Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Summary

Basma, bitki ve memeli üreme bir olgudur. DNA metilasyon, imprinting mekanizmaları önemli bir rol oynar. Endosperm Yalıtımlı ve baskılı genlerinin metilasyon durumunun belirlenmesinde

Abstract

Arabidopsis thaliana epigenetik mekanizmalar çalışmak için mükemmel bir model organizmadır. Nedenlerinden biri DNA methyltransferases kaybı fonksiyon-boş mutant böylece bir genom DNA metilasyon kaybı, büyüme ve gelişme nasıl etkilediğini incelemek için bir sistem sağlayarak, yaşayabilir. Basma maternal ve paternal allellerin diferansiyel ifadesi anlamına gelir ve hem de memeli hayvan ve bitkilerin üreme gelişmesinde önemli bir rol oynar. DNA metilasyon baskılı bir gen anne veya baba allel ifade ya da susturulmuş olup olmadığını belirlemek için kritik öneme sahiptir. Çiçekli bitkiler, bir çift üreme döllenme olayı var: tek bir sperm hücresi yumurta hücresi embriyo ve endosperm yol vermek için merkezi bir hücre ile ikinci bir sperm sigortalar oluşturmak için döller. Endospermi imprinting, bitkilerde meydana gelen bir dokudur. MEDEA, bir SET etki Polycomb grup gen, FWA, çiçekli düzenleyen bir transkripsiyon faktörü, endosperm ve kendi ifade baskılı gösterilen ilk iki gen, DNA metilasyon ve demetilasyon tarafından kontrol edilir bitkiler. Bir gen ve endosperm metilasyon paterni imprinting durumunu belirlemek amacıyla, ilk endosperm izole etmek gerekir. Tohum Arabidopsis ufak olduğundan, Arabidopsis endosperm izole ve metilasyon incelemek için zorlu kalır. Bu video protokolde, tohumları endosperm doku izole etmek için, genetik bir çapraz yapmak ve bisülfit sıralama metilasyon durumunu belirlemek için nasıl rapor.

Protocol

I. Genetik Crossing

1. Kadın ebeveyn Emasculating

DNA dizisi polimorfizm, iki farklı ekotipler, örneğin Columbia-0 (Col-0) ve Ler, kadın ve erkek ebeveynler olarak seçilecektir ile anne ve baba allel ayırmak için. Bitkiler genç ve sağlıklı olmalıdır. Bir büyüteç visor, ya da çıplak gözle, bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak dişi ebeveyn hadım. Evre-12 çiçek bulun (Smyth ve ark, 1990) ve makas ile sapçık temel kırpma herhangi bir çiçek veya siliques yukarıda ve aşağıda onları çıkarın . Forseps% 95 etanol forseps üzerinde herhangi bir polen taneleri kaldırmak ve aynı zamanda polen öldürecek bir beher, içine hafifçe ucunun taban batırarak sterilize edin. Yavaşça forseps kullanarak çiçek tomurcukları dışında gözetlemek ve yavaşça dişilik organı çıplak ve zedelemeden, 4 sepals, 4 yaprakları, 6 organlarındaki kaldırmak. Bu işlem sırasında carpels zarar görmesini önlemek için deneyin.

2. Polen donör Toplama ve tozlaşma yürüten

Iyi polen donörlerin polen bir çok dökülme olduğu dişilik organı (Smyth ve ark, 1990), 90 ° açıyla uzanan yaprakları ile 14 sahne açık çiçek anthesed. Üssünde çiçek alın ve sapçık hemen üstünde, çiçek açık yayılmasına sebep olacaktır. Anter ile hazırlanan dişilik organı stigma Toz. Tozlaşma sonra, bir mikroskop altında kolayca görülebilir sarı polen, damgalanma ile kaplı olacaktır.

3. Çapraz Etiketleme

Bir bitkinin tüm hadım pistils pollinating sonra, biz bir mücevher etiketi ve dişi ve erkek ebeveynler ve güncel bilgi ile çapraz etiket. Toprak bitki yakın bir hissesi yerleştirin, bir dize, kazığa gelişme kök bağlamak için kullanın ve plastik bir çanta ile tozlaşma pistils kapağı.

II. Arabidopsis endosperm Dokular izolasyonu

1. Hazırlanması malzemeleri

: Biz genellikle bir sıvı nitrojen tankı, sıvı azot, bir diseksiyon mikroskobu ucu ince forseps (Dumont biyoloji tarafından 5 INOX FST, İsviçre), mikroskop cam slaytlar iki yeni çift (endosperm ve embriyo dokuları hasat öncesi gerekli malzemeler hazır 3 "X 1" X 1.0 mm), sorbitol 0.3 M pH 5.7 çözümü ve 5 mM (MES).

2. Toplama siliques

7 - veya 8-gün sonra-tozlaşma (DAP), tohum, orta ve geç torpido sahne embriyogenez hasat ve endosperm ve embriyo için disseke hazırız. Bazen hadım çiçekler çok genç, 9-10 DAP sürebilir.

3. Yalıtımlı endosperm ve embriyo

Arabidopsis tohumu küçük olduğundan, endosperm ve embriyo izole etmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. 8-DAP silique bir mikroskop altında bir koyun, silique sapçık tutmak için forseps, bir çift ve iki carpels sigorta marjı açık silique slayt forseps başka bir çift ucu kullanın. PH 5.7 sorbitol 0.3 M ve 5 mM MES çözümler üzerine bir tohum almak için forseps bir çift kullanın, embriyo slayt micropyle sonunda küçük bir kesim yapmak, endosperm ve tohum kabuğu ayrı endosperm dışarı itmek için kesilmemiş sonuna sıkmak (Kinoshita ve ark, 2004). Embriyo ve endosperm sıvı nitrojen içinde ayrı mikrotüpler içine koyun. 10-15 siliques embriyo ya da endosperm birikir kadar bu devam edin ve sonra tüp -80 ° C derin dondurucuda saklayın. Bazı durumlarda, endosperm, tohum kabuğu, yani ayrılmış olması değil, tek bir gen imprinting analizi için endosperm ve tohum kabuğu karışımı total RNA izole.

III. Bisülfit Sıralama

1. Gerekli reaktifleri

Genomik DNA, restriksiyon enzimleri, 3 M NaOH (Taze yapılmış), 6,42 M üre / 4 M sodyum bisülfit (190 2 M sodyum metabisülfit, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Moleküler Ağırlık) hazırlamak için Cetyltrimethyl amonyum bromür (STAB) 10 mM hidrokinon, bir DNA temizleme kiti (Promega Sihirbazı DNA Temizlik Sistemi, Kedi # A7280), TE tampon, 6.3 M NaOH (taze yapılmış), 10 M NH ₄ oac, 20 mikrogram / ​​mcL tRNA ve% 100 etanol .

2. Bisülfit tedavi protokolü Detayları

1. Genomik endosperm veya CTAB yordamı kullanarak embriyonun DNA (Rogers ve Bendich, 1988) kesin.
2. Digest 100 ng - 20 mcL 100 mcL toplam hacmi analiz edilecek bölge dışından kesen restriksiyon enzimleri ile genomik DNA 2 mg. MEA organizatörü için, biz XhoI, NdeI ve PstI veya HindIII kullanın.
3. DNA beş dakika kaynatarak restriksiyon enzimlerinin denatüre ve ardından buz üzerinde gidermek.
4. 15 dakika boyunca 37 1 / 9, 3 M NaOH ve inkübe hacmi (20 mcL sindirilir DNA 2.2 mcL) ° C ekleyin.
5. 250 mcL PCR tüp çözüm aktarın.
6. 10 ml steril distile su, 7.5 g üre çözülür; yavaş yavaş ekleyin ve 1-2 saat içinde 7.6 g sodyum metabisülfit ısıtma genellikle erime yardımcı olur; pH 5 ile 10 M NaOH taze yapılmış ayarlayın; bir final steril distile su ekleyin 20 ml hacim. Bu 6.24 M üre / 4 M sodyum bisülfit çözüm.
7. Sırasıyla 6.24 M üre son konsantrasyonu 5.36 M / 4 M sodyum bisülfit çözüm ve 3.44 M (Paulin ve ark, 1998). Örneğin, 6,42 M üre / denatüre genomik DNA (Xiao ve ark, 2003) Yukarıdaki 22.2 mcL 4 M sodyum bisülfit çözümü 208 mcL ekleyin.
8. 0.5 mM (20 mcL sindirim için 12 mcL) son bir konsantrasyonda DNA 10 mM hidrokinon ekleyin.
9. 55 ° C de 15 dakika ve 95 ° C 'de 30 saniye için 30 kür: PCR makinesi bisülfit tedavi yapılması
10. Promega Wizard DNA Temizlik-Up Sistemi kullanılarak bisülfit tedavi DNA Desalt ve protokolü takip (Jacobsen ve ark, 2000).
11. TE tuzsuzlaştırma sonra sütun kurtarıldı tam hacmi ölçün ve 37 0.3 M. inkübe son konsantrasyonu 6.3 M NaOH eklemek ° C 15 dakika boyunca.
12. 3 M nihai bir konsantrasyon, 2 mcL 20 mikrogram / ​​mcL tRNA ve 3 hacim% 100 etanol ile 10 M NH ₄ oac (pH 7.0) ekleyin ve karıştırın. 14.000 rpm'de 15 dakika santrifüj.
13. Bir kez,% 70 etanol ile pelet yıkayın kısa bir santrifüj yapmak ve ekstra etanol çıkarın.
14. 5-10 dakika ve 25 tekrar süspansiyon için speedvac Kuru pelet - DNA miktarı başlangıç ​​bağlı olarak 100 mcL TE tampon. Sodyum bisülfit ile tedavi edilen DNA PCR analizi için hazırdır.

3. PCR

1. Unmethylated cytosines urasil dönüştürülmüş olduğundan, bu büyük bir parçası, bir şablon olarak bisülfit ile tedavi edilen DNA kullanarak yükseltmek için zordur. Böylece, genellikle bir ürün artık 500 bp daha yükseltmek için primerler dizayn. 4-kb MEA organizatörü dizisi için astar birçok setleri tasarlanmış ve tüm bölgeyi kapsayacak şekilde 14 örtüşen parçaları amplifiye (Xiao ve ark, 2003).
2. Üst iplikçik dizisi için ileriye astar, I) tasarımında primerleri ekstra uzun nükleotidler olmadan daha yüksek bir tavlama sıcaklığı için G (guanin) açısından zengin bir bölge seçin; II) değişiklik C (Sitozin) Y ( CG ve CNG bağlamlarda pirimidin) ve T (Timin) kalan C değiştirin. Ters astar, I) tasarımı C-zengin bir bölge seçin; II), CG ve CNG bağlamlarda R (pürin) G değiştirmek ve kalan G A (adenin) değiştirin.
3. CG ve CNG bağlamlarda R G değişikliği ve seçim ters astar, I) tasarımı A. kalan G değiştirmek II); alt sırasına iplikli, ileriye astar, I) tasarımı C-zengin bir bölge seçin G-zengin bir bölge; II) Y (pirimidin), CG ve CNG bağlamlarda C değiştirmek ve T. kalan C değiştirmek
4. Biz genellikle her PCR (Xiao ve ark, 2003) için bir şablon olarak sodyum bisülfit ile tedavi edilen DNA 1-2 mcL kullanın. PCR ürünü Parçanın doğru boyutu onaylamak için sonra bir ekleme olarak jel saflaştırılmış ve TOPO TA klonlama vektörü pCR2.1 (Invitrogen) klonlanmış olması, jel elektroforezi ile analiz edilmesi gerekiyor. Tek bir koloni aldım ve kültür; plazmid DNA ayıklanır ve sıralama için gönderilir.

4. Sekans analizi

Bisülfit sıralama ilkesi unmethylated sitozin PCR ürünü timin olarak yükseltilecek pH5.0 yüksek konsantrasyonda sodyum bisülfit hidrolitik deaminasyon nedeniyle urasil dönüştürülür olacak, 5-metil sitozin sodyum bisülfit tarafından güncellenmiştir izin vermeyecek ve PCR (. Frommer ve ark, 1992. Clark ve ark, 1994) sonra sitozin kalır. Sıralama sonucu elde ettikten sonra, PCR için kullanılan iplikçik belirli bir şablon ile karşılaştırın. Şablonu bir sıralama sonucu bir timin sitozin kalıntı olarak okursa, sitozin metil olmadığını gösterir. Şablonda bir sitozin kalıntı sıralama bir sitozin kalırsa, sitozin metil olduğu anlamına gelir.

IV. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1.

Discussion

Embriyo, endosperm ve tohum kabuğu ayırmak için nispeten kolaydır, ancak embriyogenez erken veya orta-torpido aşamada özellikle tohum tohum kabuğu, endosperm ayrı sıkıcı. Tohum kabuğu, sadece bazı genler için çok küçük bir miktar doku katkıda bulunmasından dolayı, örneğin, MEA ve FWA, endosperm, tohum kabuğu ayırmak zorunda değilsiniz. Endosperm ve tohum kat dokularda oluşan bir karışım RNA'lar tecrit anlamına gelir ki, bir genin anne ve baba allel ifade, embriyo ifade ile karşılaştırın ve genin imprinting durumunu belirlemek.

Bisülfit sıralama için tasarlanmış primerler iplikçik özgü olması gerekir. Bazen, bisülfit, sodyum bisülfit tedavi ile hasarlı DNA'nın şablonu nedeniyle tedavi edilen genomik DNA parçası yükseltmek için zordur, ve genellikle, farklı bölgelerde ve kısa parçaları PCR primerleri farklı ayarlar deneyin. Restriksiyon enzimi sindirim sonra, genomik DNA bisülfit deaminasyon neredeyse çift iplikli DNA yapıları sitozin kalıntılarının üzerinde çalışmaz beri tek iplikli içine tamamen denatüre olması gerekiyor. Bir diğer önemli bisülfit tedavi tamamlandıktan gerektiğini. Bilinen bir unmethylated bisülfit sıralama timin sitozin dönüştürülür değilse, bisülfit tedavisi düzgün yapılmayan olduğunu gösterir. Bilinmeyen bir bölgede birçok bisülfit sıralama timin sitozin kalıntılarının değişmez Alternatif olarak, eğer o bölgedeki tüm metil sitozin kalıntılarının göstergesi daha en dönüştürülmemiş DNA amplifikasyonu nedeniyle büyük olasılıkla daha çok.

Deney doğru yapılır Sodyum bisülfit sıralama tam bir genomun belirli bir sitozin kalıntı metil olup olmadığını ortaya çıkarabilir (Henderson ve ark, 2010). Hsieh ve ark; Illumina Genom Analyzer yüksek verim sıralama platformu gibi yeni yüksek verimli sıralama teknikleri, sıralama sodyum bisülfit birleştiren, bir, bitkiler ve memeliler tek-baz çözünürlük (Cokus ve ark, 2008 Epigenom eşleyebilirsiniz 2009; Lister ve ark, 2008; Lister ve ark, 2009).

Materials

Supplies Dissecting Microscope Scissors Fine Tip Forceps Jewelry Tag Plant Stakes String or Twist-Ties 4" X 2" X 8" Polyethylene Bags 3" X 1" X 1.0 mm Microscope Slides Liquid Nitrogen Liquid Nitrogen Containers Heat Block PCR Tubes Thermocycler Microcentrifuge Tubes Microcentrifuge Gel Electrophoresis facility Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants Reagents 70% Ethanol 95% Ethanol 100% Ethanol 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7 Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) 100% Ethanol Cholorform Restriction Enzymes 3 M NaOH 6.3 M NaOH 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite Sterile distilled H2O 10 mM Hydroquinone Wizard DNA Clean-Up System (Promega) 10 M NH4OAc 20 μg/ μL tRNA TE buffer The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)