Summary
각인은 식물과 동물의 복제에 현상입니다. DNA의 methylation은 각인의 메커니즘에서 중요한 역할을합니다. 배젖를 분리 및 각인 유전자의 methylation 상태를 결정
Abstract
Arabidopsis thaliana은 epigenetic 메커니즘을 연구를위한 훌륭한 모델 생물이다. 그 이유 중 하나는 DNA의 methyltransferases의 손실 함수 NULL의 돌연변이가 따라서 게놈에있는 DNA의 methylation의 손실이 성장과 발전에 미치는 영향 연구하는 시스템을 제공하고, 실용적입니다. 각인은 모자 아버지의 대립 유전자의 미분 표현을 나타냅니다과 포유 동물과 식물 모두에서 복제 개발에 중요한 역할을합니다. DNA의 methylation은 각인 유전자의 모자 또는 아버지 대립 유전자가 표현하거나 침묵 여부를 결정하는 것이 중요합니다. 꽃 식물에서, 복제에서 더블 수정 이벤트가있다 : 한 정자 세포는 배젖을 일으키다 수있는 중앙 세포와 배아 그리고 두 번째 정자 퓨즈를 형성하기 위해 난자를 fertilizes. 배젖은 각인이 공장에서 발생하는 조직입니다. 메데아, SET 도메인 Polycomb 그룹 유전자 및 FWA, 꽃을 조절 전사 인자는 배젖 및 표현에 인쇄되는 표시된 처음 두 유전자 아르의 DNA의 methylation과 demethylation에 의해 제어됩니다 식물. 유전자와 배젖의 methylation 패턴의 각인 상태를 결정하기 위해, 먼저 배젖를 분리 수 있어야합니다. 씨앗 Arabidopsis에서 작은 있기 때문에, 그것은 Arabidopsis 배젖를 분리하고 methylation을 확인하기 위해 도전 남아 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는, 우리는 씨앗에서 배젖 조직을 분리, 유전자 십자가를 실시하고, bisulfite의 시퀀싱에 의해 methylation 상태를 확인하는 방법을보고합니다.
Protocol
I. 유전자 크로싱
1. 여성 부모 Emasculating
DNA 시퀀스 다형성, 두 개의 다른 ecotypes 예 : 콜럼비아 - 0 (콜 - 0) 및 Ler가, 여성과 남성의 부모로 선택됩니다를 사용하여 모자 아버지 대립 유전자를 식별하기 위해. 식물 젊고 건강해야합니다. 하나는 바이저, 또는 육안을 확대, 해부 현미경을 사용하여 여성의 부모를 거세된 수 있습니다. 무대 - 12 꽃을 찾아 (스미스 외., 1990)와 가위와 작은 꽃자루의 기반을 클리핑하여 꽃이나 siliques 위와 아래를 제거합니다. 포셉에있는 꽃가루 곡물을 제거하고뿐만 아니라 꽃가루를 죽일 것입니다 95 %의 에탄올의 비커로 부드럽게 팁의 기반을 찍기로 집게를 소독. 부드럽게 집게를 사용하여 꽃 봉오리를 분리 캐내려고하고, 부드럽게 암술은 베어하고 그대로두고, 4 sepals, 4 꽃잎, 6 stamens를 제거합니다. 이 과정에서 carpels에 손상을 피하기 위해보십시오.
2. 꽃가루 기증자를 따기와 수분을 수행
최고의 꽃가루의 기증자는 꽃가루가 많이 흘리기있는 암술 (스미스 외., 1990)에 90 ° 각도로 확장 꽃잎과 함께 단계 14에서 열린 꽃 anthesed 있습니다. 기지에서 꽃을 잡고 그냥 작은 꽃자루 위에, 이것은 꽃이 열려 확산하게됩니다. 꽃밥과 준비 암술의 오명을 먼지. 수분 후, 오명은 쉽게 현미경으로 관찰할 수있는 노란색 꽃가루와 함께 다룹니다.
3. 십자가를 라벨링
식물의 모든 emasculated pistils을 pollinating 후, 우리는 보석 태그와 여성과 남성의 부모 및 날짜 정보와 함께 십자가를 라벨. 공장 주변 토양의 지분을 장소 지분에 꽃이 핌의 줄기를 묶어하는 문자열을 사용하고 비닐 봉지로 pollinated pistils을 커버.
II. Arabidopsis의 배젖 조직의 분리
1. 준비 자료
액체 질소 탱크, 액체 질소, 해부 현미경, 미세 팁 포셉 (더몬트 생물학 5 INOX FST, 스위스.) 현미경 유리 슬라이드의 두 쌍 (우리는 보통 배젖 및 배아 조직을 수확하기 전에 준비가 필요한 자료를 얻을 3 "X 1"X 1.0 mm), sorbitol 0.3 M의 산도 5.7 솔루션 5 MM MES.
2. 수집 siliques
7 - 또는 8 - 일 - - 수분 후 (DAP), 씨앗이 embryogenesis의 후반 단계 어뢰 중순에 수확하고 배젖 및 배아에 대한 해부를 준비하고 있습니다. emasculated 꽃이 너무 어린 경우에는 때로는 90-10 DAP이 걸릴 수 있습니다.
3. 분리 배젖 및 배아
Arabidopsis 씨앗은 작은 있기 때문에, 우리는 배젖 및 배아를 분리 해부 현미경을 사용합니다. 현미경 8 DAP의 silique 넣고, silique 작은 꽃자루를 잡아 포셉 한 켤레를 사용하여 두 carpels 퓨즈 여백에 열려 silique을 슬라이드 포셉 또 한 쌍의의 팁을 사용합니다. sorbitol 0.3 M 5 MM MES의 산도 5.7 솔루션에 한 종자를 데리러 포셉 한 쌍의를 사용하여, 배아를 슬라이드 micropyle 끝에 작은 상처를 씨앗 코트에서 배젖 및 별도의 배젖를 밀어 포경 끝을 스퀴즈 (기노 시타 외., 2004). 액화 질소에 별도의 microtubes로 배아와 배젖 놔. 우리가 10-15 siliques에서 배아 또는 배젖을 축적 때까지 이것을 계속하고 -80 ° C 냉동고에 튜브를 저장합니다. 어떤 경우에는, 배젖은 씨앗 코트, 즉 분리하실 필요가 없습니다, 하나는 유전자 각인 분석 배젖 및 종자 코트 혼합물에서 총 RNA를 분리하실 수 있습니다.
III. Bisulfite 배열
1. 필요한 시약
, : 게놈 DNA, 제한 효소, 3 M NaOH (갓 만든), 6.42 M의 요소 / 4 M 나트륨 bisulfite를 (190 2 M 나트륨 metabisulfite, 시그마 - 알드리치, S9000, Na2S2O5, 분자량) 준비 Cetyltrimethyl 암모늄 브로마이드 (CTAB) 10 MM 히드로퀴논, DNA 정제 키트 (Promega 마법사 DNA 청소 시스템, 고양이. # A7280), TE 버퍼, 6.3 M NaOH (갓 만든), 10 M NH 4 OAc, 20 μg / μL tRNA 및 100 % 에탄올 .
2. bisulfite 치료 프로토콜의 세부 사항
- 게놈 배젖 또는 CTAB 절차를 사용하여 배아 DNA (로저스 Bendich, 1988)을 분리.
- 다이제스트 100 NG - 20 μL 100 분석하는 영역 이외의자를 제한 효소로 μL 총 볼륨의 게놈 DNA 2 μg. MEA의 발기인을 위해, 우리는 XhoI, NdeI 및 PstI이나 HindIII를 사용합니다.
- 5 분 동안 DNA를 끓는하여 제한 효소를 변성 후 얼음 끄다.
- 15 분 37 3 M NaOH와 부화의 9분의 1 볼륨 (20 μL 소화 DNA를 2.2 μL) ° C를 추가합니다.
- 250 μL PCR 튜브에 대한 해결책을 전송합니다.
- 멸균 증류수 10 ML에 요소의 7.5 g을 디졸브, 천천히 1~2시간 이상의 나트륨 metabisulfite의 7.6 g을 추가하고 가열은 일반적으로 해소하는 데 도움이, 갓 만들어진 10 M NaOH와 5 산도를 조정, 마지막에 살균 증류수를 추가 20 ML에 볼륨. 이것은 6.24 M의 요소 / 4 M 나트륨 bisulfite 솔루션입니다.
- 각각 6.24 M의 요소 / 5.36 M의 최종 농도 4 M 나트륨 bisulfite 솔루션과 3.44 M을 (폴린 외., 1998) 추가합니다. 예를 들어, 6.42 M의 요소 / 변성 게놈의 DNA (샤오 외., 2003)의 위 22.2 μL 4 M 나트륨 bisulfite 솔루션의 208 μL를 추가합니다.
- 0.5 MM (20 μL 소화 12 μL)의 최종 농도에서 DNA 10 MM의 히드로퀴논를 추가합니다.
- . 55 ° 15 분 95 ° C 30 초 동안 C 30 사이클 : PCR 기계에서 bisulfite 치료를 실시
- Promega에서 마법사 DNA 청소 시스템을 사용하여 bisulfite 치료 DNA를 탈염하다와 (야콥센 외., 2000) 프로토콜을 따르십시오.
- 탈염 후 열을에서 발견한 TE의 정확한 부피를 측정하고 37 0.3 M. 부화의 최종 농도 6.3 M NaOH를 추가 ° C를 15 분.
- 최종 3 M의 농도 20 μg / μL tRNA 2 μL, 100 %의 에탄올 3 권 ~ 10 M NH 4 OAc (산도 7.0) 추가하고 다음 섞는다. 14,000 rpm으로 15 분 동안 원심 분리기.
- , 70 % 에탄올로 한 번 펠렛을 씻어 짧은 원심 분리기를하고, 여분의 에탄올을 제거하십시오.
- 25 5-10분 및 resuspend위한 speedvac에 건조 펠렛 - DNA의 양을 시작에 따라 100 μL TE 버퍼. 나트륨 bisulfite - 대우 DNA 지금은 PCR 분석을위한 준비가되었습니다.
3. PCR 증폭
- unmethylated cytosines가 유라실로 변환되므로, 이것은 템플릿으로 bisulfite - 대우 DNA를 사용하여 큰 조각을 증폭하기가 어렵습니다. 따라서, 우리는 일반적으로 더 이상 500 BP보다 제품을 증폭하기 위해 primers를 디자인하지 않습니다. 순서 4 - KB MEA의 발기인을 위해, 우리는 primers 많은 세트를 설계하고 14 중복 조각이 전체 지역을 커버하기 위해 증폭 (샤오 외., 2003).
- 순서 가기 - 스트랜드는 앞으로 입문서, I)를 설계 primers에 추가 긴 세포핵이없는 높은 어닐링 온도를 위해서는 G (구아닌)이 풍부한 지역을 선택, II) 변경 C (사이 토신) Y을 ( CG와 CNG 컨텍스트에서 pyrimidine) 및 T (thymine)에 남아있는 C를 변경합니다. 역방향 프라이머, I)을 설계에 C - 풍부한 지역을 선택, II) CG와 CNG 컨텍스트에서 R (purine)로 G를 변경하고 A (아데닌)에 남아있는 G를 변경합니다.
- CG와 CNG 컨텍스트에서 R로 G를 변경하고 선택 역방향 프라이머, I)를 설계 A.에 남아있는 G를 변경 II); 순서 하단 스트랜드는 앞으로 입문서, I)를 설계에 C - 풍부한 지역을 선택 G - 풍부한 지역, II)는 CG와 CNG 컨텍스트에서 Y (pyrimidine)로 C를 변경하고 T.에 남아있는 C를 변경
- 우리는 일반적으로 각각의 PCR 증폭 (샤오 외., 2003)에 대한 템플릿으로 나트륨 bisulfite - 취급 DNA 1-2 μL를 사용합니다. PCR 제품은 다음 젤 삽입으로 정화하고 토포 TA 클로닝 벡터 pCR2.1 (Invitrogen)에 복제하는 조각의 정확한 크기를 확인하기 위해 젤 전기 영동으로 분석해야합니다. 하나의 식민지가 데리러와 교양되며 플라스미드 DNA가 추출 및 시퀀싱을위한 보냈습니다.
4. 서열 분석
bisulfite 배열의 원칙은 unmethylated 사이 토신은 PCR 제품의 thymine으로 증폭됩니다 pH5.0에서 나트륨 bisulfite의 높은 농도에 의해 가수 분해 deamination에 의한 유라실로 변환됩니다이며 5 메틸 사이 토신은 나트륨 bisulfite에 의해 수정되지 않습니다 반면 과 PCR 증폭 (.; Frommer 외, 1992. 클라크 외, 1994) 이후 사이 토신으로 남아 있습니다. 시퀀스 결과를 얻기 후에, 우리는 PCR의 증폭에 사용되는 스트랜드 특정 템플릿과 그것을 비교하십시오. 템플릿의 사이 토신 잔여물이 시퀀싱 결과 thymine으로 글을 읽는다면, 그것은 사이 토신이 methylated되지 않았음을 나타냅니다. 템플릿의 사이 토신 잔여물이 순서에있는 사이 토신 남아있을 경우, 그것은 사이 토신이 methylated는 것을 의미합니다.
IV. 대표 결과
그림 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
그것은 배젖 및 종자 코트에서 배아를 분리하는 것이 비교적 쉽기는하지만 embryogenesis의 초기 또는 중간 단계에서 어뢰 특히 씨앗을 위해, 종자 코트에서 배젖를 구분 지루합니다. 종자 코팅은 일부 유전자에 대한 조직의 매우 작은 금액을 기여 때문에, 예를 들어, MEA와 FWA, 우리는 종자 코트에서 배젖를 구분하지 않아도됩니다. 우리가 배젖 및 종자 코트 조직의 혼합물에서 RNAS을 분리할 수있다는 것을 의미합니다 즉, 유전자의 모자 아버지 대립 유전자의 표현을 확인, 배 (胚)의 표현과 비교, 그리고 유전자의 각인 상태를 결정합니다.
bisulfite 배열은 설계 primers는 스트랜드 특정해야합니다. 때로는 나트륨 bisulfite 치료에 의해 손상된 DNA 템플릿에 의한 bisulfite - 대우 게놈 DNA의 파편을 증폭하기 어려운, 우리는 일반적으로 서로 다른 지역 및 짧은 조각의 PCR primers의 다른 세트를보십시오. 제한 효소 소화 후, 게놈 DNA는 bisulfite의 deamination 거의 두 번 좌초 DNA 구조의 사이 토신 잔류물에서 작동하지 않기 때문에 단일 좌초로 완전히 변성해야합니다. 또 다른 핵심은 bisulfite 처리가 완료되어야한다는 것입니다. 알려진 unmethylated 사이 토신이 bisulfite 배열에서 thymine로 변환되지 않은 경우, 그것은 bisulfite 처리가 제대로 진행되지 않았음을 나타냅니다. 알 수없는 지역에 많은 사이 토신 잔류물이 bisulfite 배열에서 thymine으로 변경하지 않는 경우 또는, 그것은 지역의 모든 methylated 사이 토신 잔류의 표시보다 가장 인해 변하지 않은 DNA의 증폭 가능성이 다소 있습니다.
실험이 제대로 실시하면 나트륨 bisulfite 배열 정확하게 특정 사이 토신 잔여물이 게놈에 methylated 여부를 확인할 수 있습니다 (헨더슨 외., 2010). . Hsieh 외, 같은 Illumina 게놈 분석기 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼으로 최근 높은 처리량 시퀀싱 기술과 시퀀싱 나트륨 bisulfite를 결합, 하나는 식물과 포유류의 단일 기본 해상도 (Cokus 외, 2008에서 epigenome를 매핑할 수 있습니다 . 2009 년, 리스터 외, 2008;. 리스터 외, 2009)..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 Arabidopsis 식물의 유지 보수를 위해 양 제니퍼 M. Lommel와 타라 N. Rognan 감사합니다. 이 작품은 건강 보조금 1R15GM086846 - 01와 W. 샤오에 3R15GM086846 - 01S1의 세인트 루이스 대학과 국립 연구소에서 시작 기금에 의해 지원되었다.
Materials
Supplies
Reagents
|
References
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. endich, J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
