Summary
Bu yazıda, kerevit hindgut biyoloji araştırmak için kullanılan teknikler göstermektedir. Biz bir kerevit karın incelemek ve ilgili anatomi, fizyoloji ve faaliyet modülasyonu çalışma göstermektedir. Kasılmaların peristaltik aktivite ve gücünü bir kuvvet dönüştürücü kullanarak ölçülür.
Abstract
Raporun amacı, kerevit hindgut hazırlamak için diseksiyon teknikleri tarif ve kasılma gücünü izlemek için bir güç dönüştürücü ile fizyolojik kayıtları nasıl göstermek için. Buna ek olarak, çeşitli peptidler, biyojenik aminler ve nörotransmitterlerin için biyoassay olarak kullanılabilir peristaltik aktivite, görsel olarak nasıl izleneceğini gösteriyor. Bu preparat, fizyoloji ve farmakolojik kavramları öğrencilere göstermek için öğrenci laboratuarları için uygun. Bu preparat, 100 yıldır kullanılıyor olmuştur ve onu hala çok peristaltik ritimlerin oluşturma ve düzenleme araştırmak için ve onların modülasyon altında yatan mekanizmaları tanımlamak için bir model olarak sunar. Farmakolojik testlerin ve reseptör alt yazarak hindgut üzerinde 50 yıl önce başlandı bugün hala araştırmaya katkıda bulunmaktadır. Bu sağlam hazırlık fizyoloji ve farmakoloji eğitim öğrenciler için de uygundur.
Protocol
1. Giriş
Kerevit hindgut en son kapsamlı bir genel bakış serotonerjik modülasyon ve innervasyon (Musolf ve ark, 2009 öncelikle odaklı Dr. Barbara E. Musolf, (2007, Georgia State Üniversitesi, Atlanta, Georgia, ABD), bir tez uyulması .) Kabuklu hindguts ilk Alexandrowicz, karşılaştırmalı anatomi, onların innervasyon çeşitli yönlerini açıklanan öncü (Alexandrowicz 1909) 100 yıl önce incelendi. Araştırma, tüm hayvan ozmoregülasyon hindgut genel işlevi adresleme ve (bkz. gözden tarafından Musolf, 2007) çeşitli bileşikler tarafından hindgut kontraktilite modülatör kontrolü inceleyerek, kas tabakaları ve mimari türleri tanımlayarak, yıllar boyunca devam etti. Hindgut anal kısmı dışkı dışarı atmak için değil, aynı zamanda çevre için ozmoregülasyon su çekmek için sadece hareket ettiğini not etmek ilginçtir. Gut bu bölgede öne geçmesi ya da hayvanın ihtiyaçlarına bağlı olarak peristaltizm ters.
Alexandrowicz (1909), kabuklu hindgut, iç pleksus ve daha sonra belirlenmesi ve karakterize nörotransmitterlerin için zengin kaynaklar olduğunu kanıtladı bir dış pleksus, iki sinir innerve plexuses belirledi. 1950 Dr. Ernst Florey kerevit hindgut farmakolojik çalışmalar bir dizi başladı ve kasılmaları, asetilkolin ve ilgili bileşikler ve aynı zamanda epinefrin ve norepinefrin (Florey 1954) tarafından modüle olduğunu göstermiştir. Florey, kaşifi "olarak bilinen bir inhibitör madde Faktör-I", kerevit gastrointestinal sistem (Florey 1961) de dahil olmak üzere çeşitli hazırlıklar, bu maddenin etkilerini inceledi. Faktör-Daha sonra GABA olduğu gösterilmiştir. Böylece, kerevit hindgut sinaptik inhibisyonu ilk çalışmalarda önemli bir rol oynadı.
GABA keşfedilmesinden sonra, diğer olası vericileri hindgut plexuses ile ilişkili olduğu gösterildi ve fizyolojik tepkiler. Iki orcokinin peptidler (NFDEIDRSGFGFN ve AFDEIDRSGFGFN; Bungart ve arkadaşları 1994;. Dircksen ve ark 2000); (Mercier ve ark 1997 RYLPG-OH), proctolin Böyle vericileri dopamin (Elofsson ve ark 1968. Elekes ve ark 1988) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen ve ark, 2000) ve bir myosuppressin peptid (Mercier ve ark 1997;. pQDLDHVFLRFamide büyük olasılıkla, cf Stemmler ve ark 2007) . Bu maddelerin her biri, spontan hindgut kasılmaları modüle ve GABA dışındaki tüm eksitatör gibi görünüyor. Hindgut glutamat ve quisqualate (Jones, 1962; Yanlış ve ark 2003) cevap verir, ama glutamaterjik innervasyon için açık bir kanıt bildirilmemiştir. Çeşitli vericilerinin etkileri arabuluculuk intrasellüler haberciler büyük ölçüde keşfedilmemiş, fakat kasılmaları (Knotz & Mercier, 1995) artırmak için dopamin yeteneği cAMP katılımı için bir kanıt yoktur.
Kabuklu hindgut denervasyon sonrası kendiliğinden sözleşmeleri olmasına rağmen, bu tür kasılmalar genellikle zayıf ve düzensiz (Winlow & Laverack, 1972a Galler, 1982). Peristaltik hareket, görünüşte son karın ganglion (Winlow & Laverack, 1972a, b, c) menşeli, merkezi sinir sistemi koordine motor çıkışı gerektirir. Kerevit, motor çıkışı hücre gövdeleri son karın ganglion (Kondoh & Hisada, 1986) lokalize 75 aksonlar içeren 7. karın kök, hindgut yapılır. En azından bazı peptidlerin son karın ganglion (. Mercier et al 1991b; Dircksen ve ark 2000 Siwicki & Bishop, 1986) menşeli nöronlardan gelen hindgut pleksus temin edilecek görünür, ancak dopamin Daha fazla nöron tarafından sağlanan ön ganglionlar (Mercier ve ark. 1991a). 7. karın kök yoluyla motor çıkışı büyük, koordineli kasılmaları için gerekli olduğundan, yukarıda listelenen varsayılan vericileri bir kısmını veya tamamını peristaltizm bir şekilde katkıda bulunduğu muhtemeldir. Ancak, onların göreceli katkıları bilinmemektedir. Ayrı ayrı dairesel ve uzunlamasına kas (Mercier & Lee, 2002) üzerindeki etkilerini inceleyerek bazı bilgiler elde edilebilir.
Sindirilmemiş gıda hareketini kontrol etmeye ek olarak, kabuklu hindgut ile ilişkili sinir pleksus döküm ile ilgili önemli bir endokrin fonksiyonu oynamak için görünür. Hindgut Carcinus maenas, yengeç, su alımı bir rolü olduğunu düşündürür ve döküm ile ilişkili şişme, ecdysis (Webster ve ark 2000) sırasında kabuklu hiperglisemik hormon ve ilgili habercisi peptid serbest endokrin hücreler içerir. Böylece, kabuklu hindgut birçok önemli fizyolojik süreçleri dahildir.
Bu rapor, öncelikle gelişmiş yüksek okul ve deneylere katılan fizyoloji kursları lisans öğrencileri için bir eğitim aracıdır. Önemi yanı sıra, hindgut sözleşmeleri ve işlevleri öğrenciler tarafından nasıl ele alınabilir arkasında olası bir mekanizma. Farmakolojik ajanların, nörotransmitterlerin ve lobu olacak ve doz-yanıt eğrileri, fizyolojik ve farmakolojik veri almak ve nasıl yorumlamak için öğrencilerin meşgul olan, inşa edilecek. Reseptör fonksiyonu agonistleri ve antagonistleri ile ilgili genel bir anlayış da elde edilebilir. Öğrenciler ayrıca, istatistiksel analiz için grafik biçiminde verileri sunmak için öğreneceksiniz.
Kerevit hindgut kasılmaları incelemek ve kaydetmek için çok kolaydır. Disseke hazırlanmasında, bağırsak kolayca eksojen maddelere maruz kalmaktadır. Peristaltik aktivite değişiklik görsel veya bir kuvvet dönüştürücü, kasılmaların gücü de izleyebilirsiniz ile izlenebilir. Çünkü biyoassay hazırlık olarak, basitlik ve güvenilirlik, kerevit hindgut hala peristaltizm, motor çıkış ve kas kasılması modülasyonu ve reseptör fonksiyonu mekanizmaları hakkında pek çok araştırma soruları araştırmak için çok yararlıdır. Hindgut eylemleri belirli mekanizmaları test böcek, crustaceancides ve kirleticiler için de yararlıdır.
2. Yöntemleri
2.1) Malzeme
- kerevit
- kerevit salin
- diseksiyon aletleri (kaba ve ince makas, kaba ve ince forseps)
- Sylgard oturaklı Petri kabı
- çelik diseksiyon pimleri
- bardak (kimyasal solüsyonlar tutun)
- parafilm (çözümler kapsayan ve karıştırma için)
2.2) Diseksiyon
- Kerevit (Procambarus clarkii) vücut uzunluğu ölçme 6-10 cm diseksiyonu başlamadan önce hayvan uyutmak için 5 ila 10 dakika buz konulmalıdır.
- Anestezi kerevit pençeleri arkasından tek elle tutun. Çabuk, göz yuvası, her iki tarafta baş orta kesim, kerevit (Not: kan hazırlanması tamamlanmış zaman kurur, bu yüzden araçları yıkamak yapışkan olacaktır) ve sonra kafasını uçurma.
Şekil 1: kerevitler Decapitation - Chelipeds ve yürüme bacaklarını kesti.
- Sadece orta tailfin (uropod) bırakarak, sol ve sağ tailfins kesti.
- Kerevit dorsal tarafta dorsal manikür sağ ve sol tarafında ventral kesti.
Şekil 2: Dorsal Tırnak Kaldırma - , Kesim Sonra, dorsal karın manikür alt kısmında kaldırmak GI zarar görmesini önlemek için sığ olduğundan emin, manikür dorsal tarafında enine kesin.
- Disseke kerevit Sylgard astarlı çanak içine yerleştirin.
- Tailfin ucu çanak kerevit Pin. Bir vücudu basılı için gerekli olarak GI iki tarafında daha fazla pimleri kullanabilirsiniz.
- GI GI sürekli bir pipet kullanarak tuzlu su ile söndürmeye emin olun kapsayan kerevit salin ile çanak doldurun. 5.3 mM KCl; 13.5 mM CaCl 2 2H 2 O; 2.45 mM MgCl 2 6H 2 O; Tuzlu 205 mM NaCl ile yapılan modifiye Van Harreveld çözümü (1936), 5 mM Hepes ve pH 7.4 'e ayarlanır. Disseke kerevit Şekil 3'te gösterildiği gibi görünmelidir.
Şekil 3: bozulmamış GI Dissected kerevit.
2.3) Deneyler
Hayvan 2.3.1) Kasılmaları
- Banyo serum fizyolojik olarak hazır ve aynı sıcaklıkta test edilecek bileşik çözümler var. Üzerinde bireysel çözümler serotonin (100 nM 1microM), glutamat (1microM), ve test edilmesi için başlangıç maddeleri yapılan kerevit salin dopamin (1microM) kullanabilirsiniz.
- Diseksiyonu ve tuzlu maruz şok uyum sağlamak için, yaklaşık on dakika kerevit çözüm oturup disseke kerevit izin verin. Hindgut yavaş peristaltizm kasılmalar meydana başlamalıdır.
- Kasılmalar başlar sonra, otuz saniye (not: yani peristaltizm yazın veya spastik ve herhangi bir peristaltik dalgaların yönünü meydana kasılmaları türü) ortaya kasılmaları kaydeder.
Tablo 1: Kerevit Tuzlu KasılmalarıKasılmaların sayısı Kasılmaların Türü - Bir pipette, kerevit maruz karın boşluğu içinde tuzlu su çıkarmak, ve hindgut üzerine doğrudan incelenmek üzere madde içeren serum fizyolojik uygulamak.
- Çözüm ekleyerek hemen sonra, otuz saniye sonra ortaya çıkan kasılmaların sayısı kayıt ve türü (yani peristaltik, ya da spastik) meydana kasılmaları not edin.
Tablo 2: bileşiklere maruz KasılmalarıBileşik test Konsantrasyon Kasılmaların sayısı Kasılmaların Türü - Kayıt test maddesi yanıt hemen sonra, normal kerevit salin ile GI birkaç kez yıkayın. Her 30 saniye kerevit tuzlu su ile durulama sırasında hazırlanması, stand 5 dakika izin verin.
- Bir pipet kullanarak, incelenmiş ya da zengin bir son madde konsantrasyonu hindgut üzerine doğrudan test sonraki bileşik içeren bazı tuzlu su koyun. Bu düşük bir konsantrasyon ve yüksek konsantrasyonlarda iş yolu ile başlamak en iyisidir.
- Hemen her yeni bir madde ya da her yeni konsantrasyon ekledikten sonra, otuz saniye sonra ortaya çıkan kasılmaların sayısı kaydedebilir ve kasılmaların türüne dikkat edin.
2.3.2) eksize hazırlıkları daralma Kayıt kuvvetleri
Şekil 4: Kurulum
- Transdüser köprü bölmesine takın.
- PowerLab 26T köprü bölmesine takın.
- PowerLab 26T bilgisayar üzerindeki USB portuna takın.
- LabChart7, masaüstü labchart7 simgesini tıklayarak açın.
- LabChart Welcome Center kutusu açılır. Kapatın.
- Kur'a tıklayın
- Kanal ayarları tıklayın. Tamam'a basın 1 (kutunun sol alt) kanal numarasını değiştirin.
- Grafiğin sol üst 2k hakkında saniyede döngüleri ayarlayın. MV yaklaşık 500 veya 200 volt (y-ekseni) ayarlayın.
- Kanal 1 grafiğin sağ tıklayın. Giriş Amplifikatör tıklayın. Emin olun ayarları: ac birleştiğinde, tek uçlu ve invert (gerekirse sinyali ters çevirir) ve anti-alias, kontrol edilir.
- Kaydetmeye başlamak başlamak için.
- Pick up hazırlanması ve GI toraks ve karın arasındaki kavşakta yolu kesmek. Sonra dikkatlice telzon kuyruk kısmı çevresinde kesti. Disseke kerevit GI yolu kaldırın ve Sylgard çanağın içine yerleştirin. GI yolu dorsal boyunca uzanan bir kan damarı vardır. GI trakt dikkatlice uzakta bu çekin. Hazırlanması üzerine taze kerevit tuzlu su dökün.
- Disseke kerevit yakın kelepçe kuvvet dönüştürücü yerleştirin.
- Şekil 5 de gösterildiği gibi, kerevit GI kuvvet dönüştürücü asın.
Şekil 5: kuvvet dönüştürücü kanca takılı tuzlu kerevit İzole hindgut - LabChart7 başlayacak GI sözleşme başlayıncaya kadar bekleyin ve bas.
- Yaklaşık 20 saniye boyunca yürütülen program olsun. Push "sadece Salin", "dur" ve etiketli bir yorum ekle. Tablo 4 doldurun.
Tablo 4: bileşik faiz ile KasılmalarıKasılmaların sayısı Kasılmaları Genlik (mV) - Ilgi test bileşikleri ekleyin ve hemen LabChart7 "start" itin.
- Yaklaşık 20 saniye boyunca yürütülen program olsun. "Dur" itin ve grafik dosya eklendi ne madde ve konsantrasyonu olarak doğrudan bir yorum ekleyin. Aşağıdaki tabloyu doldurun.
Tablo 5: _________ bileşik KasılmalarıKasılmaların sayısı Kasılmaları Genlik (mV) - Hazırlık bir pipet kullanarak kerevit tuzlu su ile durulayın.
- Benzer şekilde diğer maddeler veya çeşitli konsantrasyonlarda ekleyin. Hemen LabChart7 "start" itin.
- Yaklaşık 20 saniye boyunca yürütülen program olsun. Push "stop" ve c gösteren grafik dosya üzerinde doğrudan bir yorum ve etiket eklemekve konsantrasyon ompound.
3. Veri Analizi
- Deney, grafik her solüsyonu (serum fizyolojik, serotonin, glutamat) vs zaman kasılmaları 2.3.1. Herhangi bir eğilimleri açıklayın.
- Deney, her çözüm kasılmaları sayısı grafiği (tuzlu, serotonin, glutamat) vs mV kasılmaları genliği 2.3.2. Herhangi bir eğilimleri açıklayın.
3.1) Ölçme kasılmaların hızı ve kuvvet
Endeksine başından itibaren bir sapma oranları üzerinde kasılmaları sonraki başında zamanı ölçmek veya bir ya da iki dakika içinde toplam deplasmanlar saymak. Değerleri yaşanıyor nasıl hızlı bağlı olarak, dakika ve saniye başına kasılmaları açısından konabilir.
Kasılmaların gücü endeksine göreceli bir ölçü farklı koşullar karşılaştırmak için kullanılan olabilir. Kaydedilen dosya üzerinde bir marker "M" ve başlangıçtaki hareket. Sonra imleci kullanmak ve hareket sapma zirve ve ekranın sağ üst köşesinde bir delta değeri (M tepe farkı) olarak listelenen değeri not alın. Imleç değişim ölçmek için sabit tutulması gerekir. Ardından bir sonraki faiz dalga formu için M taşımak ve ölçü tekrarlayın.
Discussion
Ilgili film ve metin in vitro ve in situ yanı sıra kerevit hindgut aktivite kayıt için gerekli temel adımları açıklar . Bir raporun amacı, fizyoloji ve farmakoloji temel kavramları öğretmek soruşturma laboratuvarları öğrenci çalıştırmak bu hazırlık potansiyeli bilincini artırmak.
Bu hazırlıklar hindgut fizyolojik fonksiyonları daha iyi anlaşılmasına yol açacak bir dizi deney soruları araştırmak için kullanılabilir. Peristaltik dalgalar ve onların ters düzenlenmesi altta yatan mekanizmaları hala bilinmemektedir. Tüm gastrointestinal sistem daha yüksek kontrol mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değildir. GI sistemi doğrudan kontrol eden otonom çıkışı ile yüksek merkezleri faaliyetlerini nasıl entegre soru açık bir araştırma alanı (Shuranova ve ark, 2006) kalır. Buna ek olarak, kabuklu hindgut ve döküm ve çevresel stres sırasında ozmoregülasyon fonksiyonları osmoregulatory yetenekleri tam olarak aydınlatılamamıştır edilmemiştir. Bu hazırlık cevap bekleyen birçok soru hala vardır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Kentucky Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Lisans ve College of Arts & Sciences Ofisi tarafından desteklenir.
Materials
|
References
- Alexandrowicz, J. S. Zur Kenntnis des sympathischen Nervensystems der Crustaceae. Jena Z. Naturw. 45, 395-444 (1909).
- Bungart, D., Dircksen, H., Keller, R. Quantitative determination and distribution of the myotropic neuropeptide orcokinin in the nervous system of astacidean crustaceans. Peptides. 15, 393-400 (1994).
- Dircksen, H., Burdzik, S., Sauter, A., Keller, R. Two orcokinins and the novel octapeptide orcomyotropin in the hindgut of the crayfish Orconectes limosus: identified myostimulatory neuropeptides originating totether in neurons of the terminal abdominal ganglion. J. Exp. Biol. 203, 2807-2818 (2000).
- Elekes, K., Florey, E., Cahil, M. A., Hoeger, U., Geffard, M. Morphology, synaptic connections and neurotransmitters of the efferent neurons of the crayfish hindgut. Neurobiology of Invertebrates. Salanki, J., Rosza, K. 36, Akademiai Kiado. Budapest. 129-146 (1988).
- Elofsson, R., Kauri, T., Nielsen, S. O., Stroemberg, J. O. Catecholamine-containing nerve fibres in the hindgut of the crayfish Astacus astacus L. Experentia. 24, 1159-1160 (1968).
- Florey, E. Uber die wirkung von acetylcholin, adrenalin, nor-adrenalin, faktor I und anderen substanzen auf den isolierten enddarm des flusskrebses Cambarus clarkii Girard. Z. Vergl. Physiol. 36, 1-8 (1954).
- Florey, E. A new test preparation for bio-assay of Factor I and gamma-aminobutyric acid. J. Physiol. 156, 1-7 (1961).
- Jones, H. C. The action of L-glutamic acid and of structurally related compounds on the hind gut of the crayfish. J. Physiol. (London). 164, 295-300 (1962).
- Knotz, S., Mercier, A. J. cAMP mediates dopamine-evoked hindgut contractions in the crayfish, Procambarus clarkii. Comp. Biochem. Physiol. 111A, 59-64 (1995).
- Kondoh, Y., Hisada, M. Neuroanatomy of the terminal (sixth abdominal) ganglion of the crayfish, Procambarus clarkii. Cell. Tiss. Res. 243, 273-288 (1986).
- Mercier, A. J., Lange, A. B., TeBrugge, V., Orchard, I. Evidence for proctolin-like and FMRFamide-like neuropeptides associated with the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii. Can. J. Zool. 75, 1208-1225 (1997).
- Mercier, A. J., Lee, J. Differential effects of neuropeptides on circular and longitudinal muscles of the crayfish hindgut. Peptides. 23, 1751-1757 (2002).
- Mercier, A. J., Orchard, I., Schmoeckel, A. Catecholaminergic neurons supplying the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii. Can. J. Zool. 69, 2778-2785 (1991).
- Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V. FMRFamide-like immunoreactivity in the crayfish nervous system. J. exp. Biol. 156, 519-538 (1991).
- Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V., Skerrett, M. Isolation of two FMRFamide-related peptides from crayfish pericardial organs. Peptides. 14, 137-143 (1993).
- Musolf, B. E. Serotonergic modulation of the crayfish hindgut: Effects on hindgut contractility and regulation of serotonin on hindgut. Biol Bull. , Georgia State University. (2007).
- Musolf, B. E., Spitzer, N., Antonsen, B. L., Edwards, D. H. Serotonergic modulation of crayfish hindgut. Biol Bull. 217(1), 50-64 (2009). Biol Bull. 217, 50-64 (2009).
- Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Cooper, R. L. A hundred years ago and now: A short essay on the study of the crustacean hindgut. (Vor hundert Jahren und nun: Eine kurze Geschichte von die Forschung des Hinterdarmes der Crustaceen. Crustaceana. 76, 755-670 (2003).
- Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Strawn, J. R., Cooper, R. L. Evidence for an Autonomic Nervous System in Decapod Crustaceans. International Journal of Zoological Research. 2 (3), 242-283 (2006).
- Siwicki, K. K., Bishop, C. A. Mapping of proctolinlike immunoreactivity in the nervsou systems of lobster and. 243, 435-435 (1986).
- Stemmler, E. A., Cashman, C. R., Messinger, D. I., Gardner, N. P., Dickinson, P. S., Christie, A. D. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Sandeman, D. C., Atwood, H. L. Control of mouthparts and gut. The Biology of Crustacea. 4, Academic Press Inc. London. 165-191 (1982).
- Webster, S. G., Dircksen, H., Chung, J. S. Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide. J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity. Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output. Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies. Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).
- Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut. J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).
