Determinação de metilação de DNA de genes marcados em Arabidopsis Endosperma

Summary

Imprinting é um fenômeno em plantas e da reprodução de mamíferos. Metilação do DNA desempenha um papel importante nos mecanismos de imprinting. Isolando endosperma e determinação do estatuto de metilação de genes imprinted em

Abstract

Arabidopsis thaliana é um organismo excelente modelo para estudar mecanismos epigenéticos. Uma das razões é o mutante nulo de perda de função de DNA metiltransferases é viável, proporcionando assim um sistema para estudar como a perda da metilação do DNA em um genoma afeta o crescimento e desenvolvimento. Imprinting refere-se a expressão diferencial dos alelos maternos e paternos e desempenha um papel importante no desenvolvimento da reprodução em ambos os mamíferos e plantas. Metilação do DNA é fundamental para determinar se os alelos maternos ou paternos de um gene é expresso impressa ou silenciados. Em plantas com flores, há um evento de fertilização dupla na reprodução: um espermatozóide fertiliza o óvulo para formar um embrião e esperma fusíveis segundo com a célula central para dar origem a endosperma. Endosperma é o tecido onde imprinting ocorre nas plantas. MEDEA, a SET domínio gene grupo Polycomb e FWA, um fator de transcrição que regulam a floração, são os dois primeiros genes mostrado para ser impressa no endosperma e sua expressão é controlada por metilação do DNA e desmetilação em plantas. , A fim de determinar o status de impressão de um gene e padrão de metilação no endosperma, precisamos ser capazes de isolar endosperma primeiro. Desde que a semente é pequena em Arabidopsis, ele continua sendo um desafio para isolar endosperma Arabidopsis e examinar a sua metilação. Neste protocolo de vídeo, relatamos como conduzir um cruzamento genético, para isolar o tecido de endosperma de sementes, e para determinar o estado de metilação de seqüenciamento bissulfito.

Protocol

I. Genética Travessia

1. Castrar o pai do sexo feminino

A fim de distinguir os alelos maternos e paternos, usando polimorfismo de DNA seqüência, dois ecótipos diferentes, por exemplo, Columbia-0 (Col-0) e Ler, serão escolhidos como pais feminino e masculino. As plantas devem ser jovens e saudáveis. Pode-se castrar o pai do sexo feminino, usando um microscópio de dissecação, ampliando viseira, ou olho nu. Localize estágio-12 flores (Smyth et al., 1990) e remover qualquer flores ou siliques acima e abaixo deles pelo recorte da base do pedicelo com a tesoura. Esterilizar fórceps por imersão a base da ponta suavemente para um copo de etanol a 95%, o que irá remover quaisquer grãos de pólen sobre o forceps e matar o pólen também. Force suavemente para além dos botões florais utilizando fórceps, e remova cuidadosamente 4 sépalas, 4 pétalas e 6 estames, deixando o pistilo nua e intacta. Tente evitar danos ao carpelos durante este processo.

2. Escolher o doador de pólen e realizar a polinização

Os doadores de pólen são melhores anthesed flores abertas na fase 14 com as pétalas estendendo em um ângulo de 90 ° para o pistilo (Smyth et al., 1990), em que uma grande quantidade de pólen é derramamento. Pegue a flor na base e um pouco acima do pedicelo, que fará com que a flor a espalhar aberto. Poeira o estigma do pistilo preparado com a antera. Após a polinização, o estigma será coberto com o pólen amarelo, que pode ser facilmente observado sob um microscópio.

3. Rotulagem da cruz

Depois de polinizadores todos os pistilos emasculados em uma planta, nós rotulamos a cruz com uma etiqueta de jóias e informações dos pais do sexo feminino e masculino e data. Coloque uma estaca no solo próximo à planta, use uma corda para amarrar a haste da inflorescência para a fogueira, e cobrem os pistilos polinizados com um saco plástico.

II. Isolamento de tecidos endosperma em Arabidopsis

1. Preparando materiais

Costumamos receber materiais necessários pronto antes da colheita do endosperma e dos tecidos do embrião: um tanque de nitrogênio líquido, nitrogênio líquido, um microscópio de dissecação, dois novos pares de fina ponta pinças (5 INOX FST por Dumont biologia, na Suíça.), Lâminas de vidro de microscópio ( 3 "X 1" X 1.0 mm), um pH 5,7 solução de 0,3 M sorbitol e 5 mM MES.

2. Siliques coleta

Aos 7 - ou 8 dias de pós-polinização (DAP), as sementes estão prontas para serem colhidas em meados dos anos para a fase final da embriogênese torpedo e dissecados para endosperma e embrião. Às vezes, pode levar 90-10 DAP se as flores emasculadas são muito jovens.

3. Endosperma e embrião isolando

Desde sementes Arabidopsis são pequenos, nós usamos um microscópio de dissecação para isolar endosperma e embrião. Pôr silique 8 DAP-sob um microscópio, use uma pinça para segurar o pedicelo silique e usar a ponta de um outro par de fórceps para deslizar silique a céu aberto na margem onde fundir dois carpelos. Use uma pinça para pegar uma semente em soluções de pH 5,7 a 0,3 M sorbitol e 5 mM MES, faça um pequeno corte no final micrópila a deslizar para fora do embrião, aperte o fim uncut a empurrar para fora endosperma e endosperma separado do tegumento (Kinoshita et al., 2004). Coloque o embrião e endosperma em microtubos separados em nitrogênio líquido. Continue até que acumulamos embrião ou endosperma 10-15 siliques e depois guardar o tubo em um freezer -80 C °. Em alguns casos, endosperma não tem que ser separada da casca da semente, ou seja, pode-se isolar RNA total do endosperma e tegumento mistura para a análise de imprinting gene.

III. Seqüenciamento bissulfito

1. Reagentes necessários

Brometo de amônio cetiltrimetilamônio (CTAB) para a preparação do DNA genômico, enzimas de restrição, 3 M NaOH (recém-feitos), 6,42 M de uréia / 4 bissulfito de sódio M (2 metabissulfito de sódio M, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Peso Molecular: 190), 10 mM hidroquinona, um kit de purificação de DNA (Promega Assistente de DNA Sistema Clean-up, Cat. # A7280), TE buffer, 6,3 M NaOH (recém feitos), 10 M NH ₄ OAc, 20 mcg / mL tRNA e etanol 100% .

2. Detalhes do protocolo de tratamento bissulfito

1. Endosperma isolar DNA genômico ou embrião através de um procedimento CTAB (Rogers e Bendich, 1988).
2. Digest 100 ng - 2 mg de DNA genômico em 20 mL a 100 mL com volume total enzimas de restrição que cortam fora da região a ser analisada. Para o promotor MEA, usamos XhoI, NdeI e PstI ou HindIII.
3. Desnaturar as enzimas de restrição do DNA por fervura durante cinco minutos e depois apagar no gelo.
4. Adicione 1 / 9 do volume (2,2 mL para 20 mL de DNA digerido) de 3 M NaOH e incubar a 37 ° C por 15 minutos.
5. Transferir a solução para um tubo de PCR 250 mL.
6. Dissolver 7,5 g de uréia em 10 mL de água destilada estéril; Lentamente, adicionar 7,6 g de metabissulfito de sódio durante 1-2 horas e aquecimento geralmente ajuda a dissolver; Ajustar o pH para 5 com recém feitos 10 M NaOH; Adicionar água destilada estéril para a final volume para 20 mL. Este é 6,24 M de uréia / 4 M de solução de bissulfito de sódio.
7. Adicionar 6,24 M de uréia / 4 M de solução de bissulfito de sódio para uma concentração final de 5,36 M e 3,44 M, respectivamente (Paulin et al., 1998). Por exemplo, adicione 208 mL de 6,42 M de uréia / 4 M de solução de bissulfito de sódio para o mL 22,2 acima do DNA genômico desnaturado (Xiao et al., 2003).
8. Adicionar 10 mM hidroquinona ao DNA em uma concentração final de 0,5 mM (12 mL para 20 mL a digestão).
9. Realizar tratamento em uma máquina de bissulfito PCR: 30 ciclos de 55 ° C por 15 minutos e 95 ° C por 30 segundos.
10. Dessalinizar o DNA bissulfito tratado utilizando o Assistente do Sistema DNA Clean-Up da Promega e acompanhar o protocolo (Jacobsen et al., 2000).
11. Medir o volume exato de TE recuperado da coluna após dessalinização e adicionar 6,3 M NaOH a uma concentração final de 0,3 M. Incubar a 37 ° C por 15 minutos.
12. Adicionar 10 M NH ₄ OAc (pH 7,0) para uma concentração final de 3 M, 2 mL de 20 mcg / mL tRNA e 3 volumes de etanol 100% e, em seguida, misture. Centrifugar por 15 minutos a 14.000 rpm.
13. Lave o pellet uma vez com etanol 70%, faça uma centrífuga curto, e remover o etanol extra.
14. Pellet seco em um speedvac por 5-10 minutos e ressuspender em 25-100 mL tampão TE dependendo de partida quantidade de DNA. O tratado pelo bissulfito de sódio DNA está pronto para a análise PCR.

3. Amplificação por PCR

1. Desde citosinas não metiladas são convertidas em uracila, é difícil para amplificar um fragmento grande usando o DNA tratado pelo bissulfito como um modelo. Assim, costumamos projetar primers para amplificar um produto não superior a 500 pb. Para a seqüência de 4 kb promotor MEA, nós projetamos muitos conjuntos de primers e amplificado 14 fragmentos sobrepostos para cobrir toda a região (Xiao et al., 2003).
2. Para seqüenciar o top-fio, na concepção de uma cartilha para a frente, I) escolher um G (guanina) rica região a fim de ter uma maior temperatura de tratamento térmico, sem extras nucleotídeos na primers; II) mudança C (citosina) para Y ( pirimidina) em CG e contextos CNG e alterar o restante para C T (timina). Na concepção de um primer reverso, I), escolha uma região C-ricos; II) para mudar G R (purina) em CG e contextos CNG e alterar o G restantes para A (adenina).
3. Para seqüenciar o fundo vertente, na concepção de uma cartilha para a frente, I), escolha uma região C-ricos; II) a mudança para R G em CG e contextos CNG e alterar o G restantes para A. Ao projetar um primer reverso, I) escolha uma região rica em G; II) mudança C para Y (pirimidina) em CG e contextos CNG e alterar o C restantes para T.
4. Nós usamos geralmente 1-2 mL do sódio DNA tratado pelo bissulfito como um modelo para cada PCR (Xiao et al., 2003). O produto da PCR deve ser analisado por eletroforese em gel para confirmar o tamanho correto do fragmento, então a ser purificado com gel e clonados no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen), como uma inserção. A única colônia é captado e culta; DNA plasmidial extraídos e enviados para o seqüenciamento.

4. Análise da seqüência

O princípio do seqüenciamento bissulfito é que citosina unmethylated será convertido para uracil devido à desaminação hidrolítica pela alta concentração de bissulfito de sódio a pH5.0 que será amplificada como timina no produto de PCR, enquanto 5-metil citosina não será modificado por bissulfito de sódio e continuam a ser citosina após a amplificação (Clark et al, 1994;. Frommer et al, 1992).. Depois de obter o resultado de seqüenciamento, que compará-lo com o modelo vertente específica que é usado para a amplificação PCR. Se um resíduo citosina no modelo lê como uma timina no resultado seqüenciamento, isso indica que a citosina não está metilado. Se um resíduo citosina no modelo continua a ser uma citosina no seqüenciamento, isso significa que a citosina é metilado.

IV. Resultados representante

Figura 1.

Discussion

É relativamente fácil separar embrião do endosperma e tegumento, mas é entediante para separar endosperma de tegumento, especialmente para sementes na fase inicial ou média torpedo da embriogênese. Desde tegumento contribui apenas com uma pequena quantidade de tecido, para alguns genes, por exemplo, MEA e FWA, não temos para separar endosperma de tegumento. Isso significa que podemos isolar RNAs de uma mistura de endosperma e tecidos tegumento, verificar a expressão dos alelos maternos e paternos de um gene, compare com a expressão em embrião, e determinar o status imprinting do gene.

Para o seqüenciamento bissulfito, os primers projetados precisam ser vertente específica. Às vezes, é difícil para amplificar um fragmento do DNA tratado pelo bissulfito genômica devido ao modelo de DNA danificado por tratamento bissulfito de sódio, e geralmente tentamos diferentes conjuntos de primers PCR em diferentes regiões e fragmentos mais curtos. Após a digestão enzima de restrição, o DNA genômico precisa ser completamente desnaturado em single-stranded desde a desaminação bissulfito quase não funciona sobre os resíduos citosina em estruturas double-stranded DNA. Outro ponto-chave é que o tratamento bissulfito precisa ser completa. Se uma citosina conhecida unmethylated não é convertido em timina no seqüenciamento bissulfito, indica que o tratamento não é realizado bissulfito corretamente. Alternativamente, se muitos resíduos de citosina em uma região desconhecida não são alterados para timina no seqüenciamento bissulfito, é provavelmente devido a amplificação de DNA não convertidos, em vez de indicação de todos os resíduos de citosina metilados na região.

Seqüenciamento bissulfito de sódio pode revelar se precisamente um resíduo citosina particular é desnaturado ou não em um genoma se o experimento é conduzido corretamente (Henderson et al., 2010). Combinando o seqüenciamento bissulfito de sódio com as recentes técnicas de seqüenciamento de alto rendimento, como o Genoma Analyzer Illumina plataforma de seqüenciamento de alto rendimento, pode-se mapear o epigenoma em uma única base de resolução em plantas e mamíferos (Cokus et al, 2008;. Hsieh et al ., 2009; Lister et al, 2008;. Lister et al, 2009)..

Materials

Supplies Dissecting Microscope Scissors Fine Tip Forceps Jewelry Tag Plant Stakes String or Twist-Ties 4" X 2" X 8" Polyethylene Bags 3" X 1" X 1.0 mm Microscope Slides Liquid Nitrogen Liquid Nitrogen Containers Heat Block PCR Tubes Thermocycler Microcentrifuge Tubes Microcentrifuge Gel Electrophoresis facility Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants Reagents 70% Ethanol 95% Ethanol 100% Ethanol 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7 Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) 100% Ethanol Cholorform Restriction Enzymes 3 M NaOH 6.3 M NaOH 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite Sterile distilled H2O 10 mM Hydroquinone Wizard DNA Clean-Up System (Promega) 10 M NH4OAc 20 μg/ μL tRNA TE buffer The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)