Summary
В этом отчете мы показываем, методов, которые могут быть использованы для исследования биологии раков кишке. Покажем, как рассекают раков брюшной полости и исследование связанных анатомии, физиологии и модуляция активности. Перистальтической активности и силы сокращений были проведены с помощью силы преобразователя.
Abstract
Целью доклада является описание методов вскрытия для подготовки раков кишке и продемонстрировать, как делать записи с физиологическими датчик силы для контроля силы сжатия. Кроме того, мы показали, как визуально контролировать перистальтической активности, которая может быть использована в качестве биологического анализа для различных пептидов, биогенных аминов и нейротрансмиттеров. Этот препарат поддается студенческих лабораторий в области физиологии и за демонстрацию фармакологической концепции для студентов. Этот препарат используется уже в течение более 100 лет, и она по-прежнему предлагает гораздо качестве модели для исследования генерации и регулирования перистальтических ритмы и для описания механизмов лежащих в основе их модуляции. Фармакологических проб и рецепторов субтипирование, которые были начаты более 50 лет назад на задней кишки по-прежнему способствовать исследованиям сегодня. Этот надежный препарат хорошо подходит для обучения студентов в области физиологии и фармакологии.
Protocol
1. Введение
Последние всесторонний обзор задней кишки раков было выполнено в диссертации доктор Барбара Э. Musolf (2007, Университет штата Джорджия, Атланта, Джорджия, США), которые сосредоточены главным образом на серотонинергической модуляции и иннервации (Musolf и соавт., 2009 ). Ракообразных hindguts впервые были исследованы более 100 лет назад Александрович, пионер в области сравнительной анатомии (Александрович, 1909), который описал различные аспекты их иннервации. Исследование продолжалось на протяжении многих лет, определения типов мышечных слоев и архитектуры, обращаясь к общей функции задней кишки в осморегуляции для целого животного, а также изучая модулирующее управление кишке сократимости различных соединений (см. обзор Musolf, 2007). Интересно отметить, что анальная часть задней кишки действует не только изгнать калом, но и поднять воду из окружающей среды для осморегуляции. Этот участок кишки могут пройти вперед или назад перистальтику в зависимости от потребностей животного.
Александрович (1909) выделил два нервных сплетений, иннервирующих ракообразных задней кишки, внутреннее сплетение и внешней сплетения, которые позже оказались богатым источником для выявления и характеризующие нейромедиаторов. В 1950-х годах д-р Эрнст Флори начал ряд фармакологических исследований на рак кишки и показали, что сокращение модулируются ацетилхолина и его родственных соединений, а также адреналина и норадреналина (Флори, 1954). Флори, первооткрыватель тормозные вещества, известного как "фактор-I", изучал влияние этого вещества на различных препаратов, в том числе И. система раков (Флори, 1961). Фактор-я позже показано, что ГАМК. Таким образом, рак кишки играют важную роль в ранних исследованиях синаптических торможения.
После открытия ГАМК, другие предполагаемые передатчики были также показано, что связано с задней кишки сплетений и вызывать физиологические реакции. Такие передатчики включают допамин (Elekes и др., 1988;. Elofsson и др. 1968 год.) Proctolin (RYLPG-ОН;. Мерсье и др., 1997) два orcokinin пептидов (NFDEIDRSGFGFN и AFDEIDRSGFGFN; Л. Бунгарта и др., 1994;.. Dircksen и др. 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen и др., 2000.) и myosuppressin пептид (Мерсье и др., 1997;..., скорее всего, pQDLDHVFLRFamide, ср Stemmler и др. 2007). Каждое из этих веществ модулирует спонтанную сокращений кишки, и все, кроме ГАМК-видимому, возбуждающие. Кишке также реагирует на глутамат и quisqualate (Jones, 1962;. Неправильно и др. 2003), однако четких доказательств глутаматергической иннервации не сообщалось. Внутриклеточное посланников, которые опосредуют эффекты различных передатчиков в значительной степени неисследованной, но есть доказательства участия цАМФ в способности допамина, направленные на повышение сокращений (Knotz & Mercier, 1995).
Хотя кишке ракообразных контрактов спонтанно следующие денервации, такие сокращения, как правило, слабы и дезорганизованы (Уэльс, 1982; Winlow & Лаверек, 1972а). Перистальтические движения требует скоординированных мощностью двигателя от центральной нервной системы, по-видимому, происходящих в последние брюшные ганглии (Winlow & Лаверек, 1972а, б, в). В раков, мощность двигателя осуществляется с задней кишки через 7-й брюшной корень, который содержит 75 аксоны которых клеточные тела локализованы в последние брюшные ганглии (Кондо и Hisada, 1986). По крайней мере, некоторые пептиды, кажется, подается на заднюю кишку сплетение от нейронов, происходящих в последние брюшные ганглии (Dircksen и др., 2000;.. Мерсье и др., 1991b; Сивицкий и епископ, 1986), но дофамин поставляется нейронов в более передние ганглии (Мерсье и соавт. 1991a). Так как мощность двигателя, через 7-й брюшной корень необходимой для крупных, скоординированного сокращения, вполне вероятно, что все или некоторые из предполагаемых передатчиков, перечисленных выше способствовать каким-то образом перистальтику. Их относительные вклады, однако, не известны. Некоторые понимание могут быть получены путем изучения их влияния на кольцевые и продольные мышцы отдельно (Mercier & Lee, 2002).
В дополнение к управлению движением непереваренной пищи, нервных сплетений связанные с ракообразное кишке-видимому, играет важную функцию эндокринной связанные с линьки. Кишке из краба, Carcinus maenas, содержит эндокринные клетки, которые выделяют гормон ракообразных гипергликемии и связанных с ним пептида предшественника во время линьки (Webster и соавт. 2000), что свидетельствует о роли в поглощение воды и отеки связаны с линьки. Таким образом, ракообразных кишке принимает участие в нескольких важных физиологических процессов.
Этот доклад в первую очередь учебного пособия для продвинутых средней школы и студентов в области физиологии курсов, которые участвуют в экспериментах. Значение, а также потенциальный механизм как за кишке контрактов и функции могут быть решены студентами. Фармакологические средства, нейромедиаторов и нейрогормонов будет использоваться, и кривых доза-реакция будет построена, что позволит вовлечь студентов в том, как приобрести и интерпретации физиологических и фармакологических данных. Общее понимание рецепторов функции в отношении агонистов и антагонистов может быть достигнуто. Студенты также узнаете, представить данные в графическом виде для статистического анализа.
Это очень легко вскрыть и записывать сокращений от рака кишки. В расчлененный подготовки, кишечника легко подвергается экзогенных веществ. Изменением перистальтической активности можно наблюдать визуально или с помощью датчик силы, которая может также контролировать силу сжатия. Из-за своей простоты и надежности, как биопроб подготовки, кишке раки по-прежнему очень полезны для изучения многих вопросов исследования о механизмах перистальтику, модуляции мощность двигателя и мышц, и рецепторные функции. Кишке также полезно для тестирования инсектициды, crustaceancides, и загрязняющих веществ для конкретных механизмов действия.
2. Методы
2,1) Материалы
- рак
- раков солевой
- рассечение инструментов (грубая и тонкая ножницы, грубой и тонкой щипцы)
- Sylgard дном чашки Петри
- сталь рассекает контакты
- стаканы (провести химические растворы)
- парафильмом (для покрытия и смешивания растворов)
2.2) Препарирование
- Раки (Procambarus clarkii) размером 6-10 см в длине тела должны быть размещены на льду в течение 5 до 10 минут, чтобы обезболить животное до вскрытия начинается.
- Держите под наркозом раков из-за когтями одной рукой. Быстро, вырезать из глазницы к середине головы с обеих сторон, а затем обезглавить раков (Примечание: кровь из подготовки будет липким, когда она высыхает, поэтому мойте инструмент после его завершения).
Рисунок 1: Обезглавливание раков - Отрежьте chelipeds и ходьбе ноги.
- Отрежьте левой и правой хвостовые плавники, оставляя только средний хвостовым оперением (уропод).
- На спинной стороне раки вырезать снизу на левой и правой стороны спины кутикулы.
Рисунок 2: Удаление спинного кутикулы - Сокращение поперечно на спинной стороне от кутикулы, убедившись, что разрез мелкой, чтобы предотвратить повреждение И. Затем удалите нижнюю часть спины брюшной кутикулы.
- Место расчлененный раков в Sylgard подкладке блюдо.
- Pin раков на блюдо на кончике хвостовым оперением. Можно использовать больше контактов по обе стороны ЖКТ мере необходимости, чтобы удерживать тело вниз.
- Заполните блюдо с раками солевого покрытия И. Убедитесь, что постоянно потушить И. физиологическим раствором с помощью пипетки. Соленая это решение изменение Ван Harreveld (1936), который сделан с 205 мМ NaCl, 5,3 мМ KCl, 13,5 мМ CaCl 2 2H 2 O; 2,45 мМ MgCl 2 6H 2 O, 5 мМ HEPES и доводят до рН 7,4. Расчлененный раки должны выглядеть, как показано на рисунке 3.
Рисунок 3: расчлененный раки с Г. И. нетронутыми.
2.3) Эксперименты
2.3.1) Сокращения в животном
- Имеют решения соединения для проверки готовности и при той же температуре, как купание физиологического раствора. На могли бы использовать индивидуальные решения серотонина (100 нМ, 1microM), глутамат (1microM) и допамина (1microM), сделанные в раков солевой качестве исходного вещества для тестирования.
- Разрешить расчлененный раков, чтобы сидеть в раков решение в течение приблизительно десяти минут, чтобы позволить ему приспособиться к шока рассечение и соленых экспозиции. Медленного сокращения перистальтики из задней кишки должны начать происходить.
- Как только начинаются схватки, записать число сокращений, которые происходят в тридцать секунд (обратите внимание на тип сокращения, которые происходят: то есть перистальтику типа, или спастические и руководство любыми перистальтических волн).
Таблица 1: Сокращения в Раки SalineКоличество сокращений Тип Сокращения - Использование пиpette, удалить солевые в полости живота подвергаются раки, и применять солевые, содержащие это вещество следует рассматривать непосредственно на задней кишки.
- Сразу же после добавления раствора, записи количества сокращений, которые происходят после тридцати секунд и обратите внимание на тип сокращения, которые происходят (например, перистальтические, или спастические).
Таблица 2: Сокращения с воздействием соединенийСоединения испытания Концентрация Количество сокращений Тип Сокращения - Сразу же после записи ответ на исследуемое вещество, промыть И. несколько раз с физиологическим раствором раков. Пусть подготовки на 5 минут, в то время промывки примерно каждые 30 секунд с раками физиологического раствора.
- Используя пипетку, место некоторых солевых содержащие следующий соединения должны быть рассмотрены и разнообразной концентрации последнего испытания вещества непосредственно на задней кишки. Лучше всего начать с более низкой концентрации и способа работы своих более высоких концентрациях.
- Сразу после добавления каждого нового вещества или каждой новой концентрации, записывать число сокращений, которые происходят после тридцати секунд и обратите внимание на тип сокращений.
2.3.2) Запись сил сокращение вырезали подготовки
Рисунок 4: Настройка
- Прикрепите датчик с кожурой моста.
- Прикрепите к мосту стручок PowerLab 26Т.
- Прикрепить 26Т PowerLab к порту USB на компьютере.
- Открытое LabChart7, нажав на labchart7 значок на рабочем столе.
- Добро пожаловать LabChart окне появится Центр открыт. Закройте ее.
- Нажмите на установки
- Нажмите на настройки канала. Изменение числа каналов до 1 (нижней левой части окна) нажмите OK.
- В верхней левой части графика набора циклов в секунду до примерно 2к. Установить вольт (у-оси) до около 500 или 200 мВ.
- Нажмите на канал 1 на правом графике. Нажмите на вход усилителя. Убедитесь, что настройки: несимметричный, по переменному току, и инвертировать (инвертирует сигнал, если это необходимо), и сглаживание, проверяются.
- Для начала начать запись прессы.
- Возьмите подготовки и сократить желудочно-кишечного тракта на стыке между грудной клетки и живота. Затем аккуратно обвести часть тельсона хвоста. Удалить из желудочно-кишечного тракта расчлененный раков и поместить его в блюдо Sylgard. Существует кровеносный сосуд, который проходит вдоль спинной части желудочно-кишечного тракта. Осторожно вытащите этом от желудочно-кишечного тракта. Залить свежим солевым раков на подготовку.
- Место датчик силы в зажиме возле расчлененный раков.
- Хук датчик силы в раков Г. И., как показано на рисунке 5.
Рисунок 5: Изолированные кишке из раков в физиологическом растворе прилагается к крючку датчик силы - Подождите, пока И. начинает сокращаться, и нажимаем начать LabChart7.
- Позвольте программе запустить в течение примерно 20 секунд. Нажимаем "стоп", и добавить комментарий с пометкой "Соленая только". Заполните таблицу 4.
Таблица 4: Сокращения с соединением интересКоличество сокращений Амплитуду сокращений (мВ) - Добавить тест соединений, представляющих интерес, и сразу же нажать "Пуск" на LabChart7.
- Позвольте программе запустить в течение примерно 20 секунд. Нажмите «стоп» и добавить комментарий прямо на графике файл как к тому, что вещество было добавлено и его концентрации. Заполните таблицу ниже.
Таблица 5: Сокращения с _________ соединенияКоличество сокращений Амплитуду сокращений (мВ) - Смывать препарат с раками солевых с помощью пипетки.
- Добавить других веществ или различных концентрациях в подобной манере. Сразу нажать "Пуск" на LabChart7.
- Позвольте программе запустить в течение примерно 20 секунд. Нажимаем "стоп", и добавить комментарий и этикетки прямо на графике указывает файл сompound используются и концентрации.
3. Анализ данных
- Из 2.3.1 эксперимента, график число сокращений от каждого решения (солевые, серотонина, глутамата) в зависимости от времени. Объясните какие-либо тенденции.
- Из 2.3.2 эксперимента, график число сокращений от каждого решения (солевые, серотонина, глутамата) в зависимости от амплитуды сокращений в мВ. Объясните какие-либо тенденции.
3,1) Измерение скорости и силы сокращений
В начало темпы сокращения на может измерять время от начала одной отклонения в начале следующего или подсчитать общее отклонений за минуту или две. Значения могут быть помещены в условиях сокращений в минуту или секунду в зависимости от того, насколько быстрым они происходят.
В начало силу сокращения относительной мерой может быть использована для сравнения различных условиях. На сохраненный файл можно использовать маркер "М" и перейти к базовой линии. Затем с помощью курсора и перейти к пику отклонения и принять к сведению значение, указанное в правом верхнем углу экрана, как дельта (разница от М до пика). Обратите внимание на курсор должно быть сохранено для стационарной мерой изменения. Затем переместите М в следующий класс волна интереса и повторить измерения.
Discussion
Информацию, указанную в соответствующем фильме и текст описаны основные шаги, необходимые для записи активности в задней кишке из раков на месте, а также в лабораторных условиях. Одной из целей нашего доклада является повышение осведомленности о потенциале этого препарата в студенческие следственных лабораторий, которые преподают основные понятия в области физиологии и фармакологии.
Эти препараты могут быть использованы для исследования ряда экспериментальных вопросов, которые приведут к лучшему пониманию физиологических функций задней кишки. Механизмы, лежащие регулирования перистальтических волн и их обращение до сих пор не известно. Механизмы для высшего контроля над всей желудочно-кишечного тракта, также полностью не поняты. Вопрос о том, как высшие центры интегрировать свою деятельность с вегетативной вывод, который непосредственно управляет GI система остается открытой площадке исследования (Шуранова и соавт., 2006). Кроме того, осморегуляторной возможности ракообразных кишке и функции осморегуляции во время линьки и нагрузки на окружающую среду не были полностью выяснены. Есть еще много вопросов, ожидающих ответа в данном препарате.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддержке Университета Кентукки, биологический факультет, Управление бакалавриата и колледж искусств и наук.
Materials
|
References
- Alexandrowicz, J. S. Zur Kenntnis des sympathischen Nervensystems der Crustaceae. Jena Z. Naturw. 45, 395-444 (1909).
- Bungart, D., Dircksen, H., Keller, R. Quantitative determination and distribution of the myotropic neuropeptide orcokinin in the nervous system of astacidean crustaceans. Peptides. 15, 393-400 (1994).
- Dircksen, H., Burdzik, S., Sauter, A., Keller, R. Two orcokinins and the novel octapeptide orcomyotropin in the hindgut of the crayfish Orconectes limosus: identified myostimulatory neuropeptides originating totether in neurons of the terminal abdominal ganglion. J. Exp. Biol. 203, 2807-2818 (2000).
- Elekes, K., Florey, E., Cahil, M. A., Hoeger, U., Geffard, M. Morphology, synaptic connections and neurotransmitters of the efferent neurons of the crayfish hindgut. Neurobiology of Invertebrates. Salanki, J., Rosza, K. 36, Akademiai Kiado. Budapest. 129-146 (1988).
- Elofsson, R., Kauri, T., Nielsen, S. O., Stroemberg, J. O. Catecholamine-containing nerve fibres in the hindgut of the crayfish Astacus astacus L. Experentia. 24, 1159-1160 (1968).
- Florey, E. Uber die wirkung von acetylcholin, adrenalin, nor-adrenalin, faktor I und anderen substanzen auf den isolierten enddarm des flusskrebses Cambarus clarkii Girard. Z. Vergl. Physiol. 36, 1-8 (1954).
- Florey, E. A new test preparation for bio-assay of Factor I and gamma-aminobutyric acid. J. Physiol. 156, 1-7 (1961).
- Jones, H. C. The action of L-glutamic acid and of structurally related compounds on the hind gut of the crayfish. J. Physiol. (London). 164, 295-300 (1962).
- Knotz, S., Mercier, A. J. cAMP mediates dopamine-evoked hindgut contractions in the crayfish, Procambarus clarkii. Comp. Biochem. Physiol. 111A, 59-64 (1995).
- Kondoh, Y., Hisada, M. Neuroanatomy of the terminal (sixth abdominal) ganglion of the crayfish, Procambarus clarkii. Cell. Tiss. Res. 243, 273-288 (1986).
- Mercier, A. J., Lange, A. B., TeBrugge, V., Orchard, I. Evidence for proctolin-like and FMRFamide-like neuropeptides associated with the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii. Can. J. Zool. 75, 1208-1225 (1997).
- Mercier, A. J., Lee, J. Differential effects of neuropeptides on circular and longitudinal muscles of the crayfish hindgut. Peptides. 23, 1751-1757 (2002).
- Mercier, A. J., Orchard, I., Schmoeckel, A. Catecholaminergic neurons supplying the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii. Can. J. Zool. 69, 2778-2785 (1991).
- Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V. FMRFamide-like immunoreactivity in the crayfish nervous system. J. exp. Biol. 156, 519-538 (1991).
- Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V., Skerrett, M. Isolation of two FMRFamide-related peptides from crayfish pericardial organs. Peptides. 14, 137-143 (1993).
- Musolf, B. E. Serotonergic modulation of the crayfish hindgut: Effects on hindgut contractility and regulation of serotonin on hindgut. Biol Bull. , Georgia State University. (2007).
- Musolf, B. E., Spitzer, N., Antonsen, B. L., Edwards, D. H. Serotonergic modulation of crayfish hindgut. Biol Bull. 217(1), 50-64 (2009). Biol Bull. 217, 50-64 (2009).
- Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Cooper, R. L. A hundred years ago and now: A short essay on the study of the crustacean hindgut. (Vor hundert Jahren und nun: Eine kurze Geschichte von die Forschung des Hinterdarmes der Crustaceen. Crustaceana. 76, 755-670 (2003).
- Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Strawn, J. R., Cooper, R. L. Evidence for an Autonomic Nervous System in Decapod Crustaceans. International Journal of Zoological Research. 2 (3), 242-283 (2006).
- Siwicki, K. K., Bishop, C. A. Mapping of proctolinlike immunoreactivity in the nervsou systems of lobster and. 243, 435-435 (1986).
- Stemmler, E. A., Cashman, C. R., Messinger, D. I., Gardner, N. P., Dickinson, P. S., Christie, A. D. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Sandeman, D. C., Atwood, H. L. Control of mouthparts and gut. The Biology of Crustacea. 4, Academic Press Inc. London. 165-191 (1982).
- Webster, S. G., Dircksen, H., Chung, J. S. Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide. J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity. Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output. Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies. Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).
- Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut. J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).
