Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Summary

Imprinting ist ein Phänomen in Pflanzen-und Säugetier Reproduktion. DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle in Mechanismen der Prägung. Isolating Endosperm und Bestimmung Methylierungsstatus von geprägten Genen in

Abstract

Arabidopsis thaliana ist ein hervorragendes Modell-Organismus für die Untersuchung epigenetischen Mechanismen. Einer der Gründe ist der Verlust-of-function Nullmutante von DNA-Methyltransferasen lebensfähig ist, so dass ein System zu untersuchen, wie Verlust von DNA-Methylierung in einem Genom beeinflusst Wachstum und Entwicklung. Imprinting bezeichnet differentielle Expression von mütterlichen und väterlichen Allelen und spielt eine wichtige Rolle bei der Fortpflanzung Entwicklung in beiden Säugetier-und Pflanzenarten. DNA-Methylierung ist entscheidend dafür, ob die mütterliche oder väterliche Allele eines aufgedruckten Gen exprimiert wird oder zum Schweigen gebracht. In Blütenpflanzen gibt es eine doppelte Befruchtung bei der Reproduktion: eine Samenzelle befruchtet die Eizelle zum Embryo und einem zweiten Spermien Sicherungen mit der zentralen Zelle zu steigen, um Endosperm Form geben. Endosperm ist das Gewebe, in dem Imprinting tritt in Pflanzen. MEDEA, ein SET-Domäne Polycomb Gruppe Gen und FWA, ein Transkriptionsfaktor Regulierung der Blüte sind die ersten beiden Gene gezeigt, dass in Endosperm und ihren Ausdruck geprägt wird durch DNA-Methylierung und Demethylierung in kontrollierten Pflanzen. Um Imprinting-Status eines Gens und Methylierungsmuster in Endosperm zu bestimmen, müssen wir in der Lage sein Endosperm zunächst zu isolieren. Da Samen ist winzig in Arabidopsis, bleibt es schwierig, Arabidopsis Endosperm isolieren und untersuchen ihre Methylierung. In diesem Video-Protokoll, berichten wir, wie man eine genetische Kreuz zu führen, um Endospermgewebe aus Samen zu isolieren und den Methylierungsstatus von Bisulfit-Sequenzierung zu ermitteln.

Protocol

I. Genetische Crossing

1. Eine Schwächung des weiblichen Elternteils

Um die mütterlichen und väterlichen Allele durch DNA-Sequenz-Polymorphismus, zwei verschiedene Ökotypen, zB Columbia-0 (Col-0) und Ler, wird als weiblich und männlich Eltern gewählt werden, zu unterscheiden. Die Pflanzen sollten jung und gesund. Man kann das weibliche Elternteil mit einem Binokular entmannen, Vergrößerungsspiegel Visier, oder mit bloßem Auge. Suchen Bühne-12 Blumen (Smyth et al., 1990) und entfernen Sie alle Blumen oder Schoten über und unter ihnen durch Abschneiden der Basis des Stiels mit der Schere. Sterilisieren Pinzette durch Eintauchen der Basis der Spitze vorsichtig in ein Becherglas mit 95% Ethanol, die alle Pollenkörner an der Zange wird zu entfernen und zu töten den Pollen als auch. Hebeln auseinander die Blütenknospen mit einer Pinzette und sanft Entfernen 4 Kelchblätter, 4 Blütenblätter, Staubblätter und 6, so dass die Stempel kahl und intakt. Versuchen Sie, um eine Beschädigung der Fruchtblätter während dieses Prozesses zu vermeiden.

2. Die Auswahl der Pollenspender und Durchführung Bestäubung

Die besten Pollen Geber offene Blüten im Stadium 14 anthesed mit den Blütenblättern Erweiterung in einem 90 °-Winkel zu den Stempel (Smyth et al., 1990), in denen eine Menge von Pollen ist zu vergießen. Besorgen Sie sich die Blume an der Basis und knapp oberhalb des Stiels, die bewirkt, dass die Blume zu gespreizt. Staub das Stigma der vorbereiteten Stempel mit der Anthere. Nach der Bestäubung, wird das Stigma, mit dem gelben Pollen, die leicht unter dem Mikroskop beobachtet werden kann abgedeckt werden.

3. Labeling Kreuz

Nach Bestäubung alle entmannt Stempel auf einer Pflanze, markieren wir das Kreuz mit einem Schmuck-tag und Informationen von weiblichen und männlichen Eltern und Datum. Legen Sie einen Pfahl in den Boden in der Nähe der Anlage, verwenden Sie einen String an den Stiel der Blüte auf den Scheiterhaufen binden, und decken den bestäubten Stempeln mit einer Plastiktüte.

II. Isolierung von Endosperm Gewebe in Arabidopsis

1. Vorbereitung von Materialien

Wir Regel erhalten notwendigen Materialien bereit vor der Ernte das Endosperm und Embryo Gewebe: eine flüssige Stickstoff-Tank, flüssiger Stickstoff, einem Binokular, zwei neue Paar feine Spitze Pinzette (5 INOX FST von Dumont Biologie, Schweiz.), Mikroskop Objektträger ( 3 "X 1" x 1,0 mm), einem pH 5,7 Lösung von 0,3 M Sorbit und 5 mM MES.

2. Sammeln Schoten

Am 7 - oder 8-Tage-after-Bestäubung (DAP), sind die Samen bereit, an der mittleren bis späten Stadium der Embryogenese Torpedo geerntet werden und seziert für Endosperm und Embryo. Manchmal kann es dauern 9-10 DAP, wenn die entmannt Blumen zu jung sind.

3. Isolating Endosperm und Embryo

Da Arabidopsis Samen sind winzig, verwenden wir ein Binokular auf Endosperm und Embryo zu isolieren. Setzen Sie ein 8-DAP Schote unter dem Mikroskop, verwenden Sie eine Pinzette, um die Schote Stiel halten und mit der Spitze eines anderen Zange zum Öffnen der Schote an den Rand, wo zwei Fruchtblätter Sicherung schieben. Verwenden Sie eine Pinzette zu holen einen Samen auf pH 5,7 Lösung von 0,3 M Sorbit und 5 mM MES, machen einen kleinen Schnitt an der Mikropyle Ende zu gleiten Embryo, drücken Sie die uncut Ende zu verdrängen Endosperm und separate Endosperm von Samenschale (Kinoshita et al., 2004). Setzen Sie den Embryo und Endosperm in separate Röhrchen in flüssigem Stickstoff. Setzen Sie diesen, bis wir Embryo oder Endosperm von 10 bis 15 Schoten sammeln und speichern Sie dann das Rohr in einem -80 ° C Gefrierschrank. In einigen Fällen, Endosperm nicht aus Samenschale, dh getrennt werden, kann man Gesamt-RNA aus dem Endosperm und Samenschale Mischung für die Gen-Imprinting-Analyse zu isolieren.

III. Bisulfit-Sequenzierung

1. Benötigte Reagenzien

Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) zur Herstellung von genomischer DNA, Restriktionsenzyme, 3 M NaOH (frisch zubereitet), 6,42 M Harnstoff / 4 M Natriumbisulfit (2 M Natriummetabisulfit, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Molekulargewicht: 190), 10 mM Hydrochinon, ein DNA Purification Kit (Promega Wizard DNA Clean-up-System, Cat. # A7280), TE-Puffer, 6,3 M NaOH (frisch), 10 M NH ₄ OAc, 20 ug / ul tRNA, und 100% Ethanol .

2. Details der Bisulfit-Behandlung-Protokoll

1. Isolieren Sie genomische Endosperm oder der Embryo DNA mit einer CTAB-Verfahren (Rogers und Bendich, 1988).
2. Digest 100 ng - 2 ug genomische DNA in 20 ul bis 100 ul Gesamtvolumen mit Restriktionsenzymen, die außerhalb der Region analysiert werden abgeschnitten. Für die MEA-Promotor, verwenden wir XhoI, NdeI und PstI oder HindIII.
3. Denaturieren die Restriktionsenzyme durch Kochen der DNA für 5 Minuten und dann löschen auf dem Eis.
4. Add 1 / 9 Volumen (2,2 ul für 20 ul verdaute DNA) von 3 M NaOH und Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten.
5. Übertragen Sie die Lösung für ein 250 ul PCR-Röhrchen.
6. Lösen von 7,5 g Harnstoff in 10 ml sterilem destilliertem Wasser; Langsam 7,6 g Natriummetabisulfit über 1-2 Stunden und Heizung hilft in der Regel lösen; pH-Wert auf 5 mit frisch zubereiteten 10 M NaOH; Add sterilem destilliertem Wasser zu einer endgültigen Volumen auf 20 mL. Dies ist 6.24 M Harnstoff / 4 M Natriumbisulfit-Lösung.
7. Add 6,24 m Harnstoff / 4 M Natriumbisulfit-Lösung auf eine Endkonzentration von 5,36 M und 3,44 M bzw. (Paulin et al., 1998). Fügen Sie z. B. 208 ul von 6,42 M Harnstoff / 4 M Natriumbisulfit Lösung für das obige 22,2 ul denaturierter genomischer DNA (Xiao et al., 2003).
8. Add 10 mM Hydrochinon, um die DNA in einer Endkonzentration von 0,5 mM (12 ul für 20 ul Verdauung).
9. Conduct Bisulfit-Behandlung in einer PCR-Maschine: 30 Zyklen von 55 ° C für 15 Minuten und 95 ° C für 30 Sekunden.
10. Desalt der Bisulfit-behandelten DNA mit Hilfe des Assistenten DNA Clean-Up-System von Promega und Follow-up des Protokolls (Jacobsen et al., 2000).
11. Messen Sie die exakte Volumen TE aus der Kolonne nach Entsalzung zurückgewonnen und fügen 6.3 M NaOH bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M. Bei 37 ° C für 15 Minuten.
12. Add 10 M NH ₄ OAc (pH 7,0) bis zu einer Endkonzentration von 3 M, 2 ul von 20 ug / ul tRNA und 3 Volumen 100% Ethanol und dann mischen. Zentrifuge für 15 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute.
13. Waschen des Pellets einmal mit 70% Ethanol, nicht eine kurze Zentrifuge, und entfernen Sie zusätzliche Ethanol.
14. Dry Pellet in einem Speedvac für 5-10 Minuten und resuspendieren in 25 bis 100 ul TE-Puffer je nach Ausgangspunkt der DNA-Menge. Die Natrium-Bisulfit-behandelten DNA ist nun bereit für die PCR-Analyse.

3. PCR-Amplifikation

1. Da nicht methylierter Cytosin in Uracil umgewandelt werden, ist es schwierig, ein großes Fragment mit der Bisulfit-behandelten DNA als Vorlage zu verstärken. So haben wir in der Regel Design-Primer, um ein Produkt nicht länger als 500 bp zu verstärken. Um Abfolge der 4-KB-MEA-Promotor, entwickelten wir viele Sätze von Primer und verstärkt 14 überlappende Fragmente auf die gesamte Region abdecken (Xiao et al., 2003).
2. Um Reihenfolge der Top-Strang, bei der Gestaltung eines Forward-Primer, I) wählen Sie einen G (Guanin)-reiche Region, um eine höhere Glühtemperatur ohne extra lang Nukleotide der Primer haben; II) ändern C (Cytosin) bis Y ( Pyrimidin) bei CG-und CNG-Kontexten und ändern Sie die restlichen C bis T (Thymin). In der Gestaltung eines Reverse-Primer, I) wählen Sie einen C-reiche Region; II) ändern G bis R (Purin) bei CG-und CNG-Kontexten und ändern Sie die restlichen G zu A (Adenin).
3. Um Abfolge der unteren Strang, bei der Gestaltung eines Forward-Primer, I) wählen Sie einen C-reiche Region; II) ändern G bis R am CG-und CNG-Kontexten und ändern Sie die übrigen G zu A. In der Gestaltung eines Reverse-Primer, I) wählen eine G-reiche Region; II) ändern C bis Y (Pyrimidin) bei CG-und CNG-Kontexten und ändern Sie die restlichen C bis T.
4. Wir in der Regel Verwenden Sie 1-2 ul der Natrium-Bisulfit-behandelten DNA als Vorlage für jedes PCR-Amplifikation (Xiao et al., 2003). Das PCR-Produkt muss durch Gel-Elektrophorese analysiert werden, um die richtige Größe des Fragments zu bestätigen, dann Gel gereinigt und kloniert in den TOPO TA-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) als Insert. Eine einzelne Kolonie wird aufgegriffen und kultiviert; Plasmid-DNA extrahiert und für die Sequenzierung.

4. Die Sequenzanalyse

Das Prinzip der Bisulfit-Sequenzierung ist, dass methylierte Cytosin wird in Uracil durch hydrolytische Desaminierung durch eine hohe Konzentration von Natriumbisulfit bei pH 5,0, die als Thymin in PCR-Produkt wird verstärkt umgesetzt werden, während 5-Methylcytosin wird nicht durch Natriumbisulfit geändert werden und bleiben bis Cytosin nach PCR-Amplifikation (Clark et al, 1994;. Frommer et al, 1992.). Nach Erhalt der Sequenzierung durch, vergleichen wir sie mit dem Strang-spezifische Vorlage, die für die PCR-Amplifikation verwendet wird. Wenn ein Cytosinrest in der Vorlage liest sich wie ein Thymin in der Sequenzierung Ergebnis bedeutet dies, dass das Cytosin nicht methyliert ist. Wenn ein Cytosinrest in der Vorlage bleibt ein Cytosin in der Sequenzierung, bedeutet dies, dass das Cytosin methyliert ist.

IV. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1.

Discussion

Es ist relativ leicht zu Embryo aus Endosperm und Samenschale getrennt, aber es ist mühsam, Endosperm von Samenschale trennen, vor allem für Saatgut auf Anfang oder Mitte-Torpedo Stadium der Embryogenese. Da Samenschale trägt nur eine sehr kleine Menge an Gewebe, für einige Gene, z. B., MEA und FWA, haben wir nicht zu Endosperm von Samenschale zu trennen. Das heißt, wir können RNAs aus einer Mischung von Endosperm und Samenschale Gewebe zu isolieren, zu überprüfen Ausdruck des mütterlichen und väterlichen Allele eines Gens, wobei die Expression in Embryonen zu vergleichen und festzustellen, die Prägung Status des Gens.

Für Bisulfit-Sequenzierung, müssen die entworfene Primer-Strang-spezifisch ist. Manchmal ist es schwierig, ein Fragment aus dem Bisulfit-behandelten genomischen DNA durch beschädigte DNA-Vorlage durch Natrium Bisulfit-Behandlung zu verstärken, und wir versuchen normalerweise verschiedene Sätze von PCR-Primer in verschiedenen Regionen und kürzere Fragmente. Nach Restriktionsverdau, muss die genomische DNA zu vollständig denaturiert in einsträngige seit der Bisulfit-Desaminierung fast nicht auf dem Cytosin-Reste in doppelsträngige DNA-Strukturen zu arbeiten. Ein weiterer Schlüssel ist, dass Bisulfit-Behandlung vollständig zu sein braucht. Wenn eine bekannte methylierte Cytosin nicht umgesetzt wird, um in der Bisulfit-Sequenzierung Thymin, bedeutet dies, dass die Bisulfit-Behandlung nicht ordnungsgemäß durchgeführt wurde. Alternativ, wenn viele Cytosin-Reste in eine unbekannte Region nicht geändert werden, um in der Bisulfit-Sequenzierung Thymin, ist es sehr wahrscheinlich wegen Verstärkung des nicht umgesetzten DNA anstatt Angabe aller methylierter Cytosin-Reste in der Region.

Natrium Bisulfit-Sequenzierung kann genau erkennen, ob eine bestimmte Cytosinrest methyliert ist oder nicht in einem Genom, wenn der Versuch korrekt durchgeführt wird (Henderson et al., 2010). . Hsieh et al; Kombination der Natrium-Bisulfit-Sequenzierung mit den jüngsten Hochdurchsatz-Sequenzierung Techniken, wie die Illumina Genome Analyzer Hochdurchsatz-Sequenzierung Plattform, kann man das Epigenom bei single-base-Auflösung in Pflanzen und Säugetieren (Cokus et al, 2008 Karte ., 2009; Lister et al, 2008;. Lister et al, 2009)..

Materials

Supplies Dissecting Microscope Scissors Fine Tip Forceps Jewelry Tag Plant Stakes String or Twist-Ties 4" X 2" X 8" Polyethylene Bags 3" X 1" X 1.0 mm Microscope Slides Liquid Nitrogen Liquid Nitrogen Containers Heat Block PCR Tubes Thermocycler Microcentrifuge Tubes Microcentrifuge Gel Electrophoresis facility Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants Reagents 70% Ethanol 95% Ethanol 100% Ethanol 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7 Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) 100% Ethanol Cholorform Restriction Enzymes 3 M NaOH 6.3 M NaOH 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite Sterile distilled H2O 10 mM Hydroquinone Wizard DNA Clean-Up System (Promega) 10 M NH4OAc 20 μg/ μL tRNA TE buffer The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)