkins, et al, 1990).
    Se puede intentar heptanol o CO 2 burbujeado solución salina ya que desacoplar el cangrejo septadas (o gap) uniones dentro del circuito como el doctor Sonya M. Bierbower (Universidad de Kentucky) ha demostrado en su tesis doctoral. Esta acción puede dar cuenta de alteraciones del comportamiento animal en su totalidad cuando se expone a dos altos de CO en el ambiente (Bierbower y Cooper, 2010). Cuando se estimula la cutícula con un cepillo y la entrada de la unidad sensorial y registrar una respuesta en las neuronas motoras, tenga en cuenta si hay una diferencia en la actividad antes y durante heptanol o la exposición de CO 2. Esto puede o no puede sugerir uniones a tener un papel en el circuito sensorial-CNS-de la neurona motora.

Discussion

Potencial de membrana

Ya en 1902, Bernstein se ocupan de las cuestiones de un potencial de reposo en el axón de un calamar. Es interesante considerar cómo estas primeras ideas y observaciones de Bernstein (1902) y Nernst (1888) influenció más adelante la investigación en la fisiología de la membrana. (Véase la reseña de Malmivuo y Plonsey de 1995, también disponible en la www http://www.bem.fi/book/ ). Hay todavía, a día de hoy, los avances realizados sobre la función de los canales iónicos y las propiedades de las membranas biológicas que son muy importantes en la comprensión de la fisiología celular que se refiere a la función de los tejidos, órganos y sistemas.

La comparación de los efectos experimental y teórica derivada de externos [K +] en el potencial de membrana en reposo indica la influencia de los iones en el potencial de membrana. Experimentos adicionales con esta preparación misma aún no se han realizado para hacer frente a cuestiones fundamentales de orden fisiológico. Algunos se pusieron de relieve en 1968 por Atwood y Parnas y aún no se han abordado en su totalidad. Con las técnicas obtenidos en este ejercicio, se puede proceder a responder a muchas preguntas que quedan en otras preparaciones experimentales, así como en aplicaciones fisiológicas relacionadas con la medicina y la salud. Hemos demostrado la utilidad de una preparación de invertebrados modelo para abordar cuestiones fundamentales pertinentes a todos los animales.

Con el conocimiento adquirido en los gradientes electroquímicos de los iones en el ejercicio anterior, ahora se puede avanzar a la excitabilidad de las membranas mediante el examen de la transmisión sináptica en la preparación neuromuscular en el cangrejo de río.

La medición de las respuestas sinápticas

Los datos facilitados por la primera parte de este laboratorio, y la película de asociados, han dado pasos fundamentales para el registro de los potenciales de membrana y la investigación de la estructura muscular. En la segunda parte de este laboratorio, la demostración de la disección y el registro, transmisión sináptica en el NMJs de las unidades motoras fásicas y tónicas previsto una exposición de los conceptos fundamentales de la fisiología. La exposición a un circuito neural, lo que puede, en parte, puede ser utilizado para explicar los comportamientos asociados, en el animal intacto tiene un gran potencial no sólo para los estudiantes a investigar diversas cuestiones abiertas en el ejercicio de laboratorio, sino también para futuras investigaciones sobre los circuitos neuronales en un pozo invertebrados establecido preparación (Kennedy et al, 1969;. Antonsen y Edwards, 2003)

Estas preparaciones también pueden ser utilizados para investigar la facilitación sináptica, la depresión y la plasticidad a largo plazo (no investigados en este estudio de laboratorio). Incluso dentro de algunas especies de cangrejos de río, la plasticidad neuronal depende de las condiciones de estimulación experimental (Mercier y Atwood, 1989;. Cooper et al, 1998), así como su entorno natural. ¿En qué medida la posibilidad de modificar la eficacia sináptica y la dinámica muscular sirve a los animales debe ser investigado. Desde cangrejos alteren su comportamiento en relación con la variación estacional y el ciclo de muda, hay un plazo relativamente largo diferencias de actividad en sus sistemas neuromuscular. Se ha demostrado que las terminales nerviosas motoras fásicas de los músculos más garra presentan la morfología fásico clásico durante el invierno, pero se hinchan y se vuelven más varicosa a lo largo de la longitud de la terminal durante los meses de verano (Lnenicka 1993; Lnenicka y Zhao, 1991).

Algunos de los primeros estudios realizados en cangrejos gigantes laterales (LG) interneuronas en el cordón nervioso ventral demostrado la presencia de la brecha de los cruces (Johnson, 1924; Watanabe y Grundfest, 1961). Es bien sabido que el CO2 tiene un efecto en la comunicación eléctrica de desacoplamiento uniones (Arellano et al, 1990). Se ha demostrado recientemente que el cordón nervioso y la comunicación en el circuito sensorial-CNS-motor de los músculos, como se describe en este informe, también es sensible a la exposición de CO 2, lo que indica la presencia de la brecha de los cruces (Bierbower, 2010; Bierbower y Cooper, 2010)

La actividad espontánea de la raíz 3 de motor ha sido un tema desde la década de 1960, cuando Eckert (1961) examinaron si la tónica de disparo del receptor de órgano estático del músculo (MRO) en el mismo segmento o vecinos podría ser responsable de la unidad motora espontánea. En estos estudios anteriores se hizo evidente que la actividad fue impulsada en el cordón nervioso ventral (VNC), posiblemente de los centros superiores (Eckert, 1961; Kennedy y Takeda, 1965a, b;. Strawn et al, 2000). Dado que la presencia de CO 2 se detuvo la actividad espontánea, se puede suponer en algún lugar de la unidad de las neuronas motoras puede haber uniones o la unidad de excitación glutamatérgica. El NMJs se bloquean o se presentan disminución de la sensibilidad al glutamato en presencia de CO 2, y pueden ser bloqueked y en el SNC (Bierbower, 2010; Bierbower y Cooper, 2010, véase también Badre et al, 2005)..

La acción de los neuromoduladores diferentes es también fácilmente estudiado en los distintos tipos de NMJs (Cooper y Cooper, 2009; Griffis et al, 2000;. Southard et al, 2000;.. Strawn et al, 2000). Además, diversas influencias se ejercen por neuromoduladores en los circuitos del SNC. Se ha sugerido que la 5-HT y neuronas octopaminergic puede funcionar como "ganar-setters 'en la alteración de la salida de los circuitos neuronales (Ma et al, 1992;. Schneider et al, 1996;. Horner et al, 1997;. Edwards et al., 2002). Todavía queda mucho trabajo por hacer antes de que podamos comprender los efectos de los neuromoduladores en las células diana individual. Teniendo en cuenta que los neuromoduladores diferentes pueden trabajar en concierto con otros, el análisis de su acción mixta es un área para la investigación futura (Djokaj et al., 2001). Además, pocos estudios, sobre todo en los vertebrados, frente a los efectos de los neuromoduladores en las vías de todo lo que pueden regular una conducta específica. En esta preparación la unidad sensorial-motor-CNS se puede examinar la influencia de los estímulos sensoriales y neuromoduladores de la actividad de las neuronas motoras (Kennedy et al., 1969).

Ya que se ha postulado que la 5-HT juega un papel en la regulación del estado de comportamiento de los cangrejos, langostas y cangrejos (Livingstone et al, 1980;.. Sneddon et al, 2000), varios intentos se han hecho para determinar su concentración en el VNC, la hemolinfa, y en los ganglios aislados de langostas (Livingstone et al, 1980;. Harris-Warrick y Kravitz, 1984;. Fadool et al, 1988). Sin embargo, ha habido una considerable variación en las mediciones registradas, lo que impide específicas relaciones dosis-respuesta que podría dar cuenta de las acciones de comportamiento.

Un cangrejo de las pinzas de lugar en una posición elevada y con el rabo bajo su abdomen ha sido pensado para exhibir una postura dominan (Livingstone et al., 1980). El estado de la flexión abdominal en el cangrejo de río no parece ser la postura que cangrejos dominante, dentro de un par, las exhibiciones durante las interacciones sociales o mientras se mantiene un estatus dominante jerárquica (Listerman et al., 2000). Cangrejos sumisa incluso meter el abdomen en sí mismos se retiran de un oponente. Metiendo la cola como también es visto como una postura de defensa (Listerman et al., 2000). Estos comportamientos han sido difíciles de observar en el campo y en laboratorio (Bovbjerg, 1953, 1956; Bruski y Dunham, 1987; Li et al, 2000;.. Listerman et al, 2000). Curiosamente, las posturas del comportamiento observado en las langostas (Livingstone et al., 1980) se invierten para el 5-HT y las inyecciones de octopamina en el cangrejo australiano, Cherax destructor (McRae, 1996). Posiblemente, las respuestas totalmente diferentes que se observan en la preparación flexor superficial de los cangrejos de río en Australia. Además, dado que el dominio es por lo general relacionados con el tamaño de los cangrejos de río, se podría esperar de un sistema de respuesta muy rápido de plástico para modificar las condiciones sociales (Strawn et al., 2000). La plasticidad en respuesta a los neuromoduladores en los invertebrados es un área abierta de investigación.

Wyttenbach, Johnson, y Hoy (1999) han producido los medios digitales y un manual de laboratorio para experimentos varios cangrejos participación de la misma muscular presentados en este informe, además de los preparativos otros cangrejos de río. Este es un excelente recurso para los ejercicios de los estudiantes.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Con el apoyo de la Universidad de Kentucky, Departamento de Biología de la Oficina de Estudios de Grado y la Facultad de Artes y Ciencias.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld’s solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. Bouin’s fixative solution was used directly and methylene blue is made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139).
  4. Sylgard-bottomed glass dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Model 3000 AC/DC amplifier for intracellular as well as extracellular recordings can be used.
  8. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
  9. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. Intracellular electrodes were filled with 3 M KCl.
  10. A suction electrode is used to record extracellular signals.
  11. Faraday cage.
  12. High Intensity Illuminator (light source).
  13. Micromanipulator

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