Fastställande av DNA-metylering av Präglade Gener i Arabidopsis Frövitan

Summary

Imprinting är ett fenomen i anläggningar och däggdjur reproduktion. DNA-metylering spelar en viktig roll för mekanismer för prägling. Isolera frövita och bestämma metylering status präglade gener i

Abstract

Arabidopsis thaliana är en utmärkt modell organism för att studera epigenetiska mekanismer. En av anledningarna är förlusten-of-funktion null mutant av DNA-metyltransferaser är livskraftig, vilket ger ett system för att studera hur förlusten av DNA-metylering i arvsmassan påverkar tillväxt och utveckling. Imprinting hänvisar till differentierade uttryck av moderns och faderns alleler och spelar en viktig roll i reproduktionen utveckling i både däggdjur och växter. DNA-metylering är avgörande för att avgöra om moderns eller faderns alleler av en präglad gen uttrycks eller tystas. I blommande växter, finns det en dubbel befruktning händelse i reproduktion: en spermie befruktar ägget att bilda embryot och en andra säkringar spermier med den centrala cellen för att ge upphov till frövita. Frövitan är vävnaden där imprinting förekommer i växter. Medea, en SET-domän Polycomb grupp gen, och FWA, en transkriptionsfaktor som reglerar blomning, är de första två gener visat sig vara inpräntad i frövita och deras uttryck styrs av DNA-metylering och demetylering i växter. För att avgöra imprinting status för en gen och metylering mönster i frövita, måste vi kunna isolera frövitan först. Eftersom frö är liten i Arabidopsis, är det svårt att isolera Arabidopsis frövita och undersöka dess metylering. I den här videon protokoll, rapporterar vi hur man genomför en genetisk kors, för att isolera frövitan vävnad från frön, och att fastställa den metylering status genom bisulfite sekvensering.

Protocol

I. Genetiska Crossing

1. Emasculating den kvinnliga föräldern

För att särskilja moderns och faderns alleler med hjälp av polymorfism DNA-sekvens, två olika ekotyper, t ex Columbia-0 (Col-0) och Ler, kommer att väljas som kvinnliga respektive manliga föräldrar. Plantorna bör vara unga och friska. Man kan försvaga den kvinnliga föräldern med hjälp av en dissekera mikroskop, förstoringsglas visir eller blotta ögat. Leta stadium-12 blommor (Smyth et al., 1990) och ta bort eventuella blommor eller siliques över och under dem genom att klippa basen av pedicel med sax. Sterilisera pincett genom att doppa botten av spetsen försiktigt i en bägare av 95% etanol, vilket kommer att ta bort alla pollenkorn på pincetten och döda pollen också. Försiktigt bända isär blomknoppar med pincett, och ta försiktigt bort 4 foderblad, 4 kronblad och 6 ståndare, lämnar pistill nakna och intakt. Försök att undvika skador på fruktblad under denna process.

2. Plocka pollen givare och utföra pollinering

Den bästa pollen givare anthesed öppna blommor på scenen 14 med kronbladen sträcker i 90 ° vinkel mot pistillen (Smyth et al., 1990), där en hel del pollen är utgjutelse. Ta blomman i botten och strax ovanför pedicel, vilket kommer leda till blomman för att sprida öppna. Damm stigmatiseringen av det beredda pistillen med ståndare. Efter pollinering kommer stigmat att täckas med den gula pollen som lätt kan observeras i mikroskop.

3. Märkning korset

Efter pollinerande alla kastrerad pistillerna på en anläggning, märka vi korsning med en smycken tagg och information om kvinnliga och manliga föräldrar och datum. Placera en andel i marken i närheten av anläggningen, använd ett snöre att knyta stammen av blomställningen till bålet, och täck pollineras pistillerna med en plastpåse.

II. Isolering av frövitan vävnader i Arabidopsis

1. Förbereda material

Vi får oftast nödvändigt material klart innan skörd frövitan och vävnader embryo: ett flytande kväve tank, flytande kväve, en dissekera mikroskop, två nya par fin spets peang (5 INOX FST av Dumont biologi, Schweiz.) Objektglas glas ( 3 "x 1" x 1,0 mm), en pH 5,7 lösning av 0,3 M sorbitol och 5 mM MES.

2. Samla siliques

Vid 7 - eller 8-dagen-efter-pollinering (DAP), fröna är redo att tas ut i mitten till slutet torped skede av embryogenesen och dissekeras för frövita och embryo. Ibland kan det ta 9-10 DAP om kastrerad blommor är för ung.

3. Isolera frövita och embryo

Eftersom Arabidopsis frön är små, använder vi en dissekera mikroskop för att isolera frövita och embryo. Sätt en 8-DAP silique under ett mikroskop, använd en pincett för att hålla silique pedicel och använda spetsen på en annan pincett att glida öppna silique i marginalen där två fruktblad säkring. Använd en pincett för att plocka upp ett frö till pH 5,7 lösningar på 0,3 m sorbitol och 5 mM MES, gör ett litet snitt i micropyle slut glida ut embryot, pressa oklippta slut att driva ut frövita och separat frövita från frö pälsen (Kinoshita et al., 2004). Sätt embryot och frövitan i separata mikrorör i flytande kväve. Fortsätt så tills vi samlar embryo eller frövita från 10 till 15 siliques och sedan lagra röret i -80 ° C frys. I vissa fall tar frövitan inte vara separerade från fröskalet, dvs kan man isolera totala RNA från frövitan och fröskalet blandning för gen prägling analys.

III. Bisulfite Sekvensering

1. Nödvändiga reagens

Cetyltrimethyl ammonium bromid (CTAB) för att förbereda genomisk DNA, restriktionsenzymer, 3 M NaOH (Nylagade), 6,42 M urea / 4 M natrium bisulfite (2 M natriumhydroxidlösning metabisulfite, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Molecular Vikt: 190), 10 mM hydrokinon, ett DNA-rening kit (Promega Wizard DNA Clean-up system, Cat. # A7280), TE buffert, 6,3 M NaOH (nybakade), 10 M NH ₄ Oac, 20 mikrogram / ​​mikroliter tRNA, och 100% etanol .

2. Detaljer om bisulfite behandlingsprotokoll

1. Isolera genomiska frövitan eller embryo DNA med en CTAB förfarande (Rogers och Bendich, 1988).
2. Digest 100 ng - 2 mikrogram av DNA i 20 mikroliter till 100 mikroliter totala volymen med restriktionsenzymer som skär utanför regionen som skall analyseras. För MEA arrangören använder vi XhoI, NdeI och PstI eller HindIII.
3. Denaturera restriktionsenzym genom kokning av DNA i fem minuter och sedan släcka på is.
4. Tillsätt 1 / 9 Volym (2,2 mikroliter till 20 mikroliter smält DNA) 3 M NaOH och inkubera vid 37 ° C i 15 minuter.
5. Överför lösningen till en 250 mikroliter PCR-rör.
6. Lös 7,5 g urea i 10 ml sterilt destillerat vatten, Tillsätt långsamt 7,6 g natrium metabisulfite under 1-2 timmar och värme brukar hjälpa lösa, justera pH till 5 med nybakade 10 M NaOH, Tillsätt sterilt destillerat vatten till en slutlig volymen till 20 ml. Detta är 6,24 M urea / 4 M natrium bisulfite lösning.
7. Tillsätt 6,24 M urea / 4 M natrium bisulfite lösning till en slutlig koncentration av 5,36 M och 3,44 M, respektive (Paulin et al., 1998). Till exempel lägga till 208 mikroliter av 6,42 M urea / 4 M natrium bisulfite lösning på ovanstående 22,2 mikroliter av denaturerad arvsmassans DNA (Xiao et al., 2003).
8. Lägg till 10 mm hydrokinon till DNA på en slutlig koncentration av 0,5 mM (12 mikroliter till 20 mikroliter matsmältningen).
9. Genomför bisulfite behandling i en PCR-maskin: 30 cykler på 55 ° C i 15 minuter och 95 ° C i 30 sekunder.
10. AVSALTA den bisulfite behandlade DNA med hjälp av guiden DNA Clean-Up System från Promega och följa upp det protokoll (Jacobsen et al., 2000).
11. Mäta den exakta volymen av TE återhämtat sig från den kolumn efter avsaltning och tillsätt 6,3 M NaOH till en slutlig koncentration av 0,3 M. Inkubera vid 37 ° C i 15 minuter.
12. Tillsätt 10 M NH ₄ Oac (pH 7,0) till en slutlig koncentration av 3 M, 2 mikroliter av 20 mikrogram / ​​mikroliter tRNA, och 3 volymer av 100% etanol och blanda. Centrifugera i 15 minuter vid 14.000 rpm.
13. Tvätta pelleten gång med 70% etanol, gör en kort centrifug, och ta bort extra etanol.
14. Torka pelleten i ett speedvac i 5-10 minuter och återsuspendera i 25 till 100 mikroliter TE buffert beroende på grundbeloppet av DNA. Natrium bisulfite-behandlade DNA är nu klar för PCR-analys.

3. PCR-amplifiering

1. Eftersom unmethylated cytosines omvandlas till uracil är det svårt att förstärka ett stort fragment med bisulfite-behandlade DNA som mall. Därför designar vi brukar primers att förstärka en produkt inte längre än 500 bp. Att sekvensera den 4-kb MEA promotor, utformade vi många uppsättningar av primers och förstärkta 14 överlappande fragment för att täcka hela regionen (Xiao et al., 2003).
2. Att sekvensera den översta delen, att utforma en framåt primer, I) välja en G (guanin)-rik region för att få en högre glödgning temperatur utan extra långa nukleotider i primers, ii) förändringar C (cytosin) till Y ( pyrimidin) på CG och sammanhang CNG och ändra återstående C till T (tymin). Vid utformning av en omvänd primer, I) välja en C-rika regionen, ii) förändringar G till R (purin) på CG och sammanhang CNG och ändra återstående G till A (adenin).
3. Att sekvensera ner till strand, i utformningen av en framåt primer, I) välja en C-rika regionen, ii) förändringar G till R på CG och sammanhang CNG och ändra återstående G till A. Vid utformning av en omvänd primer, I) välja en G-rika regionen, ii) förändringar C till Y (pyrimidin) på CG och sammanhang CNG och ändra återstående C till T.
4. Vi använder vanligtvis 1-2 mikroliter av natrium bisulfite-behandlade DNA som mall för varje PCR-amplifiering (Xiao et al., 2003). PCR-produkten måste analyseras med gelelektrofores för att bekräfta rätt storlek på fragment, så att gel renas och klonade in i TOPO TA kloningsvektor pCR2.1 (Invitrogen) som en insats. En enda koloni plockas upp och odlade, plasmid DNA och skickas för sekvensering.

4. Sekvensanalys

Principen om bisulfite sekvensering är att unmethylated cytosin kommer att konverteras till uracil grund hydrolytisk deaminering med hög koncentration av natrium bisulfite på pH5.0 som kommer att förstärkas som tymin i PCR-produkt, medan 5-metyl cytosin inte kommer att ändras av natrium bisulfite och återstår att cytosin efter PCR-amplifiering (Clark et al, 1994;. Frommer et al, 1992.). Efter att ha fått sekvensering resultat, jämför vi den med strand-specifik mall som används för PCR-amplifiering. Om en cytosin rester i mallen lyder som en tymin i sekvensering resultatet, betyder det att cytosin inte är denaturerad. Om en cytosin rester i mallen förblir en cytosin i sekvensering, betyder det att cytosin är denaturerad.

IV. Representativa resultat

Figur 1.

Discussion

Det är relativt lätt att separera embryo från frövita och utsäde päls, men det är jobbigt att separera frövita från fröskalet, särskilt för utsäde i början eller mitten av torped stadium av fosterutvecklingen. Eftersom fröskalet bara bidrar med en mycket liten mängd vävnad för vissa gener, t ex, MEA och FWA, har vi inte att skilja frövita från frö päls. Det innebär att vi kan isolera RNA från en blandning av frövita och utsäde vävnader päls, kontrollera uttrycket av moderns och faderns alleler av en gen, jämför med uttryck i embryot, och bestämma imprinting status av genen.

För bisulfite sekvensering, den designade primers behöver Strand-specifika. Ibland är det svårt att förstärka ett fragment från bisulfite behandlade genomiska DNA på grund av skadade DNA-mallen genom att natrium bisulfite behandling, och vi brukar prova olika uppsättningar av PCR i olika regioner och kortare fragment. Efter restriktionsenzymanalys matsmältningen behöver arvsmassans DNA vara fullständigt denaturerad i enkelsträngat sedan bisulfite deaminering nästan inte fungerar på cytosin rester i dubbelsträngat DNA strukturer. En annan viktig är att bisulfite behandlingen måste vara fullständig. Om en känd unmethylated cytosin inte omvandlas till tymin i bisulfite sekvensering, betyder det att bisulfite behandlingen inte sker på rätt sätt. Alternativt, om många cytosin rester i ett okänt område inte ändras till tymin i bisulfite sekvensering, är det sannolikt på att förstärkningen av oomvända DNA snarare än tecken på alla metylerade cytosin rester i regionen.

Sodium bisulfite sekvensering kan exakt avslöja om en viss cytosin restprodukt denaturerad eller inte i en genomet om experimentet utförs på rätt sätt (Henderson et al., 2010). Kombinera natrium bisulfite sekvensering med de senaste hög genomströmning sekvensering tekniker, såsom Illumina Genome Analyzer hög genomströmning sekvensering plattform kan en karta epigenomet på singel-basen upplösning i växter och däggdjur (Cokus et al, 2008;. Hsieh et al . 2009; Lister et al, 2008;. Lister et al, 2009)..

Materials

Supplies Dissecting Microscope Scissors Fine Tip Forceps Jewelry Tag Plant Stakes String or Twist-Ties 4" X 2" X 8" Polyethylene Bags 3" X 1" X 1.0 mm Microscope Slides Liquid Nitrogen Liquid Nitrogen Containers Heat Block PCR Tubes Thermocycler Microcentrifuge Tubes Microcentrifuge Gel Electrophoresis facility Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants Reagents 70% Ethanol 95% Ethanol 100% Ethanol 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7 Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) 100% Ethanol Cholorform Restriction Enzymes 3 M NaOH 6.3 M NaOH 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite Sterile distilled H2O 10 mM Hydroquinone Wizard DNA Clean-Up System (Promega) 10 M NH4OAc 20 μg/ μL tRNA TE buffer The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)