Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

Summary

Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen in

Abstract

Arabidopsis thaliana is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van epigenetische mechanismen. Een van de redenen is het verlies-van-functie null mutant van DNA-methyl-levensvatbaar is, en zo een systeem om te bestuderen hoe het verlies van DNA-methylatie in een genoom van invloed op de groei en ontwikkeling. Imprinting verwijst naar de differentiële expressie van de moederlijke en vaderlijke allelen en speelt een belangrijke rol bij de voortplanting ontwikkeling in zowel zoogdieren en planten. DNA-methylatie is van cruciaal belang voor het bepalen van de vraag of de moeders-of vaderskant allelen van een gen ingeprent is uitgedrukt of het zwijgen opgelegd. In bloeiende planten, is er een dubbele bevruchting gebeurtenis in de voortplanting: een zaadcel bevrucht de eicel naar embryo en een tweede zaadcel zekeringen formulier met de centrale cel aanleiding kan geven tot endosperm. Endosperm is het weefsel waar de inprenting voorkomt in planten. MEDEA, een SET-domeinnaam Polycomb groep gen, en FWA, een transcriptiefactor regulerende bloei, zijn de eerste twee genen aangetoond dat bedrukt in endosperm en hun expressie wordt gecontroleerd door DNA-methylering en demethylering in planten. Met het oog op imprinting status van een gen en methylatie patroon in endosperm te bepalen, moeten we in staat zijn om eerst te isoleren endosperm. Omdat zaad is klein in Arabidopsis, blijft het een uitdaging om Arabidopsis endosperm isoleren en de methylatie te onderzoeken. In deze video protocol, rapporteren we hoe een genetische kruis te voeren, om endosperm weefsel te isoleren uit zaden, en naar de methylatiestatus bepalen bisulfiet sequencing.

Protocol

I. Genetische Crossing

1. Emasculating de vrouwelijke ouder

Met het oog op de moederlijke en vaderlijke allelen onderscheiden door gebruik te maken DNA-sequentie polymorfisme, twee verschillende ecotypes, bijvoorbeeld Columbia-0 (Col-0) en Ler, zal worden gekozen als vrouwelijke en mannelijke ouders. De planten moeten jong en gezond. Men kan ontmannen de vrouwelijke ouder met behulp van een dissectiemicroscoop, vergrootglas vizier, of blote oog. Zoek stage-12 bloemen (Smyth et al.., 1990) en verwijder alle bloemen of siliques boven en onder hen door het knippen van de basis van hoogte van de taille met de schaar. Steriliseren tang door dompelen de basis van de punt voorzichtig in een bekerglas van 95% ethanol, die elke stuifmeelkorrels zullen verwijderen op de tang en dood de pollen ook. Voorzichtig los te wrikken uit elkaar de bloemknoppen met behulp van pincet en verwijder voorzichtig 4 kelkbladen, 4 kroonbladen, en 6 meeldraden, waardoor de stamper kaal en intact. Probeer om schade aan de vruchtbladeren voorkomen dat tijdens dit proces.

2. Het kiezen van de pollen donor en het uitvoeren van bestuiving

De beste pollen donors zijn anthesed open bloemen op het podium 14 met de bloemblaadjes te breiden in een hoek van 90 ° naar de stamper (Smyth et al.., 1990), waarin een veel stuifmeel is afwerpen. Pak de bloem aan de basis en net boven de taille, die zal leiden tot de bloem te verspreiden openen. Stof het stigma van de bereide stamper met de helmknop. Na de bestuiving, zal het stigma worden gedekt met de gele pollen, die gemakkelijk kan worden waargenomen onder een microscoop.

3. Etikettering van het kruis

Na bestuiving van alle ontkracht stampers op een plant, we het etiket van het kruis met een sieraden-tag en de informatie van de vrouwelijke en mannelijke ouders en datum. Plaats een belang in de bodem dicht bij de plant, gebruik dan een string om de steel van de bloeiwijze koppelen aan de brandstapel, en de dekking van de bestoven stampers met een plastic zak.

II. Isolatie van endosperm weefsels in Arabidopsis

1. Voorbereiden van materialen

We krijgen meestal benodigde materialen klaar voor de oogst, het endosperm en embryo weefsels: een vloeibare stikstof tank, vloeibare stikstof, een dissectiemicroscoop, twee nieuwe paren van fijn-tip pincet (5 INOX FST door Dumont biologie, Zwitserland.), Microscoop objectglaasjes ( 3 "X een" X 1,0 mm), een pH 5,7 oplossing van 0.3 M sorbitol en 5 mM MES.

2. Verzamelen siliques

Op 7 - of 8-dag-na-bestuiving (DAP), de zaden zijn klaar om te worden geoogst in het midden van de jaren torpedo stadium van de embryogenese en ontleed voor endosperm en embryo. Soms kan het nemen 90-10 DAP als de ontkracht bloemen zijn te jong.

3. Isoleren endosperm en embryo

Omdat Arabidopsis zaden zijn klein, gebruiken we een dissectiemicroscoop om endosperm en embryo te isoleren. Zet een 8-DAP silique onder een microscoop, gebruik een pincet om de silique steeltje vast te houden en gebruik maken van de tip van een ander paar pincetten het openen van de schuif silique in de marge waar twee omwindselblaadjes zekering. Gebruik een tang op te halen een zaad op pH 5,7 oplossingen van 0.3 M sorbitol en 5 mM MES, maak een kleine snee aan het micropyle einde te glijden uit embryo, knijp de uncut einde te duwen uit endosperm en apart endosperm uit zaad jas (Kinoshita et al., 2004).. Zet het embryo en endosperm in afzonderlijke microbuisjes in vloeibare stikstof. Ga door met dit totdat we verzamelen embryo of endosperm 10-15 siliques en vervolgens de buis te slaan in een -80 ° C vriezer. In sommige gevallen, het endosperm niet hoeft te worden gescheiden van zaadhuid, dat wil zeggen, kan een isolaat totaal RNA van het endosperm en de zaadhuid mengsel voor gen-imprinting analyse.

III. Bisulfiet Sequencing

1. Vereiste reagentia

Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) voor het bereiden van genomisch DNA, restrictie-enzymen, 3 M NaOH (vers gemaakt), 6,42 M ureum / 4 M natriumbisulfiet (2 M natriummetabisulfiet, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Moleculair Gewicht: 190), 10 mM hydrochinon, een DNA-zuivering kit (Promega Wizard DNA Clean-up systeem, Cat. # A7280), TE-buffer, 6,3 M NaOH (vers gemaakt), 10 M NH ₄ OAc, 20 ug / ul tRNA, en 100% ethanol .

2. Details van de bisulfiet behandelprotocol

1. Isoleren genomische endosperm of embryo DNA met behulp van een CTAB procedure (Rogers en Bendich, 1988).
2. Digest 100 ng - 2 pg van genomisch DNA in 20 ui tot 100 pi het totale volume met restrictie-enzymen die dwars buiten de regio te analyseren. Voor de MEA-promotor, gebruiken we Xhol, Ndel en Pstl of HindIII.
3. Denatureren de restrictie-enzymen door het koken van het DNA voor vijf minuten en daarna lessen op ijs.
4. Voeg 1 / 9 volume (2,2 ul voor 20 pi verteerd DNA) van 3 M NaOH en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
5. Breng de oplossing voor een 250 pi PCR-buis.
6. Los 7,5 g ureum in 10 ml steriel gedistilleerd water; Langzaam 7,6 g natrium metabisulfite toevoegen periode van 1-2 uur en de verwarming meestal helpt op te lossen; Stel de pH-waarde tot en met 5 vers gemaakte 10 M NaOH; Voeg steriel gedestilleerd water tot een uiteindelijke volume op 20 ml. Dit is 6,24 M ureum / 4 M natriumbisulfiet-oplossing.
7. Voeg 6,24 M ureum / 4 M natriumbisulfiet-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 5,36 M en 3,44 M, respectievelijk (Paulin et al.., 1998). Voeg bijvoorbeeld 208 ul van 6,42 M ureum / 4 M natriumbisulfiet oplossing voor het bovenstaande 22,2 ul van gedenatureerd genomisch DNA (Xiao et al.., 2003).
8. Voeg 10 mM hydrochinon aan het DNA in een uiteindelijke concentratie van 0,5 mM (12 pL voor 20 pi spijsvertering).
9. Gedrag bisulfiet behandeling in een PCR-machine: 30 cycli van 55 ° C gedurende 15 minuten en 95 ° C gedurende 30 seconden.
10. Ontzouten van de bisulfiet behandeld DNA met behulp van de Wizard DNA Clean-Up System van Promega en follow-up van de protocol (Jacobsen et al.., 2000).
11. Meet de exacte omvang van TE verhaald op de kolom na ontzouten en voeg 6,3 M NaOH tot een uiteindelijke concentratie van 0,3 M. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
12. Voeg 10 M NH ₄ OAc (pH 7,0) tot een uiteindelijke concentratie van 3 M, 2 pi van 20 ug / ul tRNA, en de drie volumes van 100% ethanol en vervolgens mixen. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 rpm.
13. Zodra Was de pellet met 70% ethanol, doe een korte centrifuge, en verwijder extra ethanol.
14. Droge pellet in een speedvac 5-10 minuten en resuspendeer in 25 tot 100 pi TE-buffer, afhankelijk van basisbedrag van DNA. De natriumbisulfiet behandelde DNA is nu klaar voor PCR analyse.

3. PCR-amplificatie

1. Aangezien de niet-gemethyleerd cytosines worden omgezet in uracil, is het moeilijk te versterken een groot fragment met behulp van de bisulfiet behandelde DNA als een template. Zo, we meestal ontwerpen primers om een ​​product te versterken niet langer dan 500 bp. Om de sequentie van de 4-kb MEA promotor, hebben we veel sets van primers en versterkt 14 overlappende fragmenten van de hele regio te dekken (Xiao et al.., 2003).
2. Naar volgorde van de top-streng, kies in het ontwerpen van een voorwaartse primer, I) een G (guanine)-rijke regio met het oog op een hogere uitgloeitemperatuur hebben zonder extra lange nucleotiden in de primer worden gebruikt; II) te wijzigen C (cytosine) naar Y ( pyrimidine) op CG-en CNG contexten en veranderen van de resterende C tot T (thymine). Bij het ontwerpen van een reverse primer, I) kiezen voor een C-rijk gebied; II) G verandering in R (purine) op CG-en CNG contexten en veranderen van de resterende G naar A (adenine).
3. Om de sequentie van het bottom-streng, kies in het ontwerpen van een voorwaartse primer, I) een C-rijke regio; II) te wijzigen G op R op CG-en CNG-contexten en veranderen van de resterende G naar A. Bij het ontwerpen van een reverse primer, I) kiezen een G-rijk gebied; II) te wijzigen C tot Y (pyrimidine) op CG-en CNG contexten en veranderen van de resterende C T.
4. We meestal gebruik 1-2 pi van de natriumbisulfiet behandeld met DNA als een sjabloon voor elke PCR-amplificatie (Xiao et al.., 2003). Het PCR-product moet worden geanalyseerd met behulp van gelelektroforese om de juiste omvang van het fragment te bevestigen en te gel worden gezuiverd en gekloneerd in de TOPO TA kloneringsvector pCR2.1 (Invitrogen) als een insert. Een enkele kolonie is opgepakt en gekweekt; plasmide DNA geëxtraheerd en verstuurd voor het rangschikken.

4. Sequentie-analyse

Het principe van bisulfiet sequencing is dat niet-gemethyleerd cytosine worden geconverteerd naar uracil te wijten aan hydrolytische desaminering door een hoge concentratie van natriumbisulfiet op pH5.0 die als thymine worden versterkt in PCR-product, terwijl 5-methyl cytosine zullen niet worden gewijzigd door natriumbisulfiet en blijven aan cytosine na PCR-amplificatie (Clark et al., 1994;. Frommer et al., 1992.). Na het behalen van de sequentie resultaat, we vergelijken met de streng-specifieke sjabloon dat wordt gebruikt voor de PCR-amplificatie. Als een cytosine residu in de sjabloon leest als een thymine in de sequencing resultaat, betekent dit dat de cytosine niet gemethyleerd is. Als een cytosine residu in de template blijft een cytosine in de sequencing, betekent dit dat het cytosine gemethyleerd is.

IV. Representatieve resultaten

Figuur 1.

Discussion

Het is relatief eenvoudig om embryo's te scheiden van het endosperm en de zaadhuid, maar het is vervelend om endosperm scheiden van zaadhuid, vooral voor zaden in een vroeg of midden-torpedo stadium van de embryogenese. Omdat zaadhuid alleen bij een zeer kleine hoeveelheid weefsel, voor sommige genen, bijvoorbeeld, MEA en de FWA, hoeven we niet te endosperm scheiden van zaadhuid. Dat betekent dat we kunnen isoleren RNA's uit een mengsel van endosperm en zaadhuid weefsels, controleer dan de expressie van de moederlijke en vaderlijke allelen van een gen, te vergelijken met expressie in embryo's, en bepalen de imprint status van het gen.

Voor bisulfiet sequencing, de ontworpen primers nodig voor onderdeel-specifiek zijn. Soms is het moeilijk te versterken een fragment uit de bisulfiet behandelde genomisch DNA als gevolg van beschadigd DNA template door natriumbisulfiet behandeling en we meestal probeer verschillende sets van de PCR-primers in verschillende regio's en een kortere fragmenten. Na het restrictie-enzym digestie, de genomische DNA moet volledig is gedenatureerd worden in single-stranded sinds de bisulfiet deaminatie bijna niet werkt op de cytosine residuen in double-stranded DNA-structuren. Een ander belangrijk is dat de bisulfiet behandeling moet worden voltooid. Als een bekende niet-gemethyleerd cytosine is niet geconverteerd naar thymine in de bisulfiet sequencing, betekent dit dat de bisulfiet behandeling niet goed is uitgevoerd. Als alternatief, als er veel cytosine residuen in een onbekend gebied zijn niet veranderd in thymine in de bisulfiet sequencing, is het zeer waarschijnlijk te wijten aan versterking van onbekeerde DNA in plaats van indicatie van alle gemethyleerde cytosine residuen in de regio.

Natriumbisulfiet sequencing kan precies zien of een bepaalde cytosine residu is gemethyleerd of niet in een genoom als het experiment goed is uitgevoerd (Henderson et al.., 2010). Het combineren van de natriumbisulfiet sequencing met recente high-throughput sequencing technieken, zoals de Illumina Genome Analyzer high-throughput sequencing-platform, kan men de epigenoom kaart op single-base resolutie in planten en zoogdieren (Cokus et al., 2008;. Hsieh et al. ., 2009; Lister et al., 2008;. Lister et al., 2009)..

Materials

Supplies Dissecting Microscope Scissors Fine Tip Forceps Jewelry Tag Plant Stakes String or Twist-Ties 4" X 2" X 8" Polyethylene Bags 3" X 1" X 1.0 mm Microscope Slides Liquid Nitrogen Liquid Nitrogen Containers Heat Block PCR Tubes Thermocycler Microcentrifuge Tubes Microcentrifuge Gel Electrophoresis facility Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants Reagents 70% Ethanol 95% Ethanol 100% Ethanol 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7 Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) 100% Ethanol Cholorform Restriction Enzymes 3 M NaOH 6.3 M NaOH 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite Sterile distilled H2O 10 mM Hydroquinone Wizard DNA Clean-Up System (Promega) 10 M NH4OAc 20 μg/ μL tRNA TE buffer The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)