Summary
印记是在植物和哺乳动物繁殖的现象。 DNA甲基化起着重要作用的印迹机制。隔离胚乳和确定的印记基因的甲基化状态
Abstract
拟南芥是一种优秀的模式生物研究表观遗传机制。其中一个原因是DNA甲基丧失功能的空突变是可行的，从而提供了一个系统来研究如何在基因组DNA甲基化的损失，影响经济增长和发展。印指母系和父系等位基因表达差，在哺乳类动物和植物再生产的发展中起着重要作用。 DNA甲基化是决定是否印迹基因的母亲或父亲的等位基因表达或沉默的关键。在开花植物中，有一个再生产的双受精事件：一个精子细胞受精的卵细胞，形成与中央细胞上升到胚乳的胚胎和精子第二保险丝。胚乳是印迹发生在植物的组织。美狄亚，一个SET域polycomb的组基因和荧光增白剂，一种转录因子调节开花，胚乳和其表达的印迹显示前两个基因是由DNA甲基化和去甲基化控制植物。为了确定印记的基因和胚乳中的甲基化模式的状态，我们需要能够先隔离胚乳。由于种子是在拟南芥中的微小的，但它仍然具有挑战性，隔离拟南芥胚乳，并检查其甲基化。在此视频协议中，我们报告如何进行遗传交叉，隔离胚乳组织，并确定由亚硫酸氢钠测序的甲基化状态。
Protocol
一，遗传隧道
1。 Emasculating的母本
为了区分使用的DNA序列多态性，两个不同生态型，如哥伦比亚0（COL - 0）和LER，将作为女性和男性的父母选择的母亲和父亲的等位基因。植物应年轻和健康。一个可以阉割母本，用解剖显微镜，放大镜遮阳帽，或肉眼。找到阶段- 12花（史密斯等人，1990年）和删除任何鲜花或角果上面和下面他们的基地花梗用剪刀裁剪。消毒镊子轻轻浸泡成95％乙醇的烧杯中，这将删除任何钳花粉和杀死花粉以及尖端的基础。轻轻撬除了使用产钳的花蕾，轻轻取出4个萼片，4个花瓣，6个雄蕊，使雌蕊裸露和完整。尽量避免在此过程中损坏的心皮。
2。采摘的花粉供体和开展授粉
在一个90度角的雌蕊（史密斯等人，1990年），在其中大量的花粉脱落的延长花瓣最好的花粉捐助者anthesed阶段14开的花。抓住花基地，只是上面的花梗，这将导致流传开的花。灰尘的准备雌蕊柱头与花药。柱头授粉后，将覆盖着黄色的花粉，可以很容易地在显微镜下观察。
3。标签的十字架
上所有的植物阉割雌蕊授粉后，我们的标签与珠宝的女性和男性的父母和日期的标签和信息交叉。接近的植物在土壤中的股份，使用一个字符串，以配合花序干的股权，并用塑料袋罩在授粉的雌蕊。
二。在拟南芥中分离胚乳
1。准备材料
我们通常会得到必要的材料，准备收获前胚乳和胚胎组织：液氮罐，液氮，在解剖显微镜，细尖镊子（5杜蒙生物学INOX福斯特，瑞士），显微镜载玻片的两个新的双（ 3“X 1”X 1.0毫米），pH值5.7的解决方案0.3米的山梨醇和5毫米的MES。
2。收集角果
在7 - 8天后授粉（DAP），种子准备在中旬后期胚胎发育的鱼雷阶段，会有收获的，胚乳和胚胎解剖。有时，它可能需要9-10磷酸二铵，如果被阉割的花是太年轻了。
3。隔离的胚乳和胚
由于拟南芥种子是微小的，我们用解剖显微镜隔离胚乳和胚。 8磷酸二铵丝丽放在显微镜下，使用一对镊子举行丝丽花梗，并用另一双钳尖端利润率两个心皮保险丝滑动打开丝丽。使用一对镊子拿起pH值5.7到0.3米山梨醇和5毫米的MES解决方案的一个种子，在珠孔端的一个小切口滑出胚胎，挤推胚乳胚乳和种皮中分离出完整无缺的结束（木下等人 ，2004年）。放入液氮中的单独的微管胚和胚乳。继续此，直到我们积累了从10-15角果胚或胚乳，然后储存在-80 ° C冰箱管。在某些情况下，胚乳没有从种皮，即分离，可以分离出基因印迹分析胚乳和种皮的混合物从总RNA。
三。重亚硫酸盐测序
1。所需的试剂
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为准备基因组DNA，限制性内切酶，3 M氢氧化钠（新鲜的），6.42 M尿素/ 4米的亚硫酸氢钠（Sigma - Aldrich公司，2米的焦亚硫酸钠，S9000，Na2S2O5，分子量：190） 10毫米的氢醌，DNA纯化试剂盒（Promega公司向导DNA清理系统，猫＃A7280），TE缓冲液，6.3米的NaOH（新鲜的），10米NH 4醋酸，20微克/μL的tRNA，和100％的乙醇。
2。亚硫酸氢钠治疗协议详情
- 隔离胚乳基因或胚胎的DNA“（Rogers和Bendich，1988）使用CTAB方法。
- 精华100纳克 - 2微克的基因组DNA在20μL到100μL，限制性内切酶，要分析区域外的总量。多边环境协定的发起人，我们使用，NdeI，XhoI位和PstI或HindIII位。
- 煮沸五分钟的DNA限制性内切酶变性，然后冰解渴。
- 15分钟，加入1 / 9 3 M NaOH和孵化的体积（2.2μL，20μL酶切的DNA）在37 ° C。
- 转移250μLPCR管的解决方案。
- 7.5克的尿素溶解在10毫升无菌蒸馏水慢慢加入7.6克焦亚硫酸钠，过1-2小时加热通常有助于溶解;新鲜的10米氢氧化钠调整pH值至5;最后添加无菌蒸馏水容至20毫升。这是6.24 M尿素/ 4米的亚硫酸氢钠溶液。
- 新增6.24 / 4米的亚硫酸氢钠溶液的终浓度为5.36中号M尿素和3.44中号分别为（波林等 ，1998）。例如，添加208μL6.42 M尿素/ 4米以上的22.2μL变性基因组DNA（肖等人，2003年）亚硫酸氢钠溶液。
- 加入10毫米的氢醌在终浓度为0.5毫米（12μL，20μL消化）的DNA。
- 进行亚硫酸氢钠治疗，在PCR仪：55 ° C时15分钟，95℃30秒30次。
- 脱盐使用向导DNA清理系统自Promega的亚硫酸氢钠处理DNA，并跟进协议（ 雅各布森等人，2000年） 。
- 测量的TE的确切数量列脱盐后收回，并添加氢氧化钠6.3米的0.3米孵育终浓度在37 ° 15分钟。
- 10米NH 4醋酸（pH 7.0）中，终浓度为3米，2μL20μg/μL的tRNA的，3卷100％的乙醇，然后混合。在14000转离心15分钟。
- 用70％乙醇洗涤沉淀一次，做一个简短的离心机，并删除多余的乙醇。
- 干颗粒speedvac在5-10分钟和悬浮在25 - 100μLTE缓冲液取决于DNA的量开始。现在的亚硫酸氢钠处理DNA PCR分析。
3。 PCR扩增
- 由于甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，这是很难用亚硫酸氢钠处理的DNA为模板扩增大片段。因此，我们通常设计引物扩增的产品不再大于500 bp。 4 - KB的多边环境协定的启动子序列，我们设计了多套引物扩增14个重叠的碎片，以覆盖整个地区（肖等人，2003年） 。
- 序列顶部链，在设计一个正向引物，我）选择一个G（鸟嘌呤）丰富的地区，以便有没有超长核苷酸引物退火温度较高的;二）改变C（胞嘧啶）为Y（嘧啶在CG和CNG上下文）和改变其余的C T（胸腺嘧啶）。在设计反向引物，我）选择C丰富的地区;二）改变G到R在CG和CNG上下文（嘌呤）和改变剩余的G到A（腺嘌呤）。
- 序列底部股，在设计一个正向引物，我）选择一个C丰富的地区;二）改变G到R在CG和CNG上下文和更改设计反向引物，我）选择其余G到A。一个G -丰富的地区;二）改变C到Y（嘧啶）在CG和CNG上下文和改变其余的C到T
- 我们通常使用1-2μL的亚硫酸氢钠处理的DNA为模板，每个PCR扩增（肖等人，2003年） 。 PCR产物凝胶电泳分析，以确认正确的片段大小，然后将凝胶纯化，插入克隆到TOPO TA克隆载体pCR2.1（Invitrogen公司）。单菌落拿起和培养;质粒DNA的提取和测序发送。
4。序列分析
亚硫酸氢钠测序的原理是，将被转换成高浓度亚硫酸氢钠在PH5.0扩增PCR产物将作为胸腺嘧啶尿嘧啶由于水解脱氨甲基化的胞嘧啶5 - 甲基胞嘧啶，而不会由亚硫酸氢钠修改并保持后PCR扩增（Clark 等，1994; Frommer 等，1992）。胞嘧啶。后获得的测序结果，我们比较它与特定链的模板进行PCR扩增。如果模板中的胞嘧啶残基在测序结果胸腺嘧啶读取，它表明，没有甲基化的胞嘧啶。如果模板中的胞嘧啶残基仍然是一个胞嘧啶测序，这意味着是甲基化的胞嘧啶。
四。代表性的成果
图1。
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Discussion
这是比较容易分离胚胎胚乳和种皮，从种皮中分离出来的胚乳，在胚胎发育的早期或中期鱼雷阶段，特别是对种子，但它是单调乏味的。由于种皮不仅有助于某些基因，极少量的组织，例如，MEA和荧光增白剂 ，我们不从种皮中分离出来的胚乳。这意味着，我们可以从胚乳和种皮组织混合物中分离的RNA，检查一个基因的母亲和父亲的等位基因表达，比较，并确定该基因的印迹状态的表达在胚胎。
亚硫酸氢钠测序，设计引物需要特定链。有时候，这是很难的亚硫酸氢钠处理的基因组DNA亚硫酸氢钠处理损坏的DNA为模板扩增片段，和我们通常尝试在不同的地区和较短的片段的PCR引物不同套。基因组DNA限制性内切酶消化后，需要完全变性成单链以来，亚硫酸氢脱氨几乎不工作在双链DNA结构的胞嘧啶残基。另一个关键因素是，亚硫酸氢钠治疗需要完成。如果一个已知的甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶的亚硫酸氢钠测序，它表明，没有进行正确的亚硫酸氢钠治疗。另外，如果在许多未知区域的胞嘧啶残基不改变胸腺嘧啶在硫酸氢钠测序，它是最有可能比在该地区所有的甲基化的胞嘧啶残基的指示，而由于未转换的DNA扩增。
如果实验进行正确，可以精确地揭示是否一个特定的胞嘧啶残基是在基因组甲基化或不的亚硫酸氢钠排序（恒基兆业等，2010）。最近的高通量测序技术，如Illumina的Genome Analyzer的高通量测序平台，结合亚硫酸氢钠测序，可以映射表观基因在植物和哺乳动物的单碱基分辨率（Cokus等人，2008;谢等。 2009年，李斯特等人，2008;制表等，2009）。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者感谢维持拟南芥女士珍妮弗M.洛梅尔和塔拉北路Rognan。这项工作是从美国圣路易斯大学和美国国立卫生赠款1R15GM086846 - 01和3R15GM086846 - 01S1 W.小的启动资金支持。
Materials
Supplies
Reagents
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References
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