Summary
इस रिपोर्ट में हम तकनीक है कि क्रेफ़िश hindgut के जीव विज्ञान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदर्शित करता है. हम बताते हैं कैसे क्रेफ़िश पेट काटना और संबद्ध शरीर रचना विज्ञान, शरीर विज्ञान और गतिविधि के मॉडुलन अध्ययन. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला शक्ति और संकुचन की गतिविधि बल transducer का उपयोग करके मापा जाता है.
Abstract
रिपोर्ट का उद्देश्य क्रेफ़िश hindgut तैयार करने के लिए विच्छेदन तकनीक का वर्णन है और प्रदर्शित करने के लिए कैसे एक बल transducer के साथ शारीरिक रिकॉर्डिंग बनाने के लिए संकुचन की ताकत पर नजर रखने के लिए है. इसके अलावा, हम प्रदर्शन कैसे नेत्रहीन क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला गतिविधि है, जो विभिन्न पेप्टाइड्स, biogenic amines और न्यूरोट्रांसमीटर के लिए एक bioassay के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है पर नजर रखने के लिए. यह तैयारी शरीर क्रिया विज्ञान में छात्र और छात्रों को औषधीय अवधारणाओं का प्रदर्शन करने के लिए प्रयोगशालाओं के लिए उत्तरदायी है. इस तैयारी के 100 से अधिक वर्षों के लिए उपयोग में किया गया है, और यह अभी भी पीढ़ी और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला लय के विनियमन की जांच के लिए और उनके मॉडुलन अंतर्निहित तंत्र का वर्णन करने के लिए एक मॉडल के रूप में बहुत प्रदान करता है. औषधीय assays और उप टाइपिंग रिसेप्टर है कि 50 साल पहले hindgut पर शुरू किया गया अभी भी आज अनुसंधान योगदान है. इस मजबूत तैयारी अच्छी तरह से शरीर विज्ञान और औषध विज्ञान में प्रशिक्षण के छात्रों के लिए अनुकूल है.
Protocol
1. परिचय
क्रेफ़िश hindgut के सबसे हाल ही में एक शोध प्रबंध में व्यापक सिंहावलोकन डॉ. बारबरा ई. (2007, जॉर्जिया राज्य विश्वविद्यालय, अटलांटा, जॉर्जिया, संयुक्त राज्य अमेरिका) Musolf, जो serotonergic मॉडुलन और innervation (Musolf एट अल, 2009 पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित द्वारा पालन किया गया था ). Crustacean hindguts पहले Alexandrowicz, तुलनात्मक शारीरिक रचना में एक अग्रणी (Alexandrowicz 1909), जो उनके innervation के विभिन्न पहलुओं का वर्णन द्वारा 100 से अधिक साल पहले थे अध्ययन. पिछले कुछ वर्षों में अनुसंधान जारी रखा, मांसपेशियों की परतों और वास्तुकला के प्रकार की पहचान, पूरे जानवर के लिए osmoregulation में hindgut के समग्र समारोह को संबोधित कर, और विभिन्न यौगिकों द्वारा hindgut सिकुड़ना modulatory नियंत्रण की जांच (Musolf, 2007 द्वारा की समीक्षा देखें). यह ध्यान दें कि hindgut गुदा भाग में कार्य करता है न केवल मल को निष्कासित करने के लिए, लेकिन यह भी osmoregulation के लिए पर्यावरण से पानी ले दिलचस्प है. पेट के इस क्षेत्र में आगे से गुजरना या जानवर की जरूरतों पर निर्भर करता है peristalsis को रिवर्स कर सकते हैं.
Alexandrowicz (1909) दो तंत्रिका plexuses innervating crustacean hindgut, एक भीतरी जाल और एक बाहरी जाल है, जो बाद में पहचान और निस्र्पक न्यूरोट्रांसमीटर के लिए अमीर स्रोत हो साबित की पहचान की. है 1950 डा. अर्नस्ट फ्लोरे क्रेफ़िश hindgut पर औषधीय अध्ययन की एक श्रृंखला शुरू किया और दिखा दिया कि संकुचन acetylcholine और उसके संबंधित यौगिकों के द्वारा और भी एपिनेफ्रीन और norepinephrine (फ्लोरे, 1954) के द्वारा modulated हैं. फ्लोरे, एक निरोधात्मक पदार्थ के रूप में जाना जाता है की खोज क्रेफ़िश में सैनिक प्रणाली (फ्लोरे, 1961) सहित विभिन्न तैयारी, पर इस पदार्थ के प्रभाव फैक्टर "मैं," अध्ययन. फैक्टर मैं बाद में GABA हो दिखाया गया था. इस प्रकार, क्रेफ़िश hindgut synaptic निषेध के प्रारंभिक अध्ययन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई.
GABA की खोज के बाद, अन्य ख्यात ट्रांसमीटरों भी hindgut plexuses के साथ जुड़ा हो दिखाया गया है और शारीरिक प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना. , Proctolin, इस तरह के ट्रांसमीटर डोपामाइन (Elofsson एट अल 1968. Elekes एट अल 1988) शामिल हैं (RYLPG-OH, मर्सिए एट अल 1997) दो orcokinin पेप्टाइड्स (NFDEIDRSGFGFN और AFDEIDRSGFGFN; Bungart एट अल 1994;. Dircksen एट अल 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen एट अल 2000.) और myosuppressin पेप्टाइड (मर्सिए एट अल 1997;.. सबसे अधिक संभावना pQDLDHVFLRFamide, cf Stemmler एट अल 2007). इन पदार्थों के प्रत्येक सहज hindgut संकुचन modulates, और GABA के अलावा सभी के लिए उत्तेजक हो दिखाई देते हैं. hindgut भी ग्लूटामेट और quisqualate (जोन्स, 1962; गलत एट अल २००३) जवाब है, लेकिन glutamatergic innervation के लिए स्पष्ट सबूत रिपोर्ट नहीं किया गया है . Intracellular दूत कि विभिन्न ट्रांसमीटरों के प्रभाव मध्यस्थता काफी हद तक बेरोज़गार हैं, लेकिन वहाँ डोपामाइन संकुचन (Knotz ऐंड मर्सिए, 1995) को बढ़ाने की क्षमता में शिविर की भागीदारी के लिए सबूत है.
हालांकि crustacean hindgut denervation निम्नलिखित अनायास अनुबंध, जैसे संकुचन आम तौर पर कमजोर और बेतरतीब (वेल्स, 1982; Winlow और Laverack, 1972a). क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंदोलन समन्वित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से मोटर उत्पादन की आवश्यकता है, जाहिरा तौर पर पिछले पेट नाड़ीग्रन्थि (Winlow और Laverack, 1972a, ख, ग) में उद्भव है. क्रेफ़िश, मोटर उत्पादन में 7 वें पेट जड़ है, जो 75 axons जिसका सेल निकायों पिछले पेट नाड़ीग्रन्थि (Kondoh और Hisada, 1986) में स्थानीयकृत हैं के माध्यम से hindgut करने के लिए किया जाता है. कम से कम पेप्टाइड्स के कुछ पिछले पेट नाड़ीग्रन्थि (. मर्सिए एट अल 1991b, Dircksen एट अल 2000 Siwicki और बिशप, 1986) में होने वाले न्यूरॉन्स से hindgut जाल करने के लिए आपूर्ति की जा दिखाई देते हैं, लेकिन dopamine अधिक में न्यूरॉन्स द्वारा आपूर्ति की है पूर्वकाल ganglia (मर्सिए एट अल 1991a.). 7 वें पेट रूट के माध्यम से मोटर उत्पादन के बाद से बड़ी, समन्वित संकुचन के लिए आवश्यक है, यह संभावना है कि कुछ या ख्यात ऊपर सूचीबद्ध ट्रांसमीटरों के सभी peristalsis के लिए कुछ रास्ते में योगदान. उनके रिश्तेदार योगदान है, लेकिन में जाना जाता है, नहीं कर रहे हैं. कुछ अंतर्दृष्टि परिपत्र और अनुदैर्ध्य अलग मांसपेशियों (मर्सिए और ली, 2002) पर उनके प्रभाव का अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है.
पचाया नहीं भोजन के आंदोलन को नियंत्रित करने के अलावा, तंत्रिका जाल crustacean hindgut के साथ जुड़े molting के साथ जुड़े एक महत्वपूर्ण endocrine समारोह निभाते हैं प्रकट होता है. केकड़ा, Carcinus maenas के hindgut अंत: स्रावी कोशिकाओं है कि ecdysis (वेबस्टर एट अल 2000) के दौरान crustacean hyperglycemic हार्मोन और अपने संबंधित अग्रदूत पेप्टाइड जारी है, पानी के तेज में एक भूमिका का सुझाव और molting के साथ जुड़े सूजन शामिल हैं. इस प्रकार, crustacean hindgut कई महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं में भाग लेता है.
इस रिपोर्ट में मुख्य रूप से उन्नत उच्च विद्यालय और शरीर क्रिया विज्ञान के पाठ्यक्रम कि प्रयोग में भाग लेने में स्नातक छात्रों के लिए एक शिक्षण उपकरण है. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैसे hindgut अनुबंध और कार्यों के छात्रों द्वारा संबोधित किया जा सकता पीछे संभावित तंत्र के महत्व. भेषज एजेंटों, न्यूरोट्रांसमीटर, और neurohormones, इस्तेमाल किया जाएगा और खुराक - प्रतिक्रिया घटता, निर्माण किया जाएगा, जो कैसे प्राप्त करने के लिए और शारीरिक और औषधीय डेटा की व्याख्या में छात्रों को शामिल करेगा. Agonists और विरोधी के लिए संबंध के साथ रिसेप्टर समारोह के एक सामान्य समझ भी हासिल किया जा सकता है. छात्रों को भी सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ग्राफिकल रूप में डेटा मौजूद सीखना होगा.
यह बहुत आसान है काटना और क्रेफ़िश hindgut से संकुचन रिकॉर्ड. Dissected तैयारी में, पेट को आसानी से exogenous पदार्थों को अवगत कराया है. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला गतिविधि में परिवर्तन नेत्रहीन या बल transducer, जो भी संकुचन की शक्ति की निगरानी कर सकते हैं के साथ नजर रखी जा सकता है. अपनी सादगी और एक bioassay तैयारी के रूप में विश्वसनीयता की वजह से, क्रेफ़िश hindgut अभी भी है peristalsis, मोटर उत्पादन और मांसपेशी संकुचन की मॉडुलन, और रिसेप्टर समारोह के तंत्र के बारे में कई अनुसंधान सवालों की जांच के लिए बहुत उपयोगी है. hindgut परीक्षण कीटनाशकों, crustaceancides, और कार्यों के विशिष्ट तंत्र के लिए प्रदूषण के लिए भी उपयोगी है.
2. तरीके
2.1) सामग्री
- क्रेफ़िश
- क्रेफ़िश खारा
- यंत्र विच्छेदन (मोटे और ठीक कैंची, मोटे और ठीक संदंश)
- Sylgard तली पेट्री डिश
- इस्पात विदारक पिंस
- beakers (रासायनिक समाधान पकड़)
- parafilm (कवर और मिश्रण समाधान के लिए)
2.2) विच्छेदन
- क्रेफ़िश (Procambarus clarkii) को मापने के शरीर की लंबाई में 6-10 सेमी 5 से 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए करने के लिए पशु anesthetize पहले विच्छेदन शुरू.
- Anesthetized क्रेफ़िश पंजे के पीछे से एक हाथ से पकड़ो. जल्दी, थैली से दोनों पक्षों पर सिर के बीच में कटौती, और तब क्रेफ़िश (नोट: तैयारी से खून चिपचिपा हो सकता है जब यह dries, तो उपकरण धो जब पूरा होगा) सिर काट लेना.
चित्रा 1: क्रेफ़िश के कत्ल - Chelipeds और चलने पैर कट.
- बाएँ और दाएँ tailfins कट, केवल मध्यम tailfin (uropod) छोड़ने.
- क्रेफ़िश के पृष्ठीय तरफ पृष्ठीय छल्ली के दोनों बाएँ और दाएँ पक्ष पर ventrally कटौती.
चित्रा 2: पृष्ठीय छल्ली का हटाना - छल्ली के पृष्ठीय पक्ष पर transversely कट, यकीन है कि कटौती सैनिक को नुकसान को रोकने के उथले फिर पृष्ठीय पेट छल्ली के निचले खंड हटाने बना.
- Dissected क्रेफ़िश Sylgard लाइन एक डिश में रखें.
- पकवान tailfin की नोक पर क्रेफ़िश पिन. एक सैनिक के दोनों तरफ अधिक पिन का उपयोग शरीर नीचे पकड़ करने के लिए आवश्यक के रूप में हो सकता है.
- क्रेफ़िश खारा के साथ पकवान कवर सैनिक लगातार एक विंदुक का उपयोग खारा के साथ सैनिक पानी में गोता लगाना सुनिश्चित करें भरें. 5.3 मिमी KCl; 13.5 मिमी 2 CaCl 2H 2 हे, 2.45 मिमी 2 MgCl 6 2 हे, खारा एक संशोधित वान Harreveld (1936) समाधान है, जो 205 मिमी NaCl के साथ बनाया है 5 मिमी HEPES और 7.4 पीएच को समायोजित. dissected क्रेफ़िश के रूप में 3 चित्र में दिखाया प्रकट करना चाहिए.
चित्रा 3: बरकरार GI के साथ dissected क्रेफ़िश.
2.3) प्रयोगों
जानवर में 2.3.1) संकुचन
- परिसर के समाधान के लिए तैयार है और स्नान खारा के रूप में एक ही तापमान पर परीक्षण किया जा लो. पर serotonin के अलग - अलग समाधान (100 एनएम, 1microM), (1microM) ग्लूटामेट और डोपामाइन (1microM) शुरू करने के लिए परीक्षण किया जा पदार्थ के रूप में क्रेफ़िश खारा में बनाया का उपयोग हो सकता है.
- के बारे में दस मिनट के लिए क्रेफ़िश के समाधान में बैठ dissected क्रेफ़िश यह विच्छेदन के सदमे और खारा जोखिम को समायोजित करने के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति दें. hindgut से धीमी गति से peristalsis संकुचन के लिए होते हैं शुरू कर देना चाहिए.
- एक बार संकुचन शुरू, संकुचन है कि तीस सेकंड (ध्यान दें: यानी peristalsis प्रकार, या अंधव्यवस्थात्मक, और किसी भी क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला लहरों की दिशा होती है कि संकुचन के प्रकार) में होने की संख्या रिकॉर्ड है.
तालिका 1: क्रेफ़िश खारा में संकुचनसंकुचन की संख्या संकुचन के प्रकार - एक अनुकरणीय का उपयोगpette, खारा क्रेफ़िश उजागर पेट की गुहा के भीतर निकालने के लिए, और करने के लिए सीधे hindgut पर जांच की जा पदार्थ युक्त खारा लागू है.
- समाधान जोड़ने के बाद तुरंत संकुचन है कि तीस सेकंड के बाद होने की संख्या रिकॉर्ड और संकुचन होते हैं कि (यानी क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला, या अंधव्यवस्थात्मक) के प्रकार ध्यान दें.
तालिका 2: यौगिकों करने के लिए जोखिम के साथ संकुचनयौगिक का परीक्षण किया एकाग्रता संकुचन की संख्या संकुचन के प्रकार - परीक्षण पदार्थ के जवाब रिकॉर्डिंग के तुरंत बाद, सामान्य क्रेफ़िश नमक के साथ सैनिक कई बार कुल्ला. तैयारी के 5 मिनट के लिए खड़ा है, जबकि क्रेफ़िश नमक के साथ हर 30 सेकंड के बारे में rinsing.
- एक विंदुक का प्रयोग, कुछ अगले जांच हो या पिछले पदार्थ की एक विविध एकाग्रता hindgut पर सीधे परीक्षण किया यौगिक युक्त खारा जगह है. यह सबसे अच्छा है के लिए एक कम एकाग्रता और काम है एक उच्च सांद्रता के लिए अपने रास्ते के साथ शुरू.
- प्रत्येक नए पदार्थ या प्रत्येक नए एकाग्रता को जोड़ने के बाद तुरंत संकुचन है कि तीस सेकंड के बाद होने की संख्या रिकॉर्ड और संकुचन के प्रकार ध्यान दें.
2.3.2) excised तैयारी में संकुचन की रिकॉर्डिंग बलों
चित्रा 4: सेटअप
- पुल फली transducer संलग्न.
- PowerLab 26T पुल फली संलग्न.
- PowerLab 26T कंप्यूटर पर यूएसबी पोर्ट के लिए संलग्न.
- LabChart7, खोलें डेस्कटॉप पर labchart7 आइकन पर क्लिक करके.
- LabChart आपका स्वागत केंद्र बॉक्स खुला पॉप जाएगा. इसे बंद करो.
- सेटअप पर क्लिक करें
- चैनल सेटिंग्स पर क्लिक करें. 1 (बॉक्स के नीचे छोड़ दिया) चैनलों की संख्या बदलें ठीक धक्का.
- चार्ट के ऊपरी बाएँ 2k के बारे में प्रति सेकंड चक्र निर्धारित किया है. के बारे में 500 या 200 mV के लिए वोल्ट (y-अक्ष) सेट.
- चार्ट के अधिकार पर एक चैनल पर क्लिक करें. इनपुट एम्पलीफायर पर क्लिक करें. सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स: एकल समाप्त, एसी युग्मित, और पलटना (संकेत अगर जरूरत inverts), और विरोधी उर्फ जाँच कर रहे हैं,.
- रिकॉर्डिंग प्रेस शुरू शुरू करने के लिए.
- तैयारी उठाओ और छाती और पेट के बीच मोड़ पर GI पथ में कटौती. तो ध्यान से पूंछ के Telson हिस्से के चारों ओर कटौती. Dissected क्रेफ़िश से GI पथ निकालें और यह Sylgard पकवान में जगह. वहाँ एक रक्त वाहिका है कि GI पथ की पृष्ठीय पहलू के साथ चलाता है. ध्यान इस GI पथ से दूर खींच. तैयारी पर ताजा क्रेफ़िश खारा डालो.
- Dissected क्रेफ़िश निकट क्लैंप में बल transducer रखें.
- क्रेफ़िश सैनिक बल transducer के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है हुक.
चित्रा 5: खारा में क्रेफ़िश के पृथक hindgut बल transducer के हुक से जुड़ी - जब तक सैनिक अनुबंध करने के लिए शुरू होता है रुको, और धक्का LabChart7 पर शुरू.
- चलो कार्यक्रम के बारे में 20 सेकंड के लिए चलाए. पुश "बंद करो," और लेबल टिप्पणी जोड़ने के लिए, "केवल खारा". तालिका 4 भरें.
तालिका 4: ब्याज के परिसर के साथ संकुचनसंकुचन की संख्या संकुचन के आयाम (mV) - परीक्षण यौगिकों की ब्याज जोड़ें, और तुरंत धक्का LabChart7 पर "शुरू".
- चलो कार्यक्रम के बारे में 20 सेकंड के लिए चलाए. "बंद करो" पुश और पदार्थ क्या जोड़ा गया है और अपनी एकाग्रता चार्ट के रूप में फ़ाइल पर सीधे टिप्पणी जोड़ने. तालिका के नीचे भरें.
तालिका 5: _________ परिसर के साथ संकुचनसंकुचन की संख्या संकुचन के आयाम (mV) - क्रेफ़िश एक विंदुक का उपयोग खारा के साथ बंद कुल्ला तैयारी.
- एक समान तरीके में अन्य पदार्थ या विभिन्न सांद्रता जोड़ें. तुरंत धक्का LabChart7 पर "शुरू".
- चलो कार्यक्रम के बारे में 20 सेकंड के लिए चलाए. पुश "बंद करो," और एक टिप्पणी और चार्ट फ़ाइल पर सीधे लेबल ग संकेत जोड़नेप्रयोग किया जाता है और एकाग्रता ompound.
3. डेटा विश्लेषण
- 2.3.1 प्रयोग, प्रत्येक समाधान (खारा, serotonin, ग्लूटामेट) बनाम समय से संकुचन की संख्या ग्राफ से. किसी भी रुझान के बारे में बताएं.
- का प्रयोग, प्रत्येक समाधान से संकुचन की संख्या ग्राफ (खारा, serotonin, ग्लूटामेट) बनाम mV में संकुचन के आयाम से 2.3.2. किसी भी रुझान के बारे में बताएं.
3.1) और संकुचन की दर बल मापने
सूचकांक करने के लिए पर संकुचन की दर एक विक्षेपन पर शुरुआत से अगले की शुरुआत करने के लिए समय उपाय या एक मिनट या दो से अधिक कुल deflections गिनती कर सकते हैं. मानों तो कैसे वे तेजी से उत्पन्न कर रहे हैं पर निर्भर करता है प्रति मिनट या प्रति सेकंड संकुचन के मामले में रखा जा सकता है है.
सूचकांक संकुचन की शक्ति एक रिश्तेदार को मापने के लिए विभिन्न स्थितियों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सहेजी गई फ़ाइल पर एक "एम" मार्कर का उपयोग करें और आधारभूत करने के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं. तो कर्सर का उपयोग करें और विक्षेपन के शिखर करने के लिए और कदम एक डेल्टा मूल्य (एम से चोटी फर्क) के रूप में स्क्रीन के ऊपर सही पर सूचीबद्ध मूल्य का ध्यान रखना. नोट कर्सर परिवर्तन के उपाय के लिए स्थिर रखा जाना चाहिए. तो ब्याज की अगली लहर फार्म एम स्थानांतरित करने के लिए और उपाय दोहराने.
Discussion
जुड़े फिल्म और पाठ में उपलब्ध कराई गई जानकारी कुंजी क्रेफ़िश के hindgut में सीटू के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इन विट्रो में गतिविधि रिकॉर्ड के लिए आवश्यक कदम का वर्णन है. हमारी रिपोर्ट का एक लक्ष्य के छात्र चलाने जांच प्रयोगशालाओं कि शरीर विज्ञान और औषध विज्ञान में मौलिक अवधारणाओं सिखाने में इस तैयारी की क्षमता के लिए जागरूकता बढ़ाने के है.
ये तैयारी के लिए प्रयोगात्मक सवाल है कि hindgut के शारीरिक कार्यों का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व करेंगे के एक नंबर की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला तरंगों और उनके उत्क्रमण के विनियमन अंतर्निहित तंत्र अभी भी नहीं जाना जाता है. पूरे सैनिक पथ के उच्च नियंत्रण के लिए तंत्र को भी पूरी तरह नहीं समझ रहे हैं. कैसे उच्चतर केन्द्रों autonomic उत्पादन है कि सीधे सैनिक नियंत्रण प्रणाली के साथ उनकी गतिविधियों को एकीकृत प्रश्न जांच के एक खुले क्षेत्र (Shuranova एट अल., 2006) बनी हुई है. इसके अलावा, crustacean hindgut और molting और पर्यावरण तनाव के दौरान osmoregulation के कार्यों के osmoregulatory क्षमताओं को पूरी तरह से नहीं किया गया है elucidated है. वहाँ अभी भी कई सवालों के इस तैयारी में जवाब का इंतजार कर रहे हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
केंटकी के विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, कला और विज्ञान के स्नातक अध्ययन और कॉलेज के कार्यालय द्वारा समर्थित है.
Materials
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